十精丸對光老化大鼠皮膚LCs及炎癥因子水平影響的研究

孫在崢 曹惠妍 馬偉 陳麗娟

[摘要]目的：探討十精丸對于光老化大鼠皮膚朗格漢斯細胞（Langerhans cell，LCs）及體內炎癥因子水平的影響。方法：SD大鼠，雌性50只，隨機分為模型組、陽性對照組、十精丸低劑量組、十精丸中劑量組、十精丸高劑量組，每組10只。建立皮膚光老化模型，同時給予十精丸干預治療。實驗結束后，通過免疫組化法對大鼠皮膚LCs數量及形態進行觀察，病理切片觀察皮膚炎性浸潤程度，ELISA方法檢測皮膚組織和血清中白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。結果：免疫組化結果顯示，與模型組相比，十精丸各劑量組表皮LCs細胞數目均有所增加，胞體形態改善，樹突結構形成增多，細胞間連接緊密。其中十精丸高劑量組改善效果較為顯著。病理切片結果顯示，十精丸各劑量組大鼠皮膚炎性細胞浸潤程度有所改善，十精丸高劑量組改善程度較為明顯。ELISA檢測結果顯示，十精丸各劑量組皮膚組織勻漿及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α含量均有所下降。其中十精丸中、高劑量組下降明顯，差異有統計學意義（P＜0.01），與陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：十精丸能增加光老化大鼠皮膚組織中LCs細胞數量，改善LCs細胞異常形態，減輕大鼠皮膚組織的炎性細胞浸潤程度，降低大鼠皮膚組織及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α的含量，表明十精丸能提高皮膚免疫功能，抑制炎癥因子，從而修復皮膚功能，改善皮膚衰老狀態。

[關鍵詞]十精丸；皮膚免疫；光老化；朗格漢斯細胞；炎癥因子

[中圖分類號]R285.5? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2024）02-0051-05

Study on the Effect of Shijingwan on LCs and Inflammatory Factors

in Photoaging Rats

SUN Zaizheng1，CAO Huiyan2，MA Wei2，CHEN Lijuan3

（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150006，Heilongjiang，China; 2.College of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China; 3.Jiamusi College of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Jiamusi 154000，Heilongjiang，China）

Abstract： Objective? To investigate the effects of Shijingwan on the levels of skin Langerhans cells （LCs） and inflammatory cytokines in photoaged rats. Methods? 50 female SD rats were randomly divided into model group， positive control group， Shijingwan low-dose group， Shijingwan medium-dose group and Shijingwan high-dose group， with 10 rats in each group. The skin photoaging model was established， and Shijingwan were given for intervention. After the experiment， the amount and morphology of LCs in the skin of rats were observed by immunohistochemistry， the degree of inflammatory infiltration was observed by pathological sections， and the contents of Interleukin-6 （IL-6） and Tumor necrosis factor-α（TNF-α） in the skin tissue and serum were detected by ELISA. Results? Immunohistochemical results showed that， compared with model group， the number of epidermal LCs cells in each dose group of Shijingwan increased， the morphology of cell bodies improved， the formation of dendritic structure increased， and the connections between cells were tight. The improvement effect of Shijingwan high dose group was more significant. Pathological section results showed that the degree of skin inflammatory cell infiltration was improved in each dose group of Shijingwan， and the degree of improvement was more obvious in the high dose group of Shijingwan. ELISA results showed that the contents of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α in skin homogenate and serum of Shijingwan were decreased in each dose group. There was significant decrease in the medium and high dose groups of Shijingwan， with statistical significance （P＜0.01）， but no significant difference compared with positive control group （P＞0.05）. Conclusion? Shijingwan can increase the number of LCs cells in the skin tissue of photoaging rats， improve the abnormal morphology of LCs cells， reduce the degree of inflammatory cell infiltration in the skin tissue of rats， and reduce the contents of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in the skin tissue and serum of rats， indicating that Shijingwan can improve the skin immune function， inhibit inflammatory factors， and repair the skin function. Improve skin aging.

Key words： Shijingwan; skin immunity; photoaging; langerhans cells; inflammatory cytokines

皮膚是人體防御疾病的第一道屏障，也是人體美的重要載體。皮膚的老化不但影響外貌的美觀，而且會增加皮膚疾病產生的概率。皮膚老化一般可分為內源性老化和外源性老化兩種。皮膚光老化是外源性老化中最常見的類型，主要由紫外線過多照射引起，表現為皮膚干燥、松弛、皺紋、色素增加或脫失以及毛細血管擴張等，嚴重者導致皮膚表面隆起、開放性粉刺、光化性紫癜及表皮真皮增厚等表現[1]。因此尋找有效防治皮膚光老化的方法與手段，也是該領域研究的重點與難點。隨著現代醫學發展，中藥用于抗光老化的研究取得了一定進展。近年來，有關中醫藥通過清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制炎癥反應、調節免疫、修復膠原等方面防治皮膚光老化的研究越來越多，但其深入機制和復方成分的研究仍然尚少?，F代醫學與中醫學理論相結合，發揮中藥的獨特作用是未來研究的重要方向[2]。

十精丸出自明代《普濟方》，為駐顏防衰、延年益壽的經典方，由枸杞、熟地、山茱萸、肉蓯蓉、菟絲子等十味藥物組成。從組方上看，有陰陽并補、補而不膩的特點，從功用上看，有滋腎填精，補氣養元，駐顏防衰之功。前期實驗結果表明十精丸具有提高超氧化歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平，增加皮膚羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量以改善皮膚光老化的效果。本實驗基于光老化的免疫抑制與炎癥反應機制，探討十精丸對大鼠光老化皮膚細胞免疫功能及炎癥因子水平的影響，進一步豐富十精丸延衰駐顏理論的論證體系，對皮膚美容醫學理論研究以及促進《普濟方》中補虛延衰類中藥復方的研發都具有積極的意義。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：雌性SD大鼠50只，月齡14～16個月，體重（450±100）g，購自哈爾濱醫科大學實驗動物學部，許可證號：SCXK（黑）2019-001。所有大鼠適應性飼養7 d，自由進食和飲水，飼養環境溫度23℃～26℃，濕度20%～30%，保持飼料及飲水潔凈充沛。所有實驗程序和實驗動物使用均符合黑龍江中醫藥大學實驗動物倫理規定。

1.2 藥物和試劑

1.2.1 藥物：十精丸各劑量組包括枸杞、熟地、山茱萸、菟絲子、肉蓯蓉等十味中藥飲片，購自黑龍江中醫藥大學佳木斯學院附屬醫院中藥局。陽性對照組包括維生素E軟膠囊（大連水產藥業有限公司，批號：國藥準字H21021557）。

1.2.2 試劑：大鼠白介素6（IL-6）、大鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯免疫吸附測定試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，生產批號20230323）、大鼠CD1a多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號20230320），蘇木素伊紅染色液、乙醚、無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、二甲苯、4%中性甲醛、生理鹽水、PBS緩釋液、酸性乙醇分化液、檸檬酸鹽溶液、去離子H2O2溶液、DAB顯色劑、脫毛膏均為市售試劑。

1.3 主要實驗儀器：SS-03AB型紫外線光療儀（上海Sigma公司）；紫外線輻照計（北京師范大學光電儀器廠）；TGL-16G-C高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；酶標儀Thermo Fisher Scientific Oy（美國賽默飛）；DY89-I電動玻璃勻漿機（上海民儀電子有限公司）；Resecarch UVUF型超純水制備系統（上海和泰儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 分組與造模

1.4.1.1 分組：實驗動物適應性飼養7 d，隨機分為5組，每組10只，即模型組、陽性對照組、十精丸低劑量組、十精丸中劑量組、十精丸高劑量組。

1.4.1.2 造模：以老齡大鼠結合紫外線照射誘導皮膚光老化模型，造模方式參考文獻[3]。各組大鼠背部進行脫毛處理，剃毛區域面積大約為5 cm×5 cm。以自制固定器固定于光療儀（UVA+UVB）下約40 cm處。每次照射劑量UVA約為29 J/cm2，UVB約為64 mJ/cm2，每次照射時間2 h，時間持續4周。造模過程中若出現皮膚水皰、潰爛情況，立即停止照射，待2～3 d皮損癥狀緩解后，再繼續進行照射。照射后，大鼠出現皮膚進行性彈性喪失、皺紋增粗加深，伴有脫屑等光老化表現，病理檢查示表皮結構不完整，真皮組織排列紊亂、分布不均勻為造模成功。

1.4.2 藥物制備及用藥：按十精丸原方藥物組成及藥量（十味各等分，共200 g），精選道地藥材，去除雜質，制備水煎液。經過濃縮后，分別得到所含生藥濃度為1.0 g/ml的十精丸低劑量組藥液，生藥濃度為2.0 g/ml的中劑量組藥液，生藥濃度為4.0 g/ml的高劑量組藥液。置于4℃冰箱保存，使用前水浴加熱至30℃。每日光照結束后，根據人與大鼠用藥劑量換算，十精丸各劑量組灌胃給藥，時間為4周。同時陽性對照組及模型組分別給予同等容積的維生素E溶液及0.9%生理鹽水灌胃。

1.4.3 標本采集與制備

1.4.3.1 血清樣本制備：最后一次灌胃結束后，大鼠禁食不禁水12 h，乙醚吸入麻醉后，腹主動脈采血4～5 ml，靜置1 h，于4℃離心機內，3 500 r/min，離心15 min，取上清液，于-80℃保存待檢。

1.4.3.2 皮膚組織勻漿制備：于大鼠背部區域剪取1 cm×1 cm面積皮膚組織，預冷生理鹽水中漂洗3次，以濾紙拭干水分后，用眼科剪剪碎組織，置于勻漿管中，以樣本質量︰稀釋液體積為1∶9的比例加入預冷PBS緩釋液。放入勻漿機中經充分勻漿后，將勻漿液以2 000 r/min的速率，低溫離心15 min，取上清液待檢。

1.4.3.3 皮膚病理切片制備：背部脫毛區域剪取約1 cm×1 cm大小的皮膚組織，去除脂肪與結締組織，預冷生理鹽水沖洗3次，以4%中性甲醛溶液固定保存。經酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片（5μm）。

1.5 檢測指標

1.5.1 LCs數量及形態觀察：將大鼠皮膚組織切片經脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、展片、烤片、二甲苯和乙醇脫蠟至水，蒸餾水、PBS各漂洗3次（3 min/次），滴加去離子H2O2，室溫孵育20 min，PBS漂洗后進行微波修復，PBS漂洗，滴加大鼠CD1a多克隆抗體，室溫孵育2 h，PBS漂洗，滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS漂洗，滴加DAB顯色劑顯色，蒸餾水徹底沖洗終止反應，蘇木素復染細胞核，乙醇和二甲苯脫水并透明，中性樹膠封片后，光鏡下觀察并采集分析圖片，觀察LCs數量及形態變化。

1.5.2 皮膚組織炎性浸潤程度觀察：將大鼠皮膚組織切片經蘇木素-伊紅染色，光鏡下觀察炎細胞增殖及浸潤程度。

1.5.3 IL-6、TNF-α含量檢測：根據ELISA試劑盒說明書，按照指示在酶標儀上進行操作，分別對大鼠皮膚組織勻漿及血清IL-6、TNF-α含量進行檢測。

1.6 細胞計數：光鏡下對CD1a陽性LCs進行計數，陽性結果判斷標準為：①細胞位于表皮層。②細胞膜和（或）細胞漿有棕黃色顆粒著色。在高倍顯微鏡10×20下隨機選取5～10個不連續的視野，人工計數每個視野內陽性細胞的數量，每個標本陽性細胞數=（視野1陽性細胞數+視野2陽性細胞數+……+視野N陽性細胞數）/N，其中N為所選取的視野數。

1.7 統計學分析：實驗數據采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以（xˉ±s）的形式表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 LCs數量及形態觀察：結果顯示，模型組LCs在表皮及真皮中呈散在性分布，表皮LCs數量少，胞體形態不規則，可見部分胞體萎縮，缺乏樹突結構形成，與角質細胞之間的連接松散。與模型組相比，十精丸各劑量組表皮LCs數量均有所增加，胞體異常形態有改善。其中，十精丸高劑量組表皮LCs數量顯著增加，胞體形態較為規則，樹突結構形成增加，細胞之間連接較為緊密。十精丸高劑量組LCs數量高于模型組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；而與陽性對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

2.2 大鼠皮膚組織病理學觀察：結果顯示，模型組皮膚組織中有大量炎性細胞浸潤，皮膚組織表皮厚薄不均，腺體增生較明顯。十精丸各劑量組表皮厚薄較為均勻，腺體增生及炎性細胞浸潤程度較模型組相比有所減輕；其中十精丸高劑量組與模型組相比，浸潤的炎性細胞數量明顯減少，炎性浸潤程度有顯著改善，腺體增生不明顯，差異明顯。與陽性對照組無明顯差異。見圖2。

2.3 IL-6、TNF-α含量的影響

2.3.1 大鼠皮膚組織勻漿中IL-6、TNF-α含量的影響：結果顯示，與模型組相比，十精丸各劑量組皮膚組織勻漿中炎性因子IL-6、TNF-α含量均有所下降，其中十精丸中、高劑量組下降明顯；有統計學意義（P＜0.01）。十精丸中、高劑量組與陽性對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3.2 大鼠血清中IL-6、TNF-α含量的影響：結果顯示，與模型組相比，十精丸各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均有所下降，其中十精丸中、高劑量組下降程度明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。十精丸中、高劑量組與陽性對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

3? 討論

免疫抑制與炎癥反應是紫外線致使皮膚光老化產生的機制之一。根據文獻報道，紫外線通過抑制朗格漢斯細胞（LCs）、樹突狀細胞的免疫功能，改變體液免疫細胞因子的水平，從而對皮膚免疫系統造成抑制，引起皮膚組織中金屬基質蛋白酶（Metallomatrix proteinase，MMP）的表達增加，抑制膠原的合成，進而造成光老化的特征性改變[4]。LCs是皮膚免疫系統的重要組成部分，位于與外界環境接觸的表皮層。LCs可以通過變形蟲樣運動在角質形成細胞中穿行，具有遷徙至淋巴結并啟動免疫反應的能力。文獻表明，LCs會隨著皮膚老化出現數量水平的減少，并且其向淋巴結遷徙的能力也會下降[5]。另外，研究認為不同波長的紫外線均可對LCs的數量及形態狀況造成影響，中波紫外線（UVB）對LCs的影響表現在表皮LCs數量減少或消失、LCs抗原呈遞功能以及活化T細胞作用受到影響等方面。長波紫外線（UVA）可以導致表皮LCs數量減少，降低其抗原抗原呈遞功能，引起胞膜免疫共刺激分子表達水平降低等[6]。在形態上，光老化皮膚中的LCs常呈現出胞體較小、樹突結構短且分支少的表現[7]。綜上，表皮中LCs的細胞數量、形態結構狀況可以看做是表征皮膚免疫狀態的重要指標[8]。

炎癥因子在皮膚光老化的炎癥機制中起著重要作用。在受到紫外線刺激時，角質細胞分泌的炎癥因子水平上升，從而引起炎性細胞浸潤、促進皮膚炎癥反應產生。IL-6能誘導MMP合成增加，促進細胞外基質的降解。TNF-α是炎癥反應中最重要的炎癥因子，具有激活免疫細胞，并促進其他炎癥因子釋放的作用[9]。受到紫外線照射以及機體的免疫功能水平下降時，皮膚中IL-1、IL-6、IL-7、TNF-α等促炎因子的水平出現升高現象[10]。炎癥因子水平的增加對皮膚免疫系統也有一定的影響[11]。研究認為，TNF-α、IL-1β等炎癥因子的過度釋放，一定程度上促進了表皮LCs的遷移，減少了表皮LCs數量，是影響皮膚免疫功能的重要因素[12]。由此，皮膚免疫抑制與炎癥反應之間存在著機制上的聯系。因此，改善皮膚免疫細胞功能、抑制炎癥因子的分泌可以看作是防治皮膚光老化的重要手段。

中醫學認為，腎為一身之本，腎中精氣的盛衰主宰人體的生命活動過程?！端貑枴ど瞎盘煺嬲撈吩唬骸芭悠邭q，腎氣盛，齒更發長……五七，陽明脈衰，面始焦，發始墮”，提示腎中精氣是機體生長發育的基礎。隨著年齡增長，腎中精氣逐漸衰少，皮膚就會表現出面容憔悴、皺紋叢生的老化現象[13]。衛氣是人體中行于脈外，具有防御保護作用的氣?！秲冉洝れ`樞·本臟》中指出：“衛氣者，所以溫分肉，充肌膚，肥腠理，司開闔者也”。衛氣能充養肌膚、防御外邪，與西醫學中免疫系統的作用相一致。衛氣的生成受到腎氣的調控，《靈樞·邪客》有“地有泉脈，人有衛氣”，取類比象，用泉脈以喻水出地下，衛出下焦腎，也是對衛氣的生成和腎關系密切的理論佐證。因此，腎的活動與機體的免疫功能的盛衰聯系密切。所以，通過補腎來調節皮膚免疫功能、延緩皮膚衰老具有一定的理論依據。

十精丸方中以補腎藥居多，其中熟地黃、枸杞子補肝益腎、滋陰養血，山茱萸、肉蓯蓉和菟絲子補益肝腎、溫中壯陽、收澀固脫，有陰陽并補兼以收澀之功。全方合用，可共奏補腎養心、駐顏防衰之效[14]?，F代藥理研究認為，地黃的藥理作用全面，有止血、抗感染、抗高血壓、免疫增強、抗炎的作用[15]。枸杞多糖能增強機體免疫力，增強T淋巴細胞和B淋巴細胞的免疫功能[16]。山茱萸多糖有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化和清除自由基的作用[17]。菟絲子能調節免疫、調節生殖內分泌、營養神經、抗氧化及衰老[18]。肉蓯蓉多糖有調節免疫活性、抗衰老、改善學習記憶障礙的功能[19]。前期實驗結果表明，十精丸可以增強老齡大鼠SOD活力、降低機體MDA含量，提高機體抗氧化能力、加速自由基清除，對皮膚光老化有一定改善作用[20]。十精丸的含藥血清可以降低MMP-1并提高基質金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的表達，拮抗紫外線對成纖維細胞的損傷[21]。

綜述所述，十精丸可以提高光老化皮膚中的LCs數量水平，并改善LCs細胞異常形態。并且十精丸對于皮膚組織及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α的含量水平也具有一定的降低作用。表明十精丸能夠調節皮膚免疫功能，減少炎癥因子釋放，抑制炎癥反應，改善皮膚衰老狀態。此結論為進一步論證十精丸補腎益氣、延衰駐顏的功效提供了實驗依據。

[參考文獻]

[1]王小燕，劉子菁，馬仁燕，等.皮膚光老化研究新進展[J].中國麻風皮膚病雜志，2019，35（5）：305-308，312.

[2]劉陶，劉洋，夏慶梅，等.中藥及其復方抗皮膚光老化的機制及應用研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2019，25（13）：224-230.

[3]陳麗娟，徐姣，谷建梅，等.十精丸中菊花、枸杞養肝藥對組合抗皮膚光老化作用的研究[J].中國美容醫學，2015，24（7）：37-40.

[4]曾麗，胡晗菲，謝紅炬，等.皮膚光老化的研究進展[J].中南醫學科學雜志，2015，43（2）：226-229.

[5]Chambers E S， Vukmanovic-Stejic M. Skin barrier immunity and ageing[J]. Immunology，2020，160（2）：116-125.

[6]丁小潔，李惠.紫外線輻射對表皮朗格漢斯細胞的影響[J].重慶醫學，2008，37（3）：323-325.

[7]Zegarska B，Pietkun K，Giemza-Kucharska P，et al.Changes of Langerhans cells during skin ageing[J].Postepy Dermatol Alergol，2017，34（3）：260-267.

[8]普詩奇.微針聯合康復新液對老化小鼠皮膚炎癥因子及朗格漢斯細胞影響的研究[D].大理：大理大學，2022.

[9]王明月，劉春艷，張宇，等.潞黨參對光老化小鼠皮膚中IL-6、TNF-α、IL-15含量及IL-15、IL-15R共表達的影響[J].中華中醫藥學刊，2020，38（6）：143-146，271.

[10]Cho J L，Allanson M，Reeve V E.Hypoxia inducible factor-1α contributes to UV radiation-induced inflammation， epidermal hyperplasia and immunosuppression in mice[J].Photochem Photobiol Sci，2012，11（2）：309-317.

[11]吳斯敏，楊慧齡.紫外線引起皮膚光老化機制及防治的研究進展[J].醫學綜述，2018，24（2）：341-346.

[12]李航，王暉.朗格漢斯細胞在皮膚免疫學中的研究進展[J].中國皮膚性病學雜志，2014，28（3）：304-306.

[13]張翀，田黎明，周密思等.金水六君煎延緩皮膚老化機制探析[J].中華中醫藥雜志，2019，34（4）：1643-1645.

[14]陳麗娟，楊銳，王業秋，等.《普濟方》中美容補益經方十精丸的功效及現代藥理考略[J].中華中醫藥雜志，2017，32（3）：1226-1228.

[15]陳思琦，李佳欣，吳鑫宇，等.熟地黃的藥理學研究進展[J].化學工程師，2019，33（11）：46-50.

[16]趙明宇.枸杞子的藥理作用及臨床應用研究[J].北方藥學，2018，15（4）：156.

[17]張曉文，柳美娟，王珍珍，等.山茱萸多糖的提取分離及藥理活性研究進展[J].西北藥學雜志，2020，35（3）：470-475.

[18]王堯堯，王蕾，戚瑩雪等.菟絲子藥材化學成分研究進展[J].山東中醫藥大學學報，2020，44（6）：705-712.

[19]姚辛敏，周曉潔，周妍妍.肉蓯蓉化學成分及藥理作用研究進展[J].中醫藥學報，2021，49（2）：93-97.

[20]陳麗娟，王興炎，董興中，等.十精丸延緩大鼠皮膚衰老作用的實驗研究[J].中國美容醫學，2008，17（10）：1485-1487.

[21]陳麗娟，王加志，李偉，等.十精丸含藥血清對光老化ESF-1細胞分泌MMP-1、TIMP-1的影響[J].中華中醫藥雜志，2015，30（8）：2920-2922.

[收稿日期]2023-05-23

本文引用格式：孫在崢，曹惠妍，馬偉，等.十精丸對光老化大鼠皮膚LCs及炎癥因子水平影響的研究[J].中國美容醫學，2024，33（2）：51-55.