白術多糖對脂多糖處理下雛鵝十二指腸腸道屏障功能的調節作用

陳梟梟 楊舒展 陳浩祥 馬元藝 陳丹丹 李冰心 李婉雁 許丹寧 田允波 黃運茂 曹 楠*

(1.仲愷農業工程學院動物科技學院,廣州 510225;2. 廣州海關技術中心,廣州 510623)

脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分,在細菌黏附在其他細胞或裂解時釋放內毒素,可嚴重損害鳥類和哺乳動物的正常生理活動,降低免疫力甚至死亡[1]。養殖密度大,被糞便嚴重污染的洗浴池得不到及時清理和飼糧變質等原因累積大量LPS,導致肉鵝生活在富含外源性LPS的環境中,容易遭受外源性LPS的侵襲,出現嚴重的消化道癥狀,腸道屏障發生嚴重的損傷,影響其生產性能和經濟效益[2]。

十二指腸是食物消化和營養吸收的關鍵部位,同時十二指腸通過釋放激素和神經調節胃腸道的運動和蠕動,以促進食物的順利通過,并維持正常的胃腸道功能[3]。除此之外,十二指腸的腸道上皮細胞、細胞間的連接、黏液層、免疫細胞及其分泌產物和腸道菌群組成腸黏膜屏障,屏障將腸道環境和機體內部環境分離,在維持腸道免疫平衡,維持機體內環境穩態中發揮著重要的作用[4-5]。有文獻報道,LPS會導致雛雞小腸黏膜明顯受損,腸上皮細胞完整性喪失,小腸中的閉合蛋白(Occludin)、緊密連接蛋白-1(Claudin-1)、閉鎖小帶蛋白-1 (ZO-1)表達顯著下調[6],血清D-乳酸含量增加,血清二胺氧化酶(DAO)活性明顯增強[7],對家禽腸道機械屏障造成了損害;LPS使家禽十二指腸、空腸、回腸的杯狀細胞數量明顯減少[8],顯著減少黃羽肉雞空腸中黏蛋白-2(MUC-2)的表達[9],破壞家禽腸道的化學屏障。也有文獻報道,LPS促進了肉鴨回腸黏膜中炎癥相關因子Toll樣受體4(TLR4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-17A(IL-17A)、白細胞介素-1β(IL-1β)的表達[10],破壞腸道免疫平衡。

已經有文獻證明了植物多糖對畜禽腸道屏障的影響,黃芪多糖能夠促進羅斯308雛雞空腸中Claudin-1、緊密連接蛋白-3(Claudin-3)、ZO-1、Occludin的表達,增加小腸絨毛高度和絨隱比,并減少雛雞血清中D-乳酸含量[11],降低肉雞血清中的DAO活性[12],保護腸道機械屏障;黃芪多糖能夠增加羅斯308雛雞小腸中杯狀細胞的數量[11];黃芪多糖和甘草多糖能顯著促進肉雞小腸中MUC-2的表達[12],保護腸道化學屏障;泰山馬尾松花多糖都能夠增加雛雞血液中免疫球蛋白G(IgG)和腸黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的含量,促進腸道中白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、γ-干擾素(IFN-γ)的分泌,促進了補體因子1(BF1)、補體因子2(BF2)、β-淀粉樣蛋白(BLA)、β-淀粉樣蛋白1(BLA1)、β-淀粉樣蛋白2(BLA2)基因的表達,還能促進CD4陽性T細胞(CD4+T)、CD8陽性T細胞(CD8+T)的轉化率,從而激活了雛雞腸道黏膜的免疫系統[13]。白術多糖(PAMK)是中藥白術的主要生物活性成分,具有調理脾虛、理氣和胃、增強胃腸功能的作用[14]。目前已有文獻證明,PAMK能夠有效緩解外源性LPS對雛鵝造成的肝臟、脾臟、法氏囊和胸腺這些免疫器官的免疫抑制和炎性損傷。PAMK能通過鐵死亡相關通路減少LPS引起的雛鵝氧化應激,降低脾臟組織的鐵含量和鐵死亡程度[15];還能通過TLR4信號通路緩解LPS誘導的雛鵝法氏囊損傷[16];同時能通過線粒體和死亡受體途徑緩解LPS引起的胸腺細胞凋亡,減少胸腺組織的炎癥反應和氧化應激[17];通過微小RNA-223(miR-223)/NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)軸減少LPS處理下雛鵝肝臟組織、肝臟細胞的炎性損傷[18]。然而尚未知曉PAMK能否保護和修復LPS造成的十二指腸腸道損傷。因此,本試驗以雛鵝為研究對象,探討PAMK對LPS造成的十二指腸腸道屏障損傷的緩解作用,為雛鵝容易遭受外源性LPS侵襲的難題尋求有效的解決方法,也為PAMK作為飼糧添加劑的開發提供一個理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物為240只健康的1日齡馬崗鵝雛鵝,購自清遠市金羽豐鵝業有限公司。在仲愷農業工程學院鐘村教學科研基地中進行養殖試驗。試驗前1周對鵝舍進行嚴格的清洗消毒,試驗鵝可自由采食、飲水、活動,舍內保持適宜溫度、濕度及通風,保持鵝舍內的衛生。全程飼養流程、免疫程序及環境控制標準均按照廣東省地方標準《馬崗鵝肉鵝飼養管理技術規范》(DB44/T 1595—2015)進行。

1.2 試驗材料

PAMK購西安某園生物制劑廠,純度≥95%;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司;qPCR預混液購于康潤誠業生物科技有限公司;Western及IP細胞裂解液購于Beyotime公司;β-肌動蛋白(β-actin) antibody購于美國Proteintech Group公司;TLR4 antibody、髓樣分化因子88(MyD88) antibody、磷酸化核因子-κB(p-NF-κB-p65) antibody、TNF-α antibody、IL-6 antibody、NLRP3 antibody、Caspase-1 antibody購于萬類生物科技有限公司;Trizol購于美國Ambion公司;DAO比色法試劑盒、D-乳酸比色法試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 試驗設計及樣品采集

240只健康的、精神狀態良好的1日齡馬崗鵝雛鵝(公母各占1/2)隨機分成4組,每組6個重復,每個重復10只雛鵝,各重復之間體重差異不顯著(P>0.05)。對照組和LPS組飼喂基礎飼糧,PAMK組和PAMK+LPS組飼喂含有400 mg/kg PAMK的基礎飼糧[18]。在21日齡時,給LPS組和PAMK+LPS組的雛鵝腹腔注射5 mg/kg BW LPS,對照組和PAMK組腹腔注射1 mL/kg BW生理鹽水[18]。

于21日齡注射LPS或生理鹽水后的第12個小時,將雛鵝宰殺取樣。從心臟中采集血液樣品,于37 ℃放置30 min,3 000 r/min離心后收集上清液,保存于-80 ℃冰箱。隨后宰殺取樣,切取十二指腸1.5 cm的中部腸段,保存于10%中性福爾馬林固定液中;再切取同樣長度的十二指腸沖洗腸道內容物后置于液氮中保存,隨后保存于-80 ℃冰箱。

1.4 指標測定

1.4.1 雛鵝腸道絨毛高度、隱窩深度、絨隱比和杯狀細胞數量的檢測

取試驗鵝十二指腸中間的1.5 cm腸段,放置于10%中性福爾馬林固定液中,隨后組織脫水、透明、浸鈉、包埋、切片、烤片、切片脫鈉,用PAS染色法處理切片,在光學顯微鏡下觀察腸道組織形態,統計杯狀細胞數量,絨毛高度和隱窩深度通過明美顯微數碼測量分析系統進行測量。

1.4.2 雛鵝血清D-乳酸含量和DAO活性的檢測

嚴格按照說明書的步驟,通過D-乳酸比色法測試盒和DAO比色法測試盒分別檢測血清D-乳酸含量和DAO活性。

1.4.3 雛鵝十二指腸腸道緊密連接蛋白、黏附連接蛋白、黏蛋白、炎性細胞因子和炎癥通路相關基因的檢測

用Trizol法提取十二指腸的總RNA。用超微量分光光度計在260和280 nm處檢測RNA的純度和濃度,并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用TaKaRa反轉錄試劑盒,按照說明書對RNA進行反轉錄。用Gen Star qPCR預混液和7500實時熒光定量PCR儀進行熒光定量?？偡磻w系為20 μL:2× RealStar Fast SYBR gPCR Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 8 μL,cDNA模板 1 μL。反應條件設定:50 ℃ 預變性2 min,95 ℃ 10 min,1個循環;95 ℃ 15 s,60 ℃退火1 min,40個循環。本試驗以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參基因,用2-ΔΔCt法計算Occludin、ZO-1、閉鎖小帶蛋白-2(ZO-2)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-連環蛋白(α-catenin)、β-連環蛋白(β-catenin)、連接黏附分子(JAM)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)基因相對表達量。通過NCBI自行設計熒光定量的引物序列,并由生工生物工程技術服務有限公司合成相關基因的引物,引物序列見表1。

1.4.4 雛鵝腸道炎性細胞因子和炎癥通路相關蛋白的檢測

以β-actin為內參蛋白,采用蛋白質免疫印跡(Western-bolt)方法檢測腸道炎癥通路相關蛋白(TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、Caspase-1)和炎性細胞因子(TNF-α、IL-6)的蛋白表達水平。提取十二指腸的細胞蛋白,用BCA法測定總蛋白濃度,加入聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液后進行加熱變性,蛋白上樣量50 g,上層膠恒壓80 V電泳20 min,濃縮膠恒壓120 V電泳60 min。電泳結束后將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜(PVDF),用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜,磷酸緩沖液-0.1%吐溫洗滌緩沖液(PBST)洗3次,每次10 min。二抗室溫孵育1 h,PBST洗5次,每次3 min。增強化學發光(ECL)試劑盒顯色,將膜置于化學發光儀中進行曝光,拍照并保存。采用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析。

1.5 數據處理與統計分析

數據采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析,隨后用Tukey法進行多重比較。數據以平均值和均值標準差表示。GraphPad Prism 5.0被用來將數據可視化。P<0.05代表統計分析差異有顯著性。

2 結 果

2.1 PAMK對LPS處理下雛鵝腸道機械屏障的影響

2.1.1 PAMK對LPS處理下雛鵝十二指腸組織形態學的影響

如圖1所示,與對照組相比,PAMK組和PAMK+LPS組雛鵝十二指腸絨毛長度、隱窩深度、絨隱比沒有顯著差異(P>0.05);LPS組雛鵝十二指腸絨毛長度顯著減小(P<0.05),隱窩深度顯著增大(P<0.05),絨隱比顯著變小(P<0.05)。與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中絨毛長度和絨隱比顯著增大(P<0.05),隱窩深度顯著變小(P<0.05)。

A～D分別表示對照組、PAMK組、LPS組、PAMK+LPS組的十二指腸PAS染色結果;E～G中數據柱標注相同字母或者無字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.1.2 PAMK對LPS處理下十二指腸緊密連接蛋白相關基因表達的影響

如圖2所示,與對照組相比,PAMK組雛鵝十二指腸中Occludin、ZO-1、ZO-2、E-cadherin、α-catenin、β-catenin、JAM、MLCK的基因相對表達量無顯著差異(P>0.05);LPS組雛鵝十二指腸中β-catenin、JAM的基因相對表達量顯著下調(P<0.05),雛鵝十二指腸中Occludin、ZO-1、ZO-2、E-cadherin、α-catenin、MLCK的基因相對表達量無顯著變化(P>0.05)。

圖2 PAMK對LPS處理下雛鵝十二指腸緊密連接蛋白相關基因表達的影響

與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中Occludin、β-catenin、JAM的基因相對表達量顯著上調(P<0.05),但是ZO-1、ZO-2、α-catenin、MLCK的基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

2.1.3 PAMK對LPS處理下雛鵝血清D-乳酸含量、DAO活性的影響

如圖3所示,與對照組相比,PAMK組雛鵝血清中D-乳酸含量和DAO活性無顯著變化(P>0.05);LPS組雛鵝血清中DAO活性顯著上調(P<0.05)。與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝血清中D-乳酸含量顯著下調(P<0.05)。

圖3 PAMK對LPS處理下雛鵝血清DAO活性和D-乳酸含量的影響

2.2 PAMK對LPS處理下十二指腸化學屏障相關指標的影響

由圖1-A～圖1-D和圖4-A所示,與對照組相比,PAMK組雛鵝十二指腸中杯狀細胞數量無顯著變化(P>0.05);LPS組雛鵝十二指腸中杯狀細胞數量則顯著減少(P<0.05),PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中杯狀細胞數量無顯著變化(P>0.05)。與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中杯狀細胞數量顯著增加(P<0.05)。

圖4 PAMK對LPS處理下雛鵝十二指腸杯狀細胞數量和化學屏障相關基因表達的影響

由圖4-B～圖4-C所示,與對照組相比,PAMK組雛鵝十二指腸中MUC-1和MUC-2的基因相對表達量無顯著變化(P>0.05);LPS組雛鵝十二指腸中MUC-2的基因相對表達量顯著減少(P<0.05),MUC-1的基因相對表達量沒有顯著差異(P>0.05)。與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中MUC-2的基因相對表達量顯著上調(P<0.05),MUC-1的基因相對表達量沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3 PAMK對LPS處理下雛鵝腸道免疫屏障的影響

2.3.1 PAMK對LPS處理下十二指腸炎性細胞因子相關基因和蛋白表達的影響

如圖5-A～圖5-B所示,與對照組相比,LPS組雛鵝十二指腸中TNF-α、IL-6的基因相對表達量顯著上調(P<0.05);PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中TNF-α、IL-6的基因相對表達量顯著下調(P<0.05)。與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中TNF-α、IL-6的基因相對表達量顯著下調(P<0.05)。

圖5 PAMK對LPS處理下雛鵝十二指腸炎性細胞因子基因和蛋白表達的影響

如圖5-C～圖5-E所示,與對照組相比,PAMK組雛鵝十二指腸中TNF-α、IL-6的蛋白表達水平沒有顯著變化(P>0.05);LPS組雛鵝十二指腸中IL-6、TNF-α的蛋白表達水平在統計學上沒有顯著性差異(P>0.05);PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中TNF-α、IL-6的蛋白表達水平無顯著變化(P>0.05)。與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中TNF-α、IL-6的蛋白表達水平在統計學上沒有顯著性差異(P>0.05)。

2.3.2 PAMK對LPS處理下十二指腸炎性信號通路關鍵基因表達的影響

由圖6所示,與對照組相比,PAMK組雛鵝十二指腸中TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、Caspase-1的基因相對表達量沒有顯著變化(P>0.05);而LPS組雛鵝十二指腸中TLR4、NLRP3、Caspase-1的基因相對表達量顯著上調(P<0.05);PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、Caspase-1的基因相對表達量無顯著差異(P>0.05)。

圖6 PAMK對LPS處理下雛鵝十二指腸炎性信號通路關鍵基因表達的影響

與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中TLR4、NLRP3、Caspase-1的基因相對表達量顯著下調(P<0.05),但是MyD88、NF-κB的基因相對表達量在統計學上沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3.3 PAMK對LPS處理下十二指腸炎性信號通路關鍵蛋白表達的影響

由圖7所示,與對照組相比,PAMK組雛鵝十二指腸中TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、Caspase-1的蛋白表達水平沒有顯著差異(P>0.05);而LPS組雛鵝十二指腸中MyD88、Caspase-1的蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)。與LPS組相比,PAMK+LPS組雛鵝十二指腸中MyD88、Caspase-1的蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)。

3 討 論

十二指腸連接著幽門,承接來自胃內經過初步消化的食糜并將其進一步消化。因此,針對十二指腸的研究大多集中于消化過程。然而,十二指腸除了是消化器官外,其腸黏膜具有多種防御機制,可保護自身免受氧化應激引起的損傷、幽門螺桿菌引起的感染誘發損傷、缺血和再灌注損傷以及藥物誘導損傷[19]。此外,十二指腸黏膜的固有層容納了大量免疫系統的移居細胞和常駐細胞,如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞等[20-21]。病原感染或者生物毒素的侵入除了能夠導致十二指腸消化功能失常,還可能會引起十二指腸腸道屏障損傷。因此,保護十二指腸腸道屏障對于維持正常的胃腸道功能和腸道的免疫平衡是至關重要的。

3.1 PAMK對LPS處理下雛鵝腸道機械屏障的影響

腸道形態是評估腸道屏障完整性、腸道健康和腸道消化吸收能力的重要指標,指標包括:絨毛長度、隱窩深度和絨隱比[22]。Wang等[23]用LPS處理小鼠后,回腸、空腸、十二指腸的絨毛高度分別是正常小鼠的33.44%、40.57%和34.98%,回腸、空腸、十二指腸的絨隱比分別是正常小鼠的47.02%、59.34%、49.42%。Xie等[24]為北京鴨腹腔注射LPS,破壞了鴨空腸的形態結構,降低了鴨空腸的絨毛高度、絨隱比,增加了隱窩深度。本試驗同樣發現LPS對雛鵝腸道形態有損傷作用。與對照組相比,LPS處理下雛鵝十二指腸絨毛高度顯著降低,隱窩深度顯著升高,絨隱比顯著降低。提示LPS可以破壞雛鵝正常的十二指腸腸道形態,這將會影響腸道對營養物質的消化吸收水平,降低其生長性能。通過在飼糧中添加PAMK可以修復LPS處理下的雛鵝病變腸道形態,增加十二指腸絨毛高度,減小隱窩深度,增大絨隱比,提示PAMK能維持LPS處理下雛鵝腸道絨毛的正常形態結構。

腸道黏膜屏障不僅可以調節水、離子、溶質的載體運輸,還可以防止病原體、抗原和毒素進入腸道組織,在維持腸道環境平衡方面發揮著重要作用[25]。機械屏障是腸黏膜屏障的一個重要組成部分,而細胞之間緊密連接及其下面的黏附連接、橋粒在保持腸道機械屏障完整性方面發揮著重要作用,緊密連接蛋白和黏附連接蛋白水平的降低通常與上皮屏障功能障礙有關[26-27]。D-乳酸由腸道中的細菌發酵產生,DAO是存在于腸上皮細胞中的細胞內酶,完整的腸黏膜屏障可以阻止D-乳酸、DAO進入門靜脈循環。但隨著腸道屏障的破壞,它們可以經過上皮黏膜進入血液循環系統進而導致血漿中D-乳酸含量和DAO活性的增加,因此它們也成為了評估機械屏障功能的指標之一[28]。LPS不僅改變正常的腸道形態,還會破壞腸道機械屏障。LPS的處理會減少仔豬回腸中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的表達,增加仔豬血清中DAO活性[29];增加肉雞血清中D-乳酸含量和DAO活性[30]。本試驗用LPS處理雛鵝得到了相似的結果,雛鵝在LPS的刺激下,十二指腸緊密連接蛋白和黏附連接蛋白的基因表達有不同程度的減少,血清中D-乳酸含量增多,DAO活性增強,說明LPS破壞了雛鵝腸道上皮細胞間的連接,破壞了機械屏障,增加了腸道黏膜的通透性。雛鵝在PAMK的保護作用下,能夠增加LPS處理下十二指腸中緊密連接蛋白和黏附連接蛋白的基因表達,減少血清中D-乳酸含量和DAO活性。這提示PAMK對雛鵝腸道的機械屏障功能有一定的保護和修復作用,減少腸道通透性,能有效幫助腸道阻擋外界病原、抗原等有害物質的入侵。

有文獻報道,LPS的處理引起TLR4信號級聯激活,粘著斑激酶(FAK)、MyD88、白細胞介素-1受體相關激酶4(IRAK4)的激活破壞了腸道屏障功能,增加了腸道通透性,而TLR4-/-和MyD88-/-小鼠在LPS刺激下并沒有發生腸炎,腸道通透性也沒有增加,說明TLR4/FAK/MyD88信號轉導軸在調節LPS誘導的腸炎和腸道通透性增加中起著重要作用[31]。而本試驗中PAMK能夠抑制LPS處理下雛鵝十二指腸腸道TLR4/MyD88/NF-κB炎性信號通路的激活,這可能是PAMK能緩解LPS處理下雛鵝腸道機械屏障損傷的原因。

3.2 PAMK對LPS處理下雛鵝腸道化學屏障的影響

杯狀細胞和黏液層對腸道防御和穩態有關鍵作用,黏蛋白是杯狀細胞的主要分泌產物,負責形成黏液層,構建腸道化學屏障,為腸道微生物群提供黏附位點的同時,還能阻止病原體的入侵和定植,杯狀細胞的異常分化和黏蛋白的合成分泌不足都能導致腸道化學屏障的功能障礙[32]。Lucke等[33]發現肉雞在1 mg/kg LPS的攻擊下減少了十二指腸中MUC-1、MUC-2的表達。LPS還能破壞腸道杯狀細胞的功能,細胞質中出現大量腫脹的溶酶體,導致MUC-1、MUC-2水平明顯下降[34]。在本試驗中,LPS的攻擊也會破壞雛鵝腸道化學屏障,十二指腸MUC-2的表達下調,十二指腸杯狀細胞的數量也明顯減少。這提示暴露于LPS會導致雛鵝腸道化學屏障的功能障礙。楊巨如[35]發現PAMK能夠逆轉由于失重導致的大鼠腸道黏膜屏障損傷,增加十二指腸和結腸中的杯狀細胞數量。在本試驗中同樣發現PAMK能夠逆轉LPS處理下雛鵝十二指腸MUC-2表達減少的情況,并增加十二指腸中杯狀細胞的數量,這提示PAMK在病理狀態下能夠維持雛鵝腸道化學屏障的結構和功能完整。

3.3 PAMK對LPS處理下雛鵝腸道免疫屏障的影響

LPS會被TLR4所識別、結合,通過依賴于MyD88或獨立于MyD88的信號級聯誘導絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB的活化,NF-κB是普遍存在的可誘導轉錄因子,不僅可以促進炎性細胞因子(TNF-α、IL-6)的表達,還能誘導NLRP3炎癥小體的組裝,通過Caspase-1介導IL-18、IL-1β的成熟;LPS的刺激同樣可以激活TLR2/NF-κB進而促進TNF-α、IL-6、IL-1β的產生,導致炎癥反應的發生[36-37]。LPS不僅會影響家禽的生產性能,誘導家禽發生免疫應激,促進血清、脾臟中炎性細胞因子的產生[30],還會引起家禽腸道組織炎癥反應的發生,激活腸道中TLR4信號通路,誘導NF-κB、IκBα的磷酸化,促進TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的釋放[38]。而腸道炎癥與腸道功能屏障息息相關,腸炎往往導致會腸道黏膜屏障的破壞[39]。本試驗發現,雛鵝在LPS刺激下,激活十二指腸中TLR4/MyD88/NF-κB和NLRP3-Caspase-1炎性信號通路,導致了十二指腸中炎性細胞因子TNF-α、IL-6的過度釋放。炎性信號通路的激活和炎性細胞因子的釋放提示LPS激活了腸道免疫屏障,導致了炎癥反應,并可能因此發生了炎性損傷。而在PAMK的保護下,有效抑制雛鵝十二指腸TLR4/MyD88/NF-κB和NLRP3/Caspase-1炎性信號通路的激活,減少炎性細胞因子TNF-α、IL-6的過度釋放,提示PAMK能夠緩解由LPS激活的雛鵝腸道炎癥反應,對雛鵝腸道免疫屏障的維持發揮著重要的作用。

4 結 論

外源性的LPS導致了雛鵝十二指腸的機械屏障、化學屏障和免疫屏障失常,而在飼糧中添加400 mg/kg PAMK后能夠緩解LPS處理下導致的雛鵝十二指腸腸道屏障損傷。