玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞生產性能、肝臟糖代謝、內源消化酶活性和腸道中葡萄糖轉運載體基因表達的影響

常丹萍 劉觀忠 楊博文 趙國先 張東遠 馮志華* 李 茜 張海華 王 玨

(1.河北農業大學動物科技學院,保定 071000;2.中科康源(唐山)生物技術有限公司,遷安 064400;3.河北省畜牧獸醫研究所,保定 071000;4.河北科技師范學院,秦皇島 066000)

近年來,畜禽業發展迅速造成的飼料資源短缺問題日益嚴重。玉米-豆粕型飼糧是我國的主導飼糧結構,這種結構對豆粕年消耗量巨大。我國大豆年產量約1 640萬t[1],國內大豆嚴重供給不足導致我國大豆對外依存度超80%[2],2022年末豆粕價格同比年初增長39.21%[3],造成飼料成本大幅提高。解決上述問題,有2個途徑,一是開發新的飼料資源,二是提高現有飼料養分利用率。

目前很多飼料企業常會使用一部分菜籽粕、棉籽粕等雜粕代替豆粕或魚粉等常規蛋白質飼料,這樣不僅能緩解飼料資源短缺的問題,還可以降低飼料成本。我國具有豐富的雜粕資源,各種農副產品如棉籽餅粕、菜籽餅粕、花生餅粕等產量巨大且價格低廉,2021年棉籽粕、菜籽粕、花生粕的年產量分別為580萬、700萬、400萬t[4],但是雜粕的應用在實際生產中并不廣泛,其主要原因有雜粕中氨基酸不平衡、粗纖維與可溶性非淀粉多糖含量高等。雜粕中除了花生粕、芝麻粕的粗纖維含量較低外,其余的粗纖維含量都較高,均在12%左右[5],而粗纖維是植物細胞壁的主要成分,其含量高會影響動物對飼糧中養分的利用。雜粕中的非淀粉多糖主要有纖維素、果膠、阿拉伯木聚糖、木聚糖、β-葡聚糖等,這些物質是細胞壁的主要組成成分[6],單胃動物尤其是雞自身不能分泌消化這些物質的酶,使得細胞壁無法充分打開,導致飼料養分利用率低[7]。因此,破壞細胞壁是提高飼料養分利用率的有效手段。破壞細胞壁的方法有很多,目前研究較為熱門且效果顯著的就是添加外源性酶制劑。由于細胞壁的結構很復雜,單一的酶對細胞壁的破壞效果并不理想,需要一系列酶協同作用才能破壞。研究表明,在蛋雞飼糧中添加復合酶制劑可以顯著改善其生產性能、蛋品質及養分利用率等相關指標[8-9]。由羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、外切葡聚糖酶等一系列酶復合而成的復合纖維素酶,針對細胞壁結構設計,與其他酶制劑相比所含酶種類和配合比例理論上更加科學。但該復合纖維素酶在蛋雞雜粕型飼糧中的應用效果及其作用機理尚未見報道。為此,本試驗通過在玉米-雜粕型飼糧中添加不同水平的復合纖維素酶,研究其對蛋雞生產性能、蛋品質、肝臟中糖代謝相關酶活性、內源消化酶活性以及腸道中葡萄糖轉運載體基因表達的影響,并探討其作用機理,明確蛋雞雜型飼糧中復合纖維素酶的應用效果并篩選出適宜添加量,為復合纖維素酶在蛋雞雜粕型飼糧中應用提供試驗基礎和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

復合纖維素酶是基于里氏木霉與黑霉酶系的高效協同作用通過混菌發酵與高通量篩選技術獲得,其組成與酶活性如下:羧甲基纖維素酶活性20 389.6 U/g、木聚糖酶活性4 054.4 U/g、外切葡聚糖酶活性3 284 U/g、β-葡萄糖苷酶活性10 528 U/g、淀粉酶活性56 U/g、蛋白酶活性28 U/g。

1.2 試驗設計

采用單因素試驗設計,選取288只健康狀況良好的53周齡海蘭褐蛋雞,隨機分為4組,每組6個重復,每個重復12只雞。各組平均體重、產蛋率無顯著差異(P>0.05),按照常規飼養方式進行籠內飼養。4組蛋雞分別飼喂添加0(對照組)、200、400、600 mg/kg復合纖維素酶的玉米-雜粕(豆粕-棉籽粕-菜籽粕)型飼糧。飼養試驗共計91 d,其中預試期7 d,正試期84 d。玉米-雜粕型飼糧組成及營養水平見表1。飼糧中粗蛋白質、鈣、總磷、氨基酸含量分別參照GB/T 6432—2018、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018和GB/T 18246—2019測定。

表1 玉米-雜粕型飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 飼養管理

試驗采用階梯式籠養,每籠3只雞,各個重復均勻分布,試驗雞只全部飼養于同一雞舍內。每天加料2次(08:00、15:00),終日保持飼料器內有料。乳頭式飲水器自由飲水,每天16:00—17:00清糞和打掃衛生1次,每周對雞舍進行帶雞噴霧消毒1次,定期對雞舍周圍進行噴霧消毒。雞群的免疫程序按照常規程序進行。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生產性能

以重復為單位記錄每周耗料量,每天16:00收蛋,記錄各重復產蛋數、總蛋重,整理計算以下指標。

產蛋率=[總蛋數/(試驗雞數×試驗天數)]×100; 平均蛋重=每個重復總蛋重/每個重復產蛋總數;平均日采食量=(每周每個重復喂料量-每周每個重復剩料量)/(重復內雞只數×每周天數);料蛋比=試驗期內每個重復耗料總量/試驗期內每個重復產蛋總重。

1.4.2 蛋品質

試驗結束當天,每個重復隨機取3枚雞蛋并標號,進行蛋品質檢測。

蛋黃重:電子天平測量,精確到0.01 g。

蛋白高度:全自動蛋品質分析儀(EMT-5200 Robotmation公司,日本)測定。

蛋殼強度:蛋殼強度測定儀(EFG-0503,Robotmation公司,日本)測定。

蛋殼厚度:螺旋測微器分別測量除去內外殼膜的蛋殼鈍端、中部、銳端3部位的厚度,取平均值,精確到0.01 mm。

蛋黃顏色:全自動蛋品質分析儀測定。

蛋形指數:用全自動蛋品質分析儀測量雞蛋縱徑和橫徑,縱徑與橫徑比值即為蛋形指數,精確到0.1 mm。

哈氏單位:全自動蛋品質分析儀測定。

1.4.3 肝臟中丙酮酸激酶及磷酸果糖激酶活性

于試驗結束當天,每個重復隨機選取1只蛋雞,頸動脈放血致死后立刻解剖,取其肝臟組織至凍存管,液氮速凍后轉移至-80 ℃超低溫冰箱中保存待測。肝臟丙酮酸激酶及磷酸果糖激酶活性測定具體步驟均按照試劑盒說明書進行,檢測試劑盒(試劑盒編號:A076-1-1、A129-1-1)均購自南京建成生物工程研究所。

1.4.4 十二指腸、空腸中α-淀粉酶及胰蛋白酶活性

于試驗結束當天,每個重復隨機選取1只蛋雞,頸動脈放血致死后立即解剖,輕輕擠出十二指腸、空腸食糜至凍存管,液氮速凍后轉移至-80 ℃超低溫冰箱中保存待測。十二指腸、空腸中α-淀粉酶及胰蛋白酶活性測定具體方法參照試劑盒說明書進行,檢測試劑盒(試劑盒編號:016-1-1、A080-2-2)購于南京建成生物工程研究所。

1.4.5 十二指腸、空腸中葡萄糖轉運載體mRNA相對表達量

于試驗結束當天,每個重復隨機選取1只蛋雞,頸動脈放血致死后立即解剖,分離小腸,沿縱向剖開,用生理鹽水沖洗,吸水紙吸干。剪取十二指腸、空腸中段約3 cm作為組織樣品,置于液氮中速凍,取出后于-80 ℃冷凍保存。取100 mg組織抽提總RNA,通過研磨、離心、孵育等操作以及添加三氯甲烷、異丙醇、乙醇等溶液最終將提取的RNA稀釋至200 ng/μL;配制逆轉錄反應體系(5×SweScript All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL、gDNA Remover 1 μL、RNA 10 μL、RNase free water 20 μL),輕輕混勻并離心,設置逆轉錄程序,于普通PCR儀上完成逆轉錄;取0.1 mL PCR反應板,配制反應體系[2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX) 7.5 μL、2.5 μmol/L基因引物(上游+下游)1.5 μL、反轉錄產物(cDNA)2.0 μL、Water Nuclease-Free 4.0 μL],每個反轉錄產物配制3管;點完樣用PCR封板膜配合封膜儀完成封膜,于熒光定量PCR儀上完成擴增。以β-肌動蛋白(β-actin)作為參比基因,采用2-ΔΔCt法計算目的基因鈉-葡萄糖協同轉運蛋白-1(SGLT-1)和葡萄糖轉運蛋白-2(GLUT-2)的mRNA相對表達量。PCR引物信息見表2。

表2 PCR引物信息

1.5 數據統計與分析

試驗數據用Excel 2019進行整理匯總,采用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法進行組間多重比較。結果用平均值±標準誤(mean±SE)表示,P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞生產性能的影響

由表3可知,與對照組相比,400 mg/kg組產蛋率顯著提高了5.71%(P<0.05),料蛋比顯著降低了8.90%(P<0.05),其他試驗組無顯著變化(P>0.05)。與對照組相比,400 mg/kg組與600 mg/kg組平均日采食量分別顯著降低了3.26%與3.09%(P<0.05)。各組的平均蛋重無顯著差異(P>0.05)。

表3 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞生產性能的影響

2.2 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞蛋品質的影響

由表4可知,與對照組相比,玉米-雜粕型飼糧中添加不同水平復合纖維素酶對蛋雞的蛋殼厚度、蛋殼強度、蛋白高度以及哈氏單位等各項蛋品質指標均無顯著影響(P>0.05)。

表4 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞蛋品質的影響

2.3 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞肝臟中糖代謝相關酶活性的影響

由表5可知,與對照組相比,400 mg/kg組和600mg/kg組肝臟中丙酮酸激酶活性分別提高70.71%、53.04%,差異顯著(P<0.05)。各試驗組肝臟中磷酸果糖激酶活性與對照組相比均有所提高,但差異均不顯著(P>0.05)。

表5 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞肝臟中糖代謝相關酶活性的影響

2.4 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞內源消化酶活性的影響

由表6可知,與對照組相比,玉米-雜粕型飼糧中添加400 mg/kg復合纖維素酶可以顯著提高空腸中淀粉酶活性(P<0.05)。各試驗組十二指腸中淀粉酶活性與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。與對照組相比,各試驗組十二指腸和空腸中胰蛋白酶活性均有所提高,其中400 mg/kg組空腸胰蛋白酶活性比對照組提高160.69%,差異顯著(P<0.05)。

2.5 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞腸道中葡萄糖轉運載體基因表達的影響

由圖1可知,與對照組相比,玉米-雜粕型飼糧中添加400或600 mg/kg復合纖維素酶均可以顯著提高蛋雞空腸中SGLT-1 mRNA相對表達量(P<0.05);各試驗組蛋雞十二指腸中SGLT-1 mRNA相對表達量與對照組相比差異不顯著(P>0.05);此外,各組蛋雞空腸中SGLT-1 mRNA相對表達量整體比十二指腸高。與對照組相比,玉米-雜粕型飼糧中添加不同水平復合纖維素酶對蛋雞空腸、十二指腸中GLUT-2 mRNA相對表達量均無顯著影響(P>0.05),但在數值上以400 mg/kg組較高。

數據柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞生產性能和蛋品質的影響

目前畜禽大多使用植物性飼料,其共同特點是有大量細胞壁。由于雞自身不能分泌分解細胞壁的酶,導致細胞壁內養分不能被充分利用,不僅造成飼料資源的浪費,同時還增加了養殖成本。本試驗使用的復合纖維素酶由一系列針對分解細胞壁的酶復合而成,可以通過破壞細胞壁結構,使細胞壁內養分充分釋放,提高飼料利用率,進而提高蛋雞生產性能。焦莉等[10]的研究表明,低營養水平飼糧中添加復合酶可以顯著降低蛋雞的料蛋比;Oba等[11]的研究表明,添加復合纖維素酶可以顯著提高蛋雞的產蛋率。本試驗結果與上述研究結果一致。Bederska-ojewska等[12]研究顯示,在黑麥飼糧中添加復合酶制劑對蛋雞的產蛋率無顯著影響。本試驗結果與其不同,其原因可能是使用的酶制劑不同導致結果不同,本試驗選用的復合纖維素酶可以有效破壞細胞壁中的β-1,4糖苷鍵等化學鍵[13]。海存秀等[14]研究發現,在雜粕型飼糧中添加復合酶制劑可以顯著降低蛋雞的采食量與料蛋比。本試驗結果與上述研究結果相同,由于家禽具有為能而食的特點,添加復合纖維素酶可以提高飼糧中養分的釋放量,降低采食量與料蛋比。

飼糧中添加酶制劑會從不同方面影響蛋品質。張勝[15]的研究表明,蛋雞飼糧中添加飼用酶制劑可以一定程度上提高蛋殼厚度,降低破蛋率。黃靚[16]的研究顯示,復合酶制劑對海蘭褐蛋雞蛋黃顏色、蛋殼強度、蛋殼厚度均無顯著影響,本試驗結果與該研究結果一致。

3.2 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞肝臟糖代謝的影響

肝臟是動物機體重要的代謝器官,是糖、脂代謝的主要場所,在動物營養物質代謝過程中發揮著重要作用[17]。動物機體主要的糖代謝途徑有糖酵解、糖異生、三羧酸循環、磷酸戊糖途徑等,其中糖酵解是動物機體分解葡萄糖最主要的途徑之一。丙酮酸激酶可催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸,磷酸果糖激酶可催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和ADP,二者都是糖酵解途徑中的限速酶。由于魚類對葡萄糖利用能力低下,因此目前關于飼糧中碳水化合物水平對肝臟糖代謝影響的研究主要集中在魚類上,在蛋雞方面的研究較少,但二者吸收利用葡萄糖的機制類似[18]。有報道指出,飼糧中碳水化合物水平與肝臟丙酮酸激酶活性關系密切[19-21]。Zhou等[17]研究發現,隨著飼糧中碳水化合物水平提高,金鱭魚肝臟中丙酮酸激酶活性顯著提高。陸游等[22]研究表明,控制飼糧中脂肪水平為5%時,隨著飼糧中淀粉含量的增加,大黃魚肝臟中丙酮酸激酶活性顯著提高。本試驗結果與上述結論基本一致。本試驗通過添加復合纖維素酶使飼糧中養分的釋放量增多,可被蛋雞利用的有效養分增多,即酶的底物增多,肝臟中丙酮酸激酶活性隨之提高。聶琴等[23]研究發現,大菱鲆肝臟中磷酸果糖激酶活性不受飼糧中碳水化合物水平的影響。與上述結論一致,在玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞肝臟中磷酸果糖激酶活性無顯著影響。有研究報道,磷酸果糖激酶非常保守,其活性不受飼糧中碳水化合物水平的誘導[24],這可能是肝臟中磷酸果糖激酶活性變化不顯著的原因。由于添加酶制劑對蛋雞肝臟中丙酮酸激酶活性影響的研究鮮有報道,其具體原因有待進一步研究。

3.3 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞內源消化酶活性的影響

小腸是家禽消化吸收飼糧中養分的主要場所,腸道中的淀粉酶和胰蛋白酶將飼糧中的淀粉和蛋白質分解成葡萄糖和多肽等小分子物質,有助于機體利用。

溫超[25]通過試驗發現,飼糧中添加復合酶制劑后產蛋后期蛋雞各腸段中淀粉酶活性以及空腸中胰蛋白酶活性有所提高,但差異不顯著,而十二指腸中胰蛋白酶活性則有下降趨勢。本試驗結果與其不同,其可能是由于使用的酶制劑具體組成成分不同造成最終試驗結果不同,溫超[25]的試驗中使用的復合酶制劑主要由纖維素酶、植酸酶和木聚糖酶復合而成。陳加敏[26]研究發現,底物食糜的濃度與內源酶活性呈正相關。White等[27]研究發現,外源酶對內源酶的作用機制不僅是直接提高內源酶分泌量,并且可以間接通過調節底物的量對內源酶進行調控。本試驗中,外源性添加的復合纖維素酶通過分解細胞壁,釋放更多壁內養分,增加了腸道內可消化底物濃度,進而刺激內源消化酶分泌,提高內源消化酶活性。隨著復合纖維素酶添加量的增加,各個腸段的內源消化酶活性不斷提高,達到最大值后又出現降低的趨勢。本試驗結果與Rebolé等[28]的研究結果一致,分析原因為當復合纖維素酶添加量不足時,導致細胞壁降解不完全,可消化底物濃度低,因此消化酶活性低,當復合纖維素酶添加量過高時,達到底物消化的飽和量,會產生負反饋抑制,影響養分的消化吸收,生產性能等指標也印證了該趨勢。

3.4 玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶對蛋雞腸道中葡萄糖轉運載體基因表達的影響

進入動物機體的碳水化合物會在小腸被淀粉酶等消化酶分解為單糖,而單糖需要相應的轉運載體轉運才能最終被機體吸收[29]。小腸黏膜上皮細胞吸收的單糖包括葡萄糖、半乳糖和果糖,其中葡萄糖占80%,被禽類吸收的單糖中葡萄糖的占比達98%以上[30]。有研究表明,小腸上皮細胞中營養物質轉運載體的表達量直接影響養分吸收[31]。單糖轉運載體主要有SGLT-1和GLUT-2,主要轉運葡萄糖、果糖、半乳糖。SGLT-1在葡萄糖轉運過程中起主導作用,主要分布在近端小腸上皮細胞刷狀緣膜上,通過激活蛋白激酶C(PKC)依賴性通路調節GLUT-2對葡萄糖的轉運[32]。mRNA作為指導蛋白質合成的模板,其相對表達量增多意味著葡萄糖轉運載體增多,被機體吸收利用的養分增多。王修啟等[33]研究發現,飼糧中添加木聚糖酶可以顯著提高肉仔雞十二指腸中SGLT-1 mRNA相對表達量,對空腸中SGLT-1 mRNA相對表達量的影響不顯著,該結果與本試驗結果不同。Barfull等[34]研究表明,SGLT-1 mRNA相對表達量和雞日齡與腸腔面積有關,且均呈正相關。本試驗選用的蛋雞比肉仔雞腸腔面積更大,營養物質與腸道接觸面積更大,因此在本試驗中添加復合纖維素酶對蛋雞空腸中SGLT-1 mRNA相對表達量有顯著影響。SGLT-1 mRNA相對表達量受底物葡萄糖濃度的影響[35]。本試驗中,添加400 mg/kg復合纖維素酶組蛋雞空腸中淀粉酶活性較對照組顯著提高,因此其空腸中SGLT-1 mRNA相對表達量顯著高于對照組。王修啟等[33]研究發現,與對照組相比,飼糧中添加木聚糖酶對肉雞十二指腸和空腸中GLUT-2 mRNA相對表達量無顯著影響。本研究結果符合前人研究結論。有報道表明,GLUT-2不僅分布在小腸,在肝臟、腎臟、胰臟、大腦中均表達[36-37],這可能是添加復合纖維素酶后蛋雞腸道中GLUT-2 mRNA相對表達量不顯著的原因。周力等[38]的研究發現,精料比例越高,青海黑藏羊小腸中SGLT-1 mRNA相對表達量越高。復合纖維素酶可分解細胞壁降低飼糧纖維含量,提高飼糧中養分釋放量,因此各試驗組腸道中葡萄糖轉運載體mRNA相對表達量均高于對照組,與前人研究結果一致。

4 結 論

在玉米-雜粕型飼糧中添加復合纖維素酶可以通過提高飼糧中營養物質釋放量提高蛋雞小腸中消化酶及肝臟中糖代謝相關酶活性,還能上調腸道中葡萄糖轉運載體基因的表達,進而提高生產性能。本試驗條件下,蛋雞玉米-雜粕型飼糧中復合纖維素酶的最適添加量為400 mg/kg。