研究型分析化學綜合實驗教學模式探究
——以“海藻酸鹽微膠囊的制備、藥物包封及緩控釋分析實驗”為例

胡國梁，顏鑫灝，陳睿希，劉紅瑜1,,＊，姚奇志1,，李嬌1,，李玲玲1,

1 化學國家級實驗教學示范中心(中國科學技術大學)，合肥 230026

2 中國科學技術大學化學與材料科學學院，合肥 230026

中國科學技術大學分析化學實驗課程分I型、II型二種類型。I型實驗是以基本操作、基本技能和基本方法的驗證性實驗訓練為主，以綜合實驗、設計實驗為輔。II型分析化學實驗是以綜合型實驗為主導的實驗模式，是在I型實驗的基礎上，培養學生的科研能力和創新意識?！昂Ｔ逅猁}微膠囊的制備、藥物包封及緩控釋分析實驗”是II型分析化學實驗中非常典型的一個研究型實驗，實驗教學中涵蓋了微膠囊形成原理探究、實驗條件設計、微膠囊性能表征等科研基本能力的訓練[1–5]。對于提升學生綜合實驗能力有非常好的幫助。

微膠囊是利用天然或合成高分子材料，將分散的物質包裹起來，形成具有特定幾何結構的微型容器，直徑一般為1–1000 μm。由于微膠囊化可以使芯材與外界隔離，保持物理性質(如顏色、溶解性等)，提高穩定性，具有物質控釋性、釋放靶向性、生物相容性及可降解性等特點，該技術的應用已經涵蓋化工、食品、藥物、生物制品、醫學等諸多領域。海藻酸鈉由于與其他物質能夠形成良好吸附性能的凝膠而廣受關注，由于其吸附性，在制備藥物微膠囊中也有十分重要的作用。海藻酸鈉無毒無害，擁有腸溶性，能將藥物送入腸道并吸收，并能起到緩釋作用，延長藥物作用時間，并將藥物濃度控制在一定范圍內?？梢岳煤Ｔ逅猁}制備微膠囊，對藥物具有較好的緩釋效果[6,7]。

1 方法原理

當海藻酸鈉遇見二價陽離子或聚陽離子時，會發生離子轉移，形成既具有強度性能又具有彈性的凝膠(一種介于固態和液態之間的狀態)，由此制得海藻酸鹽微膠囊。

在靜電力作用下，海藻酸鈉溶液通過注射劑擠出針尖，在針尖處形成球狀液面，液面在注射器推動下增長，依次形成月牙形液面、倒錐形液面和細絲狀液柱，在靜電作用下崩解形成小液滴，當液柱的重力(Fg)、注射器推動力(Fp)和靜電力(Fe)之和大于表面張力時，液柱崩解。海藻酸鈉液柱崩解后在自身表面張力作用下變成直徑為d的球形，進入含凝膠化鹽氯化鈣溶液中，生成海藻酸鈣凝膠微球。

2 試劑與儀器

2.1 主要試劑

海藻酸鈉、殼聚糖、亞甲基藍(MB)、冰乙酸、氯化鈣、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，所有試劑均為分析純。

2.2 主要儀器

注射器、移液槍、集熱式磁力攪拌器(德國IKA)、pHS-3C酸度計(儀電科學儀器股份有限公司)、美譜達P4分光光度計(上海美譜達)。

3 實驗步驟

3.1 微膠囊的制備

① 海藻酸鈉-Ca2+微膠囊的制備：先采用注射器將一定濃度的海藻酸鈉溶液(10 mL)注射到3%(海藻酸鈉質量對水體積的百分比)濃度的氯化鈣溶液(10 mL)中，攪拌數分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球。

② 海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊的制備：同3.1 ①，但將氯化鈣換為1% (殼聚糖質量對水體積的百分比)殼聚糖。

3.2 緩釋實驗

選擇亞甲基藍模擬小分子藥物作為緩釋研究對象。具體方法如下：

① 海藻酸鈉-Ca2+微膠囊做緩釋研究：將0.5 mg·mL?1MB加到10 mL一定濃度的海藻酸鈉溶液中，然后注射到一定濃度的氯化鈣溶液(10 mL)中，攪拌數分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球。過濾，然后測定濾液中MB含量。再將等量的Alg-Ca2+微膠囊放入一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中，以后每隔15 min測定MB的含量，做緩釋曲線。

② 海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊做緩釋研究：同3.2 ①，但將氯化鈣換為1%殼聚糖。同樣做緩釋實驗，做緩釋曲線。

4 第一節課實驗記錄

4.1 海藻酸鈉-CaCl2體系

取海藻酸鈉溶液和氯化鈣溶液各10 mL，制備微膠囊后濾液吸光度：1.354，溶液中亞甲基藍吸光度隨時間的變化數據見表1。

表1 海藻酸鈉-CaCl2體系吸光度和時間關系(以0時刻作為參比)

4.2 海藻酸鈉-殼聚糖體系

取海藻酸鈉溶液和殼聚糖溶液各10 mL，制備微膠囊后濾液吸光度：0.897，溶液中亞甲基藍吸光度隨時間的變化數據見表2。

表2 海藻酸鈉-殼聚糖體系吸光度和時間關系(以去離子水作為參比)

5 數據處理和結果分析

5.1 數據處理

海藻酸鈉-CaCl2體系，亞甲基藍吸光度隨時間的變化如圖1所示。海藻酸鈉-殼聚糖體系，吸光度隨時間的變化如圖2所示。

圖1 海藻酸鈉-CaCl2體系吸光度–時間關系圖

圖2 海藻酸鈉-殼聚糖體系吸光度–時間關系圖

5.2 結果分析與總結

對比兩種體系，最終可以得出海藻酸鈉-殼聚糖體系的緩釋效果更好。海藻酸鈣-CaCl2體系在開始時釋放速度較快，在1 h左右時釋放較為完全；而海藻酸鈉-殼聚糖體系釋放速度較慢，對藥物有很好的緩釋效果。

但CaCl2體系制備出的微膠囊結構性能較好，易過濾，且不發生破裂，膠囊穩定性較強。而殼聚糖體系制備出的微膠囊較軟，易破損。

對兩種體系的包埋率進行對比，由于海藻酸鈉-殼聚糖體系的濾液吸光度較小，故其包埋率較高，對藥物的包埋效果更好。

6 第二節課研究型實驗設計及實施

6.1 實驗思路

考慮到兩種不同體系制備出的微膠囊各有優點，因此，綜合性實驗考慮進行多元體系的制備，以制備出緩釋性能和穩定性能均良好的微膠囊。

經過查閱文獻，最終決定以一步法和兩步法對微膠囊進行制備[6]，并對兩個方法所制備出來的微膠囊進行對比，得出優缺點。同時，文獻中提到采用葡萄糖作為增塑劑可以提高微膠囊穩定性[2]，其效果可能與CaCl2所起到的作用相似，在此進行驗證。

6.2 實驗方案

6.2.1 一步法制備微膠囊

配制殼聚糖-CaCl2混合溶液，將0.5 mg·mL?1MB加到10 mL一定濃度的海藻酸鈉溶液中，然后注射到一定濃度的混合溶液(15 mL)中，攪拌數分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球。過濾，然后測定濾液中MB含量。再將等量的微膠囊放入一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中，以后每隔15 min測定MB的含量，做緩釋曲線。

6.2.2 兩步法制備微膠囊

將0.5 mg·mL?1MB加到10 mL一定濃度的海藻酸鈉溶液中，然后注射到一定濃度的CaCl2溶液(15 mL)中，攪拌數分鐘，使海藻酸鈉液滴鈣化成球。過濾，然后測定濾液中MB含量。再將等量的海藻酸鈉-Ca2+微膠囊放入一定濃度的殼聚糖溶液(15 mL)中，攪拌數分鐘，過濾。將等量的微膠囊放入一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中，以后每隔15 min測定MB的含量，做緩釋曲線。對比組則先放入殼聚糖溶液中，再放入氯化鈣溶液中，其余步驟均相同。

6.2.3 探究葡萄糖對海藻酸鈉-殼聚糖體系微膠囊制備的影響

將0.5 mg·mL?1MB加到10 mL一定濃度的海藻酸鈉溶液中，然后注射到一定濃度的殼聚糖溶液(15 mL)中，攪拌數分鐘，使海藻酸鈉液滴成球。過濾，然后測定濾液中MB含量。再將等量的微膠囊放入6%葡萄糖溶液(15 mL)中，攪拌數分鐘，過濾。將等量的微膠囊放入一定體積的Tris-HCl緩沖溶液中，以后每隔15 min測定MB的含量，做緩釋曲線。

6.3 實驗結果和分析

6.3.1 一步法制備微膠囊

制備微膠囊后濾液吸光度：1.047，溶液體積：13.0 mL。

此時包埋率：

由于理論上該體系藥物釋放符合零級動力學，故用單位時間釋放的藥物量作為釋放效率，在這里用吸光度代替藥物量。

釋放效率：

吸光度與時間關系見表3，圖像見圖3，圖4為一步法制得的微膠囊的照片。

圖3 一步法體系吸光度-時間關系圖

圖4 一步法體系微膠囊形貌圖

表3 一步法制備微膠囊體系吸光度和時間關系(以去離子水作為參比)

結果分析：計算得到的包埋率較高，包埋效果良好。從圖4可以看出，微膠囊的形貌較好，穩定性較高，且易分離。與海藻酸鈉-CaCl2二元體系相比，緩釋效果明顯提高；與海藻酸鈉-殼聚糖二元體系相比，微膠囊的穩定性增強。即一步法將兩種體系的優點結合起來，所制備出來的微膠囊穩定性和緩釋性均良好，具有很高的應用價值。

6.3.2 兩步法制備微膠囊

1) 先加入至CaCl2溶液，后加入至殼聚糖溶液。

制備微膠囊后濾液吸光度及溶液體積分別為：0.585、8 mL；0.764、10 mL。

包埋率：

釋放效率

吸光度與時間關系見表4，圖像見圖5，圖6為該方法制得的微膠囊的照片。

圖5 兩步法體系(先加至CaCl2溶液后加至殼聚糖溶液)吸光度–時間關系圖

圖6 兩步法體系(先加至CaCl2溶液后加至殼聚糖溶液)微膠囊形貌圖

表4 兩步法制備微膠囊體系(先加至CaCl2溶液后加至殼聚糖溶液)吸光度和時間關系(以去離子水作為參比)

2) 先加入至殼聚糖溶液，后加入至CaCl2溶液。

吸光度與時間關系見表5，圖像見圖7，圖8為該方法制得的微膠囊的照片。

圖7 兩步法體系(先加至殼聚糖溶液后加至CaCl2溶液)吸光度–時間關系圖

圖8 兩步法體系(先加至殼聚糖溶液后加至CaCl2溶液)微膠囊形貌圖

表5 兩步法制備微膠囊體系(先加至殼聚糖溶液后加至CaCl2溶液)吸光度和時間關系(以去離子水作為參比)

結果分析：對比兩步法制備的兩種微膠囊，可得出溶液的順序會對微膠囊的緩釋性能產生較大的影響。兩種順序制備的微膠囊穩定性均較強，但緩釋性有所區別，按照CaCl2-殼聚糖順序制備出來的微膠囊緩釋性較好，在接近100 min時緩釋曲線才趨于平緩?？赡苁怯捎贑aCl2-殼聚糖體系中海藻酸鈉液滴先鈣化成球，殼聚糖包裹在求外，起到很好的緩釋效果。

6.3.3 探究葡萄糖對海藻酸鈉-殼聚糖體系微膠囊制備的影響

本部分最初是打算采用兩步法制備微膠囊，但最后制備出來的微膠囊放入緩沖溶液中，溶液中出現葡萄糖晶體，對溶液吸光度測量產生較大影響(圖9)。

圖9 兩步法制備后溶液渾濁圖像

故采用一步法直接進行制備，一步法最后緩釋時溶液澄清，可以對吸光度進行測量，結果如下。

制備微膠囊后濾液吸光度：0.546，溶液體積：11.5 mL。

此時包埋率：

釋放效率

吸光度與時間關系見表6，圖像見圖10。圖11為該方法制得的微膠囊的照片。

圖10 海藻酸鈉-殼聚糖-葡萄糖體系吸光度-時間關系圖

圖11 海藻酸鈉-殼聚糖-葡萄糖體系微膠囊形貌圖

表6 海藻酸鈉-殼聚糖體系-葡萄糖體系吸光度和時間關系(以去離子水作為參比)

結果分析：加入葡萄糖后制得的微膠囊顏色為深藍色，與其余方法制備的微膠囊不同，這應該是葡萄糖的影響。在制備過程中，注意到該微膠囊與不加葡萄糖制得的殼聚糖微膠囊相比，外部覆蓋了一層白色的膜，它有效地遏制了微膠囊的粘連。但最終得到的微膠囊為橢球形，形貌不好。注意到該體系的包埋率較高，遠高于其他體系，這說明加入葡萄糖可有效提高包埋效果；而緩釋效果與采用CaCl2一步法相比較差。兩種體系各有優點，但考慮到微膠囊的形貌及穩定性，使用CaCl2溶液更好，制備得到的微膠囊更穩定。

7 實驗總結

(1) 本次實驗先對二元體系的微膠囊進行制備，發現海藻酸鈉-CaCl2體系制得的微膠囊穩定性較強，緩釋效果較差；海藻酸鈉-殼聚糖體系則相反。因此，在綜合實驗中，對多元體系進行探究，采用一步法和兩步法分別對微膠囊進行制備，同時還探究葡萄糖對海藻酸鈉-殼聚糖體系微膠囊制備的影響。經過對比，兩步法中按照CaCl2-殼聚糖順序制備得到的微膠囊性能最佳。一步法中將CaCl2換為葡萄糖后，包埋效果大大提高，但微膠囊的形貌結構以及緩釋效果并沒有太大改變。

(2) 對比三類微膠囊的釋放效果，發現兩步法制備出來的氯化鈣-殼聚糖微膠囊釋放速度最慢，葡萄糖-殼聚糖微膠囊釋放速度最快，一步法居中，這與緩釋效果一致?？梢钥紤]通過調控溶液的pH，以及在合成前對各組分含量進行調整，從而達到調控膠囊壁層厚度及孔隙大小來實現對釋放速度和釋放量的調控，得到效果最佳的微膠囊。

(3) 海藻酸鈉中有非常多羥基基團，能夠通過絡合作用與鈣離子進行絡合。在絡合后，海藻酸鈉由于電荷斥力會迅速分離。而通過多條海藻酸鈉鏈與多個鈣離子絡合，能夠形成交聯網狀結構的微球。而空隙則能夠吸附藥物分子。由于為固體顆粒，海藻酸鈣微球的機械強度較高，能夠形成尺寸均勻、彈性強的微珠，但由于其表面有許多空隙，緩釋效果較差，且對藥物的包埋率較低。

(4) 殼聚糖中含有許多胺基。在酸性條件下，胺基會與氫離子結合而帶有正電荷。而海藻酸有很多羥基。其中海藻酸鈉中氧原子帶負電荷。因此海藻酸鈉能夠與殼聚糖通過靜電作用進行結合。而兩者帶電荷強弱都與pH有關，殼聚糖的溶解也與酸度有關，因此pH對微膠囊的制備十分重要。由于是靜電作用結合，因此殼聚糖與海藻酸鈉形成的凝膠機械強度較低，很容易粘連。但具有非常好的緩釋效果。

(5) 結合二者的優點，在含藥物分子的海藻酸鈉與氯化鈣溶液混合時，會先形成具有交聯網狀結構的海藻酸鈣微球。將海藻酸鈣微球放入殼聚糖溶液后，由于海藻酸鈣微球表面會有海藻酸鈉伸出的羥基，能夠使殼聚糖在海藻酸鈣表面通過靜電作用形成一層膜，從而得到微膠囊。這樣得到的微膠囊不僅機械強度高，不易粘連，而且緩釋效果也大大提高了。

8 結語

該研究型實驗利用兩節實驗課完成(共16學時)，第一節課主要是通過實驗設計選擇最佳的微膠囊制備實驗條件，為第二節課繼續開展探究奠定基礎；第二節課學生首先匯報第一節課探究的實驗結果并進行分組討論，之后基于第一節課中發現的問題，進一步拓展實驗設計，提升微膠囊的緩釋性能。這種研究型教學方式讓學生完成了一次小型的科研體驗，既鍛煉了學生的溝通交流能力，又拓展了學生的實驗設計思路，還提升了學生的課堂參與積極性，充分增強了課堂教學效果。