基于TM2D1介導鐵死亡探討丙泊酚抑制結直腸癌的分子機制

路 艷, 樸宗方, 譚新敏, 蘇 銳

(承德醫學院附屬醫院本部麻醉科, 河北 承德 067000)

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是一種常見的胃腸道惡性腫瘤,具有高發病率和高死亡率的特點。結直腸癌的早期癥狀可能不明顯,但隨著腫瘤的進展,出現便血、腹瀉、排便習慣改變、局部腹痛、貧血等癥狀,嚴重影響患者的健康和生活質量[1]。為提高結直腸癌的治療效果,常采用化療、放療、手術切除聯合治療。常規治療通常伴隨著嚴重的副作用、毒性或化療耐藥[2]。因此,尋找對結直腸癌有效且具有良好毒性的新藥仍然是研究人員的首要任務。2,6-二異丙基苯酚(丙泊酚)不僅是臨床麻醉常用的靜脈麻醉劑,還被發現具有相當的非麻醉特性,包括能夠預防惡心和嘔吐,激活γ-氨基丁酸受體以增強鎮痛,調節一氧化氮合成,并發揮抗氧化,神經保護,抗焦慮,免疫調節和抗血小板聚集作用[3]。丙泊酚還被發現通過調節microRNA表達、基因轉錄、細胞凋亡和免疫系統功能,抑制腫瘤細胞的增殖和遷移,促進腫瘤細胞凋亡,增強對化療藥物的敏感性[4]。結直腸癌手術期間異丙酚麻醉可提高生存率,另一項研究表明,異丙酚通過促進細胞凋亡來抑制結直腸癌的腫瘤發生[5]。上述數據表明丙泊酚在抑制結直腸癌腫瘤發生方面具有有益作用,但其潛在的機制仍然知之甚少。誘導腫瘤細胞死亡是臨床癌癥治療的主要策略,大多數抗癌藥物通過觸發細胞凋亡和細胞壞死來消除腫瘤細胞,由于癌細胞對細胞凋亡和壞死具有獲得性或固有的抗性,通過這些機制誘導腫瘤細胞死亡的有效性有限。鐵死亡是一種鐵依賴性和活性氧(ROS)相關的細胞死亡類型,其特征是ROS的積累和細胞抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)的失活,從而導致氧化還原失調。研究報道誘導鐵死亡成功殺死腫瘤細胞,可抑制腫瘤生長[6]。在結直腸癌中,鐵死亡的激活也被認為是一種有效療法,其潛在機制已被廣泛報道,先前的研究報道,異丙酚通過ROS介導的細胞凋亡誘導癌細胞死亡[7]。因此,假設異丙酚可能通過誘導凋亡介導的細胞死亡來抑制結直腸癌的腫瘤發生。研究發現TM2D1在肝癌中高表達,并參與其的EMT過程,與腫瘤進展相聯系[8]。TM2D1在腫瘤細胞中的具體作用和機制尚待探索。因此,本研究主要探究丙泊酚通過TM2D1介導鐵死亡抑制結直腸癌的分子機制。

1 資料與方法

1.1一般資料:自2020年1月至2022年1月期間收集醫院接受結直腸癌根治性切除術90對結直腸癌和癌旁組織,從中選取12對結直腸癌組織和癌旁組織?；颊吣挲g18-90歲,平均年齡(73.8±4.7)歲,男女比例1∶1。所有患者均提供了書面知情同意書,本研究獲得醫院倫理委員會批準(批準號:CYFYLL2022212)。排除標準如下:合并自身免疫性疾病患者;其他惡性腫瘤病史;術前放療史;不能配合調查的老年患者。

1.2細胞培養及分組:人結直腸癌細胞系SW480購于中國科學院細胞庫。細胞在DMEM (Gibco)補充10%的牛胎牛油(Gibco),并保持在37℃含5%二氧化碳的空氣中,異丙酚在DMSO中稀釋,后在培養基中稀釋到特定濃度,SW480細胞分別用異丙酚(50μm)在室溫下處理,未處理的細胞作為對照。

1.3細胞轉染:利用GenScript合成人TM2D1 cDNA序列,并將其插入pcDNA3.1載體(Invitrogen),將SW480細胞(70-90%合流)接種于6孔板中,轉染TM2D1基因重組載體pcDNA3.1-TM2D1 (pc-TM2D1;10 nM)或pcDNA3.1空白載體(pcDNA3.1;10 nM)使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen),根據制造商的協議,轉染后,細胞接受丙泊酚處理,37℃孵育5h后,將未轉染的SW480細胞和轉染pc-TM2D1或pcDNA3.1的SW480細胞暴露于DMEM或添加50μm丙泊酚的培養基中。對照組將SW480細胞置于對照培養基中,不轉染。48h內進行后續實驗。

1.4MTT:MTT法測定細胞活力,將SW480細胞以4×103細胞/孔的密度接種到96孔板中,孵育48h后,每孔中加入10μL MTT溶液(Beyotime Institute of Biotechnology),進一步孵育4h。隨后丟棄細胞培養基,向細胞中加入150μL DMSO。采用高通量通用微孔板測定法(BMG Labtech GmbH)在570nm波長處測定吸光度。

1.5菌落形成測定:在集落形成實驗中,將對照組、丙泊酚組、丙泊酚+ pcDNA3.1組和異丙酚+ pc-TM2D1組的1×103SW480細胞置于3.5cm培養皿中,在添加10%胎牛血清的培養基中維持,使其形成集落,每4d更換一次培養基。培養約2周后,室溫甲醇固定菌落15min,室溫0.1%結晶紫染色15min,人工計數>50個細胞的染色菌落。

1.6脂質過氧化[硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)]:脂質過氧化用TBARS試劑盒檢測使用含有SW480細胞(1×107/mL)的RIPA裂解緩沖液(Beyotime Institute of Biotechnology),采集經異丙酚處理和/或pc-TM2D1轉染的SW480細胞,移入離心管,室溫下1000×g離心10min,用微孔板讀卡器在535 nM處檢測上述溶液的吸光度。

1.7測量總鐵和Fe2+水平:鐵檢測試劑盒用于測量總鐵和Fe2+細胞中的水平,總共2×106SW480細胞在4-0倍鐵測定緩沖液中快速均質,樣品在4℃下13000 × g離心10min,去除不溶性物質。為了測量總鐵,在每個樣品孔中加入5μL鐵還原劑以將Fe3+還原為Fe2+,并用移液器將樣品充分混合,后在室溫黑暗中孵育30min。為了測量亞鐵水平,在一組孔中向樣品中加入5μL實驗緩沖液,在另一組孔中加入5μL鐵還原劑,將100μL鐵探針添加到含有標準或測試樣品的每個孔中,樣品使用移液槍混合,后在室溫下黑暗孵育60min。最后,在593nM處測量吸光度。

1.8ROS檢測:使用2',7'-雙乙酸二氯熒光素(DCFDA)-ROS試劑盒,將SW480細胞以1×105/mL的密度于6mm的培養皿中,并允許貼壁過夜,過表達TM2D1的細胞或未轉染TM2D1的細胞用對照培養基或異丙酚孵育48h,用Hanks平衡鹽溶液洗滌細胞,用DCFDA在37℃下孵育45min,倒置熒光顯微鏡下檢測ROS水平。采用ImageJ軟件測量。

1.9qPCR:采用TRIzol試劑(Invitrogen),根據制造商的協議,使用PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara)在42℃下將總RNA逆轉錄為cDNA 30min,qPCR隨后使用SYBR-Green Master PCR混合物(Applied Biosystems)的TP800熱循環器DiceTM實時系統(Takara Biotechnology Co)。采用以下熱循環條件:95℃初始變性10min,95℃變性15s,60℃變性1min,40個循環,最后延長至72℃延長10min,使用2-ΔΔCq方法量化TM2D1 mRNA的相對表達水平(20),并歸一化為GAPDH(內參)。

1.10蛋白質印跡:使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(Sigma Chemical Co.)的RIPA裂解緩沖液(Beyotime Biotech)中提取組織蛋白。使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度,使用8%SDS-PAGE分離相同量的蛋白質(20μg)并轉印到PVDF膜上(Bio-Rad),在室溫下用5% BSA在Tris緩沖鹽水(TBS)中用5% BSA封閉印跡1h,待測蛋白與抗體4℃靜置過夜,后用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG檢測結合抗體,并用增強的化學發光試劑盒(賽默飛)可視化,使用Image J軟件(美國國立衛生研究院)對條帶強度進行量化。

2 結 果

2.1TM2D1在結直腸癌組織中的表達:結果顯示了與癌旁組織相比,TM2D1表達水平在CRC組織中顯著上調,表明TM2D1在結直腸癌中的潛在作用,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 TM2D1在結直腸癌組織中的表達

2.2丙泊酚對結直腸癌細胞增殖、集落形成能力及細胞增殖蛋白的作用:與對照組比較,丙泊酚處理顯著抑制細胞增殖,對細胞集落形成起抑制作用。同樣,丙泊酚處理下調了參與細胞增殖的蛋白質(包括Ki67和PCNA)的表達水平,差異有統計學意義(P<0.05),見表2,圖1。

圖1 丙泊酚對結直腸癌的作用

表2 丙泊酚對結直腸癌的作用

2.3丙泊酚對結直腸癌細胞TM2D1表達的影響:為了確定TM2D1在CRC中的作用,分析了TM2D1在細胞中的表達水平。與對照組相比,丙泊酚降低了TM2D1表達水平,與丙泊酚組比較,過表達TM2D1組,TM2D1在SW480細胞中的mRNA和蛋白表達水平增加,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2,表3。

圖2 丙泊酚對TM2D1表達的影響

表3 丙泊酚對TM2D1表達的影響

2.4TM2D1對結直腸腫瘤細胞凋亡和鐵死亡的影響:研究結果顯示,丙泊酚刺激后CRC細胞中的鐵死亡水平。與對照組比較,丙泊酚治療TBAR、總細胞鐵,Fe2+和ROS顯著增加,此外,丙泊酚處理上調CHAC1和PTGS2的蛋白表達水平,而GPX4的蛋白表達水平下調,然而,與丙泊酚組比較,過表達TM2D1組與之相反,差異有統計學意義(P<0.05),見表4,圖3。

圖3 TM2D1對腫瘤細胞凋亡和鐵死亡的影響

表4 TM2D1對腫瘤細胞凋亡和鐵死亡的影響

3 討 論

結直腸癌的高發病率和高死亡率的原因仍未確定。手術切除腫瘤是目前臨床治療結直腸癌的主要方法,手術可以促進癌癥轉移,因為手術允許癌細胞逃逸并進入循環系統,這是有效治療CRC的一個迫切需要解決的重大挑戰,有報道稱,麻醉劑可以改善手術后患者的長期預后,特別是復發和轉移[9]。越來越多的證據表明,丙泊酚可以抑制不同類型癌癥的細胞增殖,包括CRC[10]。丙泊酚對結直腸癌發生和進展的影響的具體分子機制仍有待確定。本研究結果表明,丙泊酚治療可顯著促進CRC細胞鐵死亡,抑制CRC細胞增殖,提示丙泊酚可能在CRC中發揮抑瘤作用。

研究顯示鐵死亡誘導劑(如erastin、sorafenib和sulfasalazine)已顯示出有益的抗腫瘤作用,已有相關抗癌藥物已被確定為鐵死亡誘導劑,例如,索拉非尼被發現可以增加肝細胞癌中的脂質氧化水平,從而導致細胞死亡[11]。在胰腺癌中,熱休克蛋白A5(HSPA5)/GPX4信號通路的激活誘導了對吉西他濱的耐藥,而HSPA5或GPX4的敲低逆轉了這種耐藥,研究發現,鐵死亡在這一過程中發揮了重要作用,因為已知GPX4可以減少脂質自由基的積累,防止鐵死亡的發生和發展[12]。研究報道青蒿素及其衍生物在KRAS基因突變的胰腺癌細胞中引發鐵凋亡,但對正常細胞的毒性作用很小,原花青素治療顯著抑制脊髓損傷患者鐵、TBAR、?；o酶a合成酶4和花生四烯酸15-脂加氧酶B的水平,上調GSH、GPX4、核因子-紅細胞2相關因子2和血紅素加氧酶1的水平[13]。本研究首次發現異丙酚可以促進CRC細胞的鐵死亡。鐵積累和脂質過氧化為特征的鐵下沉被認為與腫瘤細胞死亡有關,目前的研究結果顯示,異丙酚治療后TBAR水平以及細胞總鐵和Fe2+水平均顯著升高,ROS的積累是鐵死亡的一個特征[14]。本研究發現在丙泊酚刺激下,CRC細胞中的ROS水平顯著升高,表明丙泊酚可能誘導ROS介導的癌細胞凋亡。鐵死亡受到GPX4和某些鐵轉運調節蛋白的嚴格控制,先前的一項研究報道,GPX4失活促進CRC鐵下沉過程中脂質過氧化積累,活化轉錄因子4(ATF4)分支是主要的信號通路,CHAC1位于ATF4的下游,已被證明可促進GSH降解并隨后誘導鐵死亡。PTGS2在發生鐵死亡的細胞中也會被誘導,但PTGS2在鐵致細胞死亡級聯中的確切作用仍有待闡明。先前的研究報道,抑制鐵死亡誘導的PTGS2是緩解細胞死亡的有效方法。本研究分析了GPX4、CHAC1和PTGS2在丙泊酚治療后CRC細胞中的表達水平,丙泊酚處理顯著下調GPX4表達水平,上調CHAC1和PTGS2表達水平。數據表明,與其他鐵死亡誘導劑一致,丙泊酚可能能夠提高細胞鐵水平和ROS積累,上調CHAC1和PTGS2的表達水平,下調GPX4的表達水平。

為了進一步確定丙泊酚影響的潛在機制,通過確定丙泊酚對TM2D1的調節。與鄰近的正常對照組織相比,TM2D1在CRC組織中表達上調。TM2D1包含與G蛋白偶聯受體超家族相關的結構模塊,該結構模塊具有14個跨膜結構域,可結合β-淀粉樣蛋白,TM2D1以Aβ引發的半胱天冬酶依賴性方式調節神經元凋亡。最近,研究表明TM2D1也與各種癌癥患者的臨床結果有關,研究發現TM9D2在內的1個基因,以計算宮頸鱗狀細胞癌的轉錄組風險評分,發現其可以識別具有不同死亡風險的患者。此外,先前的研究表明,丙泊酚通過調節CRC中STAT3/HOX轉錄反義RNA軸抑制細胞侵襲并促進細胞凋亡。本研究結果顯示,丙泊酚治療以濃度依賴的方式負向調節TM2D1的表達。TM2D1可調節鐵死亡,抑制TM2D1可以增加細胞ROS水平,降低谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫比,TM2D1過表達也促進了細胞的遷移和侵襲。本研究通過在CRC細胞中過表達TM2D1來研究丙泊酚對CRC細胞增殖和鐵凋亡的影響是否可以逆轉,丙泊酚對CRC細胞增殖和集落形成的抑制作用以及丙泊酚對鐵死亡的刺激作用都被TM2D1過表達顯著抑制。結果表明丙泊酚可能通過下調TM2D1的表達誘導結直腸癌細胞鐵死亡。

綜上所述,本結果顯示丙泊酚促進CRC細胞鐵死亡,其潛在機制可能依賴于靶向TM2D1的表達。因此,丙泊酚誘導的鐵死亡可能是CRC的一種有效治療方向,也為CRC的治療提供了新的思路。