微小RNA在脈絡膜新生血管相關信號通路中的研究進展

楊凌齊,呂 洋

0 引言

脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)指脈絡膜血管的增殖性改變,通常分三型:Ⅰ型,新生血管局限于視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)下,最終導致RPE與視網膜脫離;Ⅱ型,新生血管突破RPE-Bruch膜復合體向視網膜神經上皮下、RPE上增殖;Ⅲ型,新生血管起源于視網膜內,隨后向視網膜下間隙和脈絡膜發展[1-2]。目前研究發現,CNV與40多種眼部疾病相關,是多種致盲性眼病的病理基礎,其發生機制極其復雜,涉及多種細胞、細胞因子及信號通路,其中,在CNV微環境中,微小RNA(microRNA,miRNA/miR)參與調控眼內新生血管、氧化應激、免疫反應的研究不勝枚舉[3-5],因此,深入探究miRNA介導的信號通路在CNV中的表達,有望為CNV治療提供新的靶點。

1 miRNA生物學特性

miRNA是近年研究較多的一類非編碼RNA分子,其長度為18-25 nt,存在于真核生物中。人體基因組中已檢測到400多種miRNA,其調控約30%的蛋白編碼基因[6]。每一個miRNA通常以堿基配對的方式結合信使RNA(message RNA,mRNA)序列的3’非編碼序列(untranslated regions,UTR),在轉錄后調節基因表達,根據互補程度抑制靶基因mRNA的翻譯;其次,當miRNA與靶點完全或相對完全互補時,也引發mRNA降解;此外,miRNA通過使CpG島甲基化發生異常,可直接調控靶基因轉錄[6]。一種miRNA可以靶向超過200種mRNA,而一種mRNA又可受多種miRNA調控。研究已表明,miRNA在血管生成、免疫炎癥反應及細胞增殖、分化、凋亡等生物過程中發揮重要作用[7-9]。同時,miRNA也被證明參與調控神經退行性疾病,如阿爾茲海默癥、多發性硬化癥及糖尿病視網膜病變(DR)等[10-11]。

2 miRNA在激光誘導小鼠CNV中的表達

激光誘導的CNV小鼠模型是近年來研究眼底血管疾病的重要途經,越來越多的研究表明,在小鼠CNV模型中,不同形式的miRNA在調控CNV形成過程中起到促進或抑制作用。在激光誘導的小鼠CNV模型中,miR-505高表達的同時病灶區血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白也顯著增加;玻璃體內注射miR-505抑制劑后,CNV病灶面積明顯降低[12]。研究表明,與對照組(無激光誘導的小鼠)相比,實驗組(激光誘導后36 h)小鼠脈絡膜組織中miR-155表達下調,隨后行脈絡膜鋪片發現,玻璃體內注射miR-155模擬物(miR-155 mimic)后熒光素滲漏明顯降低,且CNV病變大小也相應減小[13]。在嵌合體小鼠CNV模型中,玻璃體內注射miR-188-5p模擬物后,CNV病變組織中基質金屬蛋白酶2/13(matrix metalloproteinase,MMP-2/MMP-13)水平明顯降低且CNV病灶面積也隨之減小[4]。為明確miR-126-3p和miR-126-5p過表達是否能促進CNV生成,在激光損傷視網膜后注射兩者的模擬物,2 wk后檢測顯示miR-126-3p mimic導致CNV病灶面積減少約60%,而后者則輕度增加了CNV損傷面積[14]。研究發現,激光誘導的小鼠CNV模型中,RPE/脈絡膜組織中既低表達miR-93,也高表達VEGF-A mRNA和蛋白,表明在小鼠CNV模型中,過表達miR-93后可下調VEGF-A mRNA和蛋白水平,從而抑制CNV形成[15]。既往研究表明CNV小鼠中過表達miR-126后VEGF-A、VEGFR-2和Sprouty相關EVH1域含蛋白1(SPRED-1) mRNA和蛋白表達均顯著降低[16]。此外,在激光燒傷后的CNV模型中立即注射miR-195a-3p mimic,7 d后發現血管密度及CNV病變面積均明顯降低[17]。另有研究發現,經過多次激光灼傷的小鼠CNV模型血漿中miR-96、miR-182和miR-183水平明顯升高[18]?？傊?在激光誘導的小鼠CNV模型中,miRNA作為特異性調控因子促進或抑制CNV生成的事實不斷被揭示,但還需進一步研究miRNA通過何種信號通路參與調控CNV的發生發展。

3 miRNA調控CNV的相關信號通路

3.1PI3K/Akt信號通路磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是一種存在于細胞內的信號蛋白,具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,其由調節性亞基p85和催化亞基p110構成,可以促使其下游靶點絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)發生磷酸化,共同構成PI3K/Akt信號通路[19]。PI3K信號通路由各種生長因子如表皮生長因子、VEGF、成纖維細胞生長因子等激活,參與調控多種細胞活動、促進血管形成及基因表達等[20]。有研究使用慢病毒轉染miR-155發現,無論是在體內還是體外,miR-155直接抑制含SH2結構域的肌醇5磷酸酶1(SHIP-1)的表達并降低PI3K/Akt信號通路中效應分子的磷酸化,從而抑制CNV的形成[21]。此外,在小鼠CNV模型和骨髓來源的原代巨噬細胞中,miR-155靶向炎癥激活轉錄因子(C/EBPβ)抑制M2型巨噬細胞,進而抑制VEGF的表達和CNV形成[13]。研究證實,CNV形成涉及血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)向血管內皮細胞(endothelial cells,ECs)遷移、增殖及分化,EPCs表面趨化因子受體4(CXC chemokine receptor,CXCR4)與基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)結合,活化PI3K/Akt信號后促進VEGF誘導的EPCs遷移,進而促進新生血管形成[22]。研究發現,過表達miR-200b后可抑制VEGF/PI3K/Akt信號通路從而抑制CNV的形成[23]。在人臍帶間充質干細胞(hucMSCs)和人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中發現,過表達miR-126-3p后可促進VEGF誘導的EPCs增殖、遷移,提高CNV形成的能力,而引起這一結果歸因于miR-126-3p下調靶基因SPRED-1和磷脂酰肌醇3激酶受體2(PIK3R2),增強PI3K/Akt信號通路,達到促進血管新生的目的[24]。在激光誘導的小鼠CNV模型中,轉染miR-342-5p后能抑制VEGFR2和VEGFR3的表達,且減弱了VEGF誘導的Akt磷酸化,從而降低CNV形成的能力[25]。另有研究發現,在大鼠角膜新生血管中,高表達miR-145-5p的同時VEGFR2/PI3K/Akt表達隨之上調,因此miR-142-5p可能調控PI3K/Akt信號通路引起大鼠角膜CNV形成[26]。

3.2TGF-β信號通路轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路在CNV形成過程中發揮重要作用。TGF-β超家族受體是絲氨酸/蘇氨酸激酶受體,即TGF-βⅠ型受體(TβR-Ⅰ)、TGF-βⅡ型受體(TβR-Ⅱ)。TGF-β信號轉導途徑分為兩種:(1)TGF-β激活Smad蛋白依賴性信號傳導通路,如激活素/TGF-β特異性R-Smads和BMP特異性R-Smads;(2)TGF-β激活Smad蛋白非依賴性信號傳導通路,如PI3K/Akt信號通路和MAPK通路等。研究表明,miRNA對TGF-β信號通路具有一定的調控作用,同時TGF-β也可影響miRNA的表達。在ECs中,通過激活素受體樣激酶1(ALK1)/TGF-β信號途徑誘導Smad1/Smad5刺激ECs遷移、增殖和管腔形成;通過ALK5/TGF-β信號途徑誘導Smad2/Smad3抑制血管生成。miR-155可靶向結合Smad2的3’UTR,下調Smad2表達,抑制TGF-β/Smad2信號轉導及VEGF-A分泌,從而抑制CNV形成[27]。在CNV模型中,通過調控ALK5/TGF-β/Smad2信號通路后可上調miR-34a-5p、miR-135a-5p及miR-10b-5p的表達,抑制VEGF分泌及CNV形成[28]。miR-342-5p靶向內皮糖蛋白(endoglin)并通過抑制ECs中的Smad1/5磷酸化干擾TGF-β信號,從而抑制ECs增殖和管腔形成,并減少體外和體內血管生成[25]。大鼠糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)實驗中,miR-192通過靶向早期生長反應因子1(early growth response-1,Egr1)調控TGF-β信號在預防DN過程中發揮重要作用,然而miR-192調控TGF-β信號在CNV中的作用有待進一步研究[29]。

3.3NF-κB信號通路核因子-κB(NF-κB)是細胞內重要的核轉錄因子,參與機體免疫炎癥、調節細胞增殖、凋亡及血管生成。NF-κB是一種異源二聚體蛋白,該家族有5個成員,即NF-κB1(p50)、NF-κB2 (p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel。通常所說的NF-κB蛋白是指p50/p65亞單位形成的NF-κB1二聚體蛋白。NF-κB信號轉導包括經典途徑、旁路途徑和非經典途徑。過表達miR-155可促使NF-κB核轉位,因此下調miR-155表達可抑制Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB通路的激活,抑制內皮細胞炎癥反應[30]。在用骨髓源性M1型巨噬細胞干預的ECs中,miR-155高表達且通過靶向細胞因子信號傳導抑制因子6(SOCS6)抑制p65泛素化及降解,激活NF-κB信號通路,從而調控血管內皮細胞上皮間質轉化[31]。OTUD7B是OTU家族泛素酶卵巢蛋白酶成員之一,OTUD7B去泛素化能抑制NF-κB核移位和轉錄活性。在HUVECs中發現miR-146a-5p與OTUD7B存在靶點關系,下調miR-146a-5p靶向OTUD7B使NF-κB信號通路失活從而抑制CNV形成[32]。在DR模型中,miR-874通過靶向p65降解調控NF-κB信號通路,進一步減弱DR中血管生成[33]。在肝癌細胞中,三氧化二砷(As2O3)作用于miR-491t調控的TGF-β/Smad3/NF-κB通路中,不僅能減弱血管且降低VEGF的分泌及血管生成能力[34]。

3.4Notch信號通路Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物中,在進化上高度保守,通過細胞間的相互作用調節細胞、組織、器官的分化和發育。哺乳動物有4種Notch受體(Notch1-4)和5種Notch配體(Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4、Jagged-1和Jagged-2)。Notch信號通路活化有兩條途徑,即經典的Notch信號通路(又稱CBF-1/RBP-Jk依賴途徑)和CSL(DNA結合蛋白)非依賴途徑。當Notch配體與靶細胞的Notch受體結合時,CSL與其受體胞內段(NICD)結合將啟動Notch信號激活[35]。CNV形成主要受VEGF調控,而VEGF能夠促進ECs中Delta-like-4(DLL4)的表達,從而使ECs在VEGF/Notch信號通路作用下發生增殖和遷移[36]。近年研究表明,miRNA中miR-150、miR-342-5p、miR-223-3p、miRNA-10等在調控Notch信號通路參與CNV的形成中發揮關鍵作用。在正常人視網膜血管中,miR-150表達豐富,其不僅通過抑制下游靶基因CXCR4、DLL4及FZD4抗原(重組蛋白)維持血管處于靜止狀態,且能抑制內皮細胞增殖、遷移和成管功能;然而,在CNV病變中,miR-150表達下調并靶向內皮細胞中血管生成調節因子CXCR4、DLL4和FZD4,進而促進CNV形成[37]。miR-324-5p作為一種多功能血管生成抑制因子,不僅是VEGFR和TGF-β信號傳導的關鍵分子,也是Notch通路的下游分子,通過下調Notch信號中Jagged-1減弱ECs增殖、遷移的能力,抑制血管生成[25]。此外,miR-223-3p也作為Notch信號傳導的下游分子之一,直接靶向F-box和WD-40結構域蛋白7(Fbxw7),調控ECs增殖和遷移功能;而過表達Fbxw7后可抑制由miR-223-3p引起的ECs增殖與遷移,提示Notch信號通路可通過激活miR-223-3p靶向Fbxw7抑制ECs遷移和“芽生”[38]?？扇苄訤MS樣酪氨酸激酶1(sflt-1)是一種具有抗血管生成特性的酪氨酸蛋白激酶,與VEGF及胎盤生長因子(PlGF)結合可降低游離VEGF和PlGF的濃度并減少血管生長。最初在斑馬魚中證明miR-10轉錄后直接調控sflt-1,從而調節血管生成,后續研究發現sflt-1并不是miR-10的唯一靶點,miR-10可以靶向斑馬魚中的E3泛素蛋白鏈接酶1(Mib1),而Mib1通過泛素化Notch受體正調控Notch信號通路,表明miR-10a/10b以Notch依賴性方式直接靶向Mib1調節血管形成[39]。

3.5Wnt信號通路Wnt信號通路是一個復雜的蛋白質調控網絡,其參與血管新生是近年研究的熱點,通過使ECs增殖、遷移、“芽生”等促進脈管系統成熟的多個階段誘導血管發生[40]。Wnt信號通路包括經典途徑和非經典途徑。β-catenin是經典Wnt信號通路中的核心調控因子,其表達水平決定通路的開放與否。當Wnt/β-catenin信號通路激活后,Wnt分子與Frizzled受體(FZD)及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)相結合,激活胞內散亂蛋白(disheveled,Dvl),從而避免β-catenin被降解,使其聚集并轉移至細胞核,啟動下游靶基因的轉錄。在小鼠CNV模型中,過表達miR-150后下調FZD4可抑制Wnt/β-catenin信號通路,減弱CNV的形成[37]。Jiang等[41]在前列腺癌(PCa)組織中檢測PCa相關基因,發現小腦鋅指蛋白2(zinc finger protein-2,ZIC2)是miR-129-5p的靶基因,其可通過Wnt/β-catenin途徑下調ZIC2,抑制上皮間充質轉化及血管生成,達到減緩PCa進展的目的。此外,有學者發現ZIC2是病理性近視的易感基因[42],因此,miR-129-5p是否通過ZIC2/Wnt/β-catenin信號通路調節CNV的發生發展,還有待進一步研究。研究發現,VEGF通過崩解素-金屬蛋白酶10(ADAM10)誘導神經蛋白-1(NRP1)裂解從而調控血管生成,而miR-655-3p通過介導ADAM10抑制Wnt/β-catenin信號通路進而降低肝細胞癌的發生,且miR-655-3p可直接靶向VEGF抑制上皮性卵巢癌的增殖和侵襲[43-45]。因此,miR-655-3p是否可以通過VEGF/ADAM10/Wnt/β-catenin信號通路參與CNV的形成,仍有待進一步研究。有研究在探討牽張成骨血管發生機制中分別預測了miR-486、miR-21、miR-27b、miR-205的靶基因,發現這些miRNA不僅通過調控靶基因參與EPCs血管發生,而且與Wnt信號通路和FoxO信號通路有交集,從而證實上述4種miRNA通過調控Wnt信號通路參與EPCs血管發生[46],但該研究就miRNA如何介導Wnt信號通路調控靶基因參與EPCs血管形成尚未討論。

4 小結與展望

脈絡膜新生血管是多種致盲性眼病的病理基礎,導致中心視力喪失,嚴重威脅著人類的健康和生活質量。然而,CNV的發病機制仍未完全闡明。隨著學者對miRNA的深入研究,越來越多的miRNA介導信號通路參與CNV的研究被揭示,匯總近年關于miRNA調控各種信號通路參與CNV發生發展的相關研究[4,13,23-25,27-30,32-34,37-39,42-53]見表1。在CNV進展中,這些miRNA不僅參與一種信號通路,而是涉及多個信號通路共同激活相互作用。然而,又有新問題有待發現及解決,如miRNA靶向特定基因介導腫瘤性疾病的信號通路是否也參與CNV的發生發展,此外,又有許多表達于CNV中的miRNA基于何種蛋白基因作用于信號通路從而影響CNV發展,這些問題都是未來研究的方向,為進一步闡明CNV發病機制及CNV的靶向治療提供新思路。

表1 miRNA調控相關信號通路參與CNV形成的研究匯總