呼倫貝爾羊不同生長階段瘤胃微生物變化與羊肉膻味相關微生物分析

趙燁嬋 歐慧敏 譚支良 焦金真*

(1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所,亞熱帶農業生態過程重點實驗室,畜禽養殖污染控制與資源化技術國家工程實驗室,湖南省動物營養生理與代謝過程重點實驗室,長沙 410125;2.中國科學院大學,北京 100049)

羊肉作為一種優質的蛋白質來源,以其營養豐富、肉質鮮美和獨特風味深受消費者的喜愛[1]。作為養羊大國,我國的羊肉生產與消費一直處于世界首位,且近5年來國內產能及消費規模均保持著穩步增長的態勢,2022年存欄量更是超過32億只[2],但年人均消費量僅有3.6 kg,造成存欄量與人均消費量不匹配的原因是部分消費者無法接受羊肉所具有的特殊膻味[3]。因此,降低羊肉中的膻味將提升消費者對羊肉品質的接受度,進而提升其對羊肉的購買力。

眾多研究結果顯示,分布在不同脂肪組織的3種揮發性支鏈脂肪酸是羊肉特殊膻味的主要貢獻者[4],包括4-甲基辛酸(4-methyloctanoic acid,MOA)、4-乙基辛酸(4-ethyloctanoic acid,EOA)和4-甲基壬酸(4-methylnonanoic acid,MNA)。這3種膻味脂肪酸微小的含量變化對羊肉膻味強弱有極大的影響[5],其含量與動物的年齡等因素有關。Gravador等[6]研究結果顯示,293日齡綿羊皮下脂肪中的MOA和MNA含量是196日齡的3倍。本團隊前期的研究結果也表明,呼倫貝爾羊背部皮下脂肪組織、腸系膜和腎周脂肪組織中的MOA、EOA及MNA的含量均隨日齡增長而不斷增加,各部位的膻味脂肪酸含量從斷奶期(2.5月齡)到育肥中期(5月齡)有3～10倍的增加[7],提示此時期是羊肉中膻味脂肪酸大量沉積的關鍵生理時期。

瘤胃微生物參與反芻動物體內70%營養物質的分解代謝,通過其強大的酶系功能成為機體三大營養素代謝的重要參與者[8]。有報道稱,瘤胃微生物與羊肉中的氨基酸及膻味脂肪酸等風味物質的沉積有關,風味氨基酸大多來自于菌體蛋白質以及瘤胃微生物對蛋白質原料的分解[9];瘤胃微生物生成的揮發性脂肪酸(VFA)在為機體供能的同時也為膻味脂肪酸的合成提供了短碳鏈[10]。由此可以推測,膻味脂肪酸在機體中的沉積規律可能與瘤胃微生物群落的定植有關,且羔羊生長發育過程中瘤胃微生物群落的重大改變同樣值得關注[11]。本研究以呼倫貝爾羊各生長階段間的瘤胃微生物變化為切入點,首先明確其定植規律,進而探尋其與羊肉膻味脂肪酸含量間的相關性,旨在尋找降低羊肉膻味的微生物靶點,并為下一步制定改善羊肉膻味的策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養管理

本試驗選取體況良好、初生體重[(3.63±0.46) kg]近似的新生呼倫貝爾羊32只,按照生長階段(新生期、斷奶期、育肥中期、育肥后期)分為4個處理,每個處理8只(公母各占1/2)。新生期羔羊在出生后1～2 d內屠宰采集樣品,其余3組羔羊跟隨母羊生活,自由吮乳,于6周齡起每日在08:00及16:00 2個時間段單獨進入補飼欄內補飼固體開食料,直至2月齡斷奶。羔羊斷奶后單籠飼養,2～3月齡飼喂固體開食料,斷奶期羔羊在2.5月齡屠宰采樣。育肥期羊在3～6月齡飼喂育肥料,其中育肥中期于5月齡屠宰采樣,育肥后期于6月齡屠宰采樣[7]。開食料及育肥料組成及營養水平見表1。動物試驗總飼養時長180 d,于2021年4～10月在內蒙古自治區呼倫貝爾鄂溫克旗中國科學院草牧業工程試驗站開展,本試驗的所有程序遵循《實驗動物管理與使用指南》要求,試驗動物的使用經中國科學院亞熱帶農業生態研究所動物倫理委員會批準。

表1 開食料及育肥料組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 試驗樣品采集與保存

4個處理分別在對應采樣節點進行屠宰采樣,宰前禁食24 h,禁水2 h。背部皮下脂肪組織樣品的采集和保存參考本團隊之前的方法[7];屠宰后采集經4層無菌紗布過濾后的瘤胃液樣品及瘤胃內容物樣品于10 mL離心管中,投入裝有液氮的泡沫箱暫存,后移入-80 ℃超低溫冰箱中冷凍保存。

1.3 主要試劑與儀器設備

VFA標準溶液:乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸標準品(Sigma公司,色譜純);偏磷酸(中國醫藥集團有限公司,分析純);SENO糞便基因組DNA提取試劑盒(賽諾生物科技有限公司,SN0240);AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,美國)。

氣相色譜儀(GC,Agilent-7890,美國);紫外可見光分光光度計(UV2450,天美科學儀器有限公司);超微量紫外分光光度計(Thermo Nano Drop-2000);0.22 μm濾膜(希波氏,天津市富集科技有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 飼糧營養水平的測定

干物質(DM)含量根據GB/T 6435—2006測定,粗蛋白質(CP)含量根據GB/T 6432—1994測定,中性洗滌纖維(NDF)含量根據GB/T 20806—2006測定,酸性洗滌纖維(ADF)含量根據NY/T 1459—2007測定。代謝能(ME)計算公式如下:

代謝能(MJ/kg)=∑(A×B)。

式中:A為某種飼糧原料的代謝能(MJ/kg);B為該飼糧原料占飼糧的百分比(%);代謝能為所有飼糧原料的代謝能與其占飼糧的百分比的乘積之和。

1.4.2 瘤胃液VFA含量的測定

取適量樣品稀釋后加入25%偏磷酸溶液固定,經0.22 μm濾膜過濾至上樣瓶,利用氣相色譜儀參照Wang等[12]的方法進行檢測。

1.4.3 瘤胃內容物16S rDNA的測序

1.4.3.1 內容物總DNA的提取及質量檢測

利用SENO糞便基因組DNA提取試劑盒提取瘤胃微生物總DNA,用超微量紫外分光光度計檢測A260/A280值,使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,以檢測提取DNA的完整性和純度。

1.4.3.2 PCR擴增及質量檢測

采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACCTTGTTACGACTT-3′)對16S rDNA基因的V1～V9區進行PCR擴增。PCR反應程序為:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共27個循環;72 ℃終末延伸5 min。反應體系為:5×Fast Pfu Buffer 4.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL,上、下游引物(5 mmol/L)各0.8 μL,Fast Pfu Polymerase 0.4 μL,模板DNA 10 ng。使用2%瓊脂糖凝膠電泳來分離提取相對應片段大小的PCR產物,并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒純化。最后使用上海凌恩生物科技有限公司的PacBio Sequel Ⅱe平臺測序。

1.4.3.3 生物信息數據處理

PacBio數據下機后,使用儀器自帶的SMRTLINK 9.0軟件進行一致性CCS序列(circular consensus sequencing)的獲得。原始讀取數據通過SMRT Portal進行質量控制,對包含10個連續相同堿基的序列進行過濾,并去除Barcode和引物序列。

對得到的序列使用UPARSE 7.1軟件(http://drive5.com/uparse/)[13]以99%的相似度對操作分類單元(OTU)進行聚類,并使用UCHIME識別和去除嵌合序列[14]。采用RDP classifier貝葉斯算法(http://rdp.cme.msu.edu/)與Silva數據庫(SSU132)比對,根據OTU代表序列進行分類注釋,置信閾值為70%。

微生物α多樣性的分析基于Mothur 1.21.1[15],使用OTU數目、Chao1指數及ACE指數反映微生物物種豐富度;用Shannon指數及Simpson指數反映微生物物種多樣性;用覆蓋率反映測序情況是否能說明樣品真實情況。β多樣性分析使用基于Bray-Curtis距離的主坐標分析(PCoA)。

將LefSE分析篩選出的標志性差異菌種相對豐度與本團隊之前研究中所測定呼倫貝爾羊背部皮下脂肪的3種膻味脂肪酸含量[7]進行相關性分析,使用R 4.3.0軟件psych包,進行斯皮爾曼(Spearman)相關系數(r)計算,r>0.5為正相關、r<-0.5為負相關,P<0.05作為相關性顯著判斷標準,應用R 4.3.0軟件corrplot包,對矩陣基于歐幾里德距離,按行以最長距離法進行層次聚類并繪圖展示。

1.5 數據處理與統計分析

試驗數據使用Excel 2016進行整理,采用SPSS 22.0統計軟件one-way ANOVA程序進行單因素方差分析,差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較檢驗,以P<0.05為差異顯著。α多樣性指數、微生物的門、屬及種水平的相對豐度差異采用SPSS 22.0統計軟件非參數Kruskal-Wallis檢驗分析,使用Duncan氏法進行多重比較,以P<0.05為差異顯著;β多樣性使用Adonis多因素方差分析評估不同生長階段之間的差異,以P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同階段呼倫貝爾羊瘤胃VFA含量的變化

由表2可知,瘤胃液TVFA含量在新生期僅為11.27 mmol/L,與新生期相比,斷奶期TVFA含量顯著升高(P<0.05),育肥中期相較于新生期及斷奶期均顯著升高(P<0.05),育肥后期相較于育肥中期顯著降低(P<0.05)。與新生期相比,斷奶期乙酸摩爾比例顯著下降(P<0.05),之后保持相對穩定;丙酸摩爾比例在育肥中期之前的變化很小,育肥后期較斷奶期顯著提升(P<0.05);斷奶期的乙丙比顯著低于其他3個階段(P<0.05)。斷奶期丁酸摩爾比例較新生期顯著升高(P<0.05),育肥中期相較于斷奶期有顯著升高(P<0.05)。異丁酸、戊酸和異戊酸的摩爾比例均在斷奶期最高,顯著高于育肥期(P<0.05)。

表2 不同生長階段呼倫貝爾羊瘤胃VFA含量

2.2 不同階段呼倫貝爾羊瘤胃微生物多樣性

2.2.1 不同階段呼倫貝爾羊瘤胃微生物的α多樣性

由表3可知,表征物種豐富度的3個指數(OTU數目、Chao1和ACE指數)在斷奶期比新生期顯著上升(P<0.05),在育肥后期比育肥中期顯著上升(P<0.05),此變化規律表明瘤胃微生物物種隨日齡增長而逐漸豐富。值得注意的是,反映多樣性的Shannon指數在斷奶期相較于新生期有顯著提升(P<0.05),而Simpson指數這一時期顯著下降(P<0.05),均提示瘤胃微生物的多樣性在新生期至斷奶期顯著增加。4個生長階段的覆蓋率都大于97%,測序結果能較好地反映微生物真實情況。

表3 不同生長階段呼倫貝爾羊瘤胃微生物的α多樣性

2.2.2 不同階段呼倫貝爾羊瘤胃微生物的β多樣性

如圖1所示,PCoA結果顯示不同生長階段的瘤胃微生物群落結構在主坐標系上有明顯的分離,經Adonis檢驗差異顯著(P<0.05),經配對Adonis檢驗得出每2個處理間都存在顯著差異(P<0.05)。以上結果表明不同生長階段間瘤胃微生物群落結構不同。

*表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。*indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

2.3 不同階段呼倫貝爾羊瘤胃微生物群落組成

如圖2-A所示,在相對豐度排在前15位的門中,厚壁菌門(Firmicutes,45.01%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,43.14%)和變形菌門(Proteobacteria,5.28%)的相對豐度在各生長階段均排前3位。擬桿菌門及變形菌門相對豐度均呈現隨日齡增長而降低的變化規律,其中變形菌門相對豐度在新生期高達21.31%,至斷奶期(1.84%)顯著降低(P<0.05),隨后相對穩定;擬桿菌門相對豐度在育肥中期(42.55%)較新生期(49.89%)無顯著變化(P>0.05),育肥后期(37.10%)較育肥中期顯著降低(P<0.05)。厚壁菌門相對豐度的變化規律恰恰相反,新生期(21.51%)相對豐度最低,斷奶期相對豐度(50.42%)較新生期顯著提升(P<0.05),隨后保持相對穩定?；ヰB菌門(Synergistetes)相對豐度的變化呈現隨日齡增長而降低的變化規律;放線菌門(Actinobacteria)、螺旋菌門(Spirochaetota)及纖維桿菌門(Fibrobacteres)的相對豐度隨日齡增長而顯著升高(P<0.05)。

當時，我給這個戲乃至我們這個創作團隊的定位就是——堅實的現實主義表演與中國戲曲傳統程式美相融合；堅定的表現美學與中國戲曲寫意美學相融合。

A:門水平 phylum level;B:屬水平 genus level;C:種水平 species level。Firmicutes:厚壁菌門;Bacteroidota:擬桿菌門;Proteobacteria:變形菌門;Synergistetes:互養菌門;Actinobacteria:放線菌門;Spirochaetota:螺旋菌門;Fibrobacteres:纖維桿菌門;Planctomycetes:浮霉菌門;Acidobacteria:酸桿菌門;Tenericutes:軟壁菌門;Lentisphaerae:黏膠球形菌門;Verrucomicrobia:疣微菌門;Others:其他;Prevotella:普雷沃氏菌屬;Christensenella:克里斯滕森菌屬;Butyrivibrio:丁酸弧菌屬;Bacteroides:擬桿菌屬;Comamonas:叢毛單胞菌屬;Selenomonas:月形單胞菌屬;Saccharofermentans:產乙酸糖發酵菌屬;Mitsuokella:光岡菌屬;Paraprevotella:帕拉普氏菌屬;Succiniclasticum:解琥珀酸菌屬;Ruminococcus:瘤胃球菌屬;Prevotella_uncultured rumen bacterium:普雷沃氏菌屬未培養瘤胃細菌;Prevotella ruminicola:棲瘤胃普雷沃氏菌;Prevotella sp002251295:普雷沃氏菌屬sp002251295;Saccharofermentans sp003149065:產乙酸糖發酵菌屬sp003149065; Succiniclasticum_uncultured rumen bacterium:解琥珀酸菌屬未培養瘤胃細菌;Mitsuokella multacida:多酸光崗菌;Paraprevotella sp003477995:帕拉普氏菌屬sp003477995; Paraprevotella_uncultured rumen bacterium:帕拉普氏菌屬未培養瘤胃細菌。

如圖2-B所示,前14個屬中有12個屬的相對豐度在各生長階段間有顯著差異(P<0.05)。擬桿菌屬(Bacteroides,14.47%)、叢毛單胞菌屬(Comamona,14.64%)及Lentimicrobium(8.81%)在新生期相對豐度最高,其相對豐度呈現隨日齡增長而顯著下降的變化規律(P<0.05)。普雷沃氏菌屬(Prevotella)、光岡菌屬(Mitsuokella)及月形單胞菌屬(Selenomonas)的相對豐度在新生期～斷奶期并無顯著差異(P>0.05),至育肥中期相對豐度較新生期有顯著提升(P<0.05)。丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、Sodaliphilus、帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)、解琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)及瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的相對豐度在新生期均小于1.00%,斷奶期相對于新生期顯著上升(P<0.05),此后無顯著變化(P>0.05)。產乙酸糖發酵菌屬(Saccharofermentans)的相對豐度也呈現隨日齡增長而上升的變化規律,斷奶期相較于新生期及育肥后期相較于育肥中期均有顯著升高(P<0.05)。

在種水平上(圖2-C),前19個菌種的相對豐度在各生長階段間均有顯著差異(P<0.05)。在新生期相對豐度最高的6個優勢菌種Comamonaskerstersii(13.39%)、Lentimicrobiumsaccharophilum(8.80%)、Bacteroidespyogenes(8.30%)、Prevotellamassiliasp002933955(6.14%)、Duncaniellamuris(3.94%)及Christensenellamassiliensis(3.47%)的相對豐度均是新生期相比于斷奶期顯著下降(P<0.05),在之后的階段一直保持在1.00%以下的穩定水平。棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)、Selenomonassputigena及多酸光崗菌(Mitsuokellamultacida)的相對豐度在斷奶期相較于新生期無顯著差異(P>0.05),而育肥中期較斷奶期相對豐度顯著上升(P<0.05),隨后保持相對穩定。產乙酸糖發酵菌屬sp003149065(Saccharofermentanssp003149065)、Sodaliphiluspleomorphus、解琥珀酸菌屬未培養瘤胃細菌(Succiniclasticum_uncultured rumen bacterium)、帕拉普氏菌屬sp003477995 (Paraprevotellasp003477995)、帕拉普氏菌屬未培養瘤胃細菌(Paraprevotella_uncultured rumen bacterium)及Christensenellahongkongensis的相對豐度變化規律均是隨日齡增長而上升,其中產乙酸糖發酵菌屬sp003149065的相對豐度在斷奶期相較于新生期及育肥后期相較于育肥中期均有顯著提升(P<0.05),其余6個菌種的相對豐度在斷奶期比新生期均顯著上升(P<0.05),隨后保持穩定。

2.4 不同生長階段呼倫貝爾羊瘤胃標志性差異菌群

如圖3所示的LefSE分析結果在屬、種水平分別篩選出15、19個不同生長階段間的瘤胃標志性差異菌群。屬水平上(圖3-A),以擬桿菌屬、瘤胃球菌屬為代表的12個標志性差異菌屬均在2.3中進行過分析,其相對豐度較高且在各生長階段間有顯著差異。值得注意的是,未在2.3所分析過的腸單胞菌屬(Intestinimonas)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)及卟琳單胞菌屬(Porphyromonas)均是在新生期顯著富集(P<0.05,LDA>4)。種水平上(圖3-B),以棲瘤胃普雷沃菌、Sodaliphiluspleomorphus、產乙酸糖發酵菌屬sp003149065為代表的14個標志性差異菌種相對豐度的顯著變化與2.3中結果相吻合。值得關注的是解肝素擬桿菌(Bacteroidesheparinolyticus)、牙髓卟啉單胞菌(Porphyromonasendodontalis)、普雷沃氏菌屬sp002298815(Prevotellasp002298815)、Bacteroidespyogenes_A及Desulfovibriopiger_A 5個未在2.3分析過的菌種均在新生期顯著富集(P<0.05,LDA>4)。

A:屬水平 genus level;B.種水平 species level。g_Comamonas:叢毛單胞菌屬;g_Bacteroides:擬桿菌屬; g_Porphyromonas:卟琳單胞菌屬;g_Intestinimonas:腸單胞菌屬;g_Desulfovibrioi:脫硫弧菌屬;g_Ruminococcus:瘤胃球菌屬;g_Paraprevotella:帕拉普氏菌屬;g_Prevotella:普雷沃氏菌屬;g_Mitsuokella:光岡菌屬;g_Selenomonas:月形單胞菌屬;g_Saccharofermentans:產乙酸糖發酵菌屬;g_Butyrivibrio:丁酸弧菌屬;g_Succiniclasticum:解琥珀酸菌屬; s_Bacteroides heparinolyticus:解肝素擬桿菌; s_Porphyromonas endodontalis:牙髓卟啉單胞菌;s_Prevotella sp002298815:普雷沃氏菌屬sp002298815; s_Prevotella uncultured rumen bacterium:普雷沃氏菌屬未培養瘤胃細菌;s_Prevotella ruminicola:棲瘤胃普雷沃氏菌; s_Mitsuokella multacida:多酸光崗菌;s_Prevotella sp002251295:普雷沃氏菌屬sp002251295;s_Saccharofermentans sp003149065:產乙酸糖發酵菌屬sp003149065 s_Succiniclasticum uncultured rumen bacterium:解琥珀酸菌屬未培養瘤胃細菌。

2.5 膻味脂肪酸含量與瘤胃差異微生物的相關性分析

不同生長階段呼倫貝爾羊背部皮下脂肪膻味脂肪 MOA、EOA和MNA含量數據來自本團隊之前的研究[7]?？傮w來說,3種膻味脂肪酸的含量隨日齡增長而顯著升高,且在斷奶期～育肥期增長速率最快。如圖4所示,相關性聚類分析共篩選出15個與膻味脂肪酸含量顯著相關的標志性差異菌種,聚為2大類:解肝素擬桿菌、牙髓卟啉單胞菌及Prevotellamassiliasp002933955等11個菌種與膻味脂肪酸含量呈顯著的負相關(P<0.05,r<-0.5);而顯著正相關(P<0.05,r>0.5)的菌種則僅篩選出普雷沃氏菌屬未培養瘤胃細菌(Prevotella_uncultured rumen bacterium)、棲瘤胃普雷沃菌、產乙酸糖發酵菌屬sp003149065及多酸光崗菌4種。

*:P<0.05;**:P<0.01;r value:相關系數 relative coefficient。

3 討 論

3.1 不同生長階段瘤胃內VFA含量的變化分析

反芻動物的瘤胃微生物發酵飼料生成VFA,為機體提供了超過75%的能量[8],同時未被機體利用的短鏈脂肪酸也為合成肌肉及脂肪組織中的膻味脂肪酸提供短碳鏈[17]。隨著羊的生長發育,瘤胃功能逐漸趨于完善,發酵能力也有相對應的提升。

本試驗中,新生期羔羊瘤胃內VFA含量雖然總體較低,但可達到檢測限,這與王彩蓮等[18]及Abecia等[19]在出生后2～3 d的羔羊及犢牛中的發現結果一致,其可能的原因是羔羊在出生后1～2 d內隨母羊生活時有母乳進食,一些厭氧瘤胃微生物也隨之迅速定植[20],未發育的瘤胃也具有一定的消化及產生VFA的能力。有研究表明,瘤胃內TVFA含量會隨固體采食量的上升而增加[21]。本試驗結果顯示,瘤胃TVFA含量在新生期至育肥中期隨生長發育有持續的顯著上升,能夠解釋這一現象的可能原因除了瘤胃發酵能力的發育性變化之外,還有從母乳轉變為高蛋白質開食料又轉變為高碳水育肥料的飼糧結構的影響[22]。而解釋TVFA含量在育肥中期至育肥后期顯著下降的可能原因則是為了滿足機體快速育肥時需要大量能量,成熟的瘤胃具有快速吸收VFA進入血液循環的能力[23]。以上瘤胃TVFA含量的變化規律可以與前人在牛[24]及綿羊[25]上的試驗結果相印證。從瘤胃VFA的組成來看,在新生期之后呼倫爾羊瘤胃乙酸摩爾比例隨羊日齡增長而顯著降低,而丁酸和丙酸的摩爾比例分別在斷奶期及新生期之后顯著增加,說明隨著羊日齡的增長,瘤胃發酵逐漸趨向于產生更多丁酸及丙酸,解釋這一現象的可能原因一方面是羊飲食結構由母乳向開食料及育肥料的轉變[26],另一方面則是瘤胃微生物區系呈現發育性改變[11]。

3.2 不同生長階段瘤胃微生物微生物群落變化及差異分析

反芻動物的瘤胃微生物區系是一個復雜而功能強大的系統,能夠幫助機體降解飼料而從中獲得營養物質,并且還有調節機體的免疫反應、維持瘤胃內環境穩態等重要作用。本試驗的α多樣性結果顯示,瘤胃微生物豐富度和多樣性隨著呼倫貝爾羊的生長發育而增加,在斷奶期的增加最明顯,同時β多樣性的結果表明,每個發育階段的瘤胃具有其獨特的微生物?？赡艿脑蛞环矫媸秋暭Z的影響,即斷奶期羔羊的營養來源由母乳變為固體開食料,底物的改變可以直接影響瘤胃微生物的定殖和繁殖[26];另一方面則是由于新生期至斷奶期羔羊處于快速生長發育階段,受采食的刺激,瘤胃需要快速地消化吸收營養物質[27],導致瘤胃菌群多樣性顯著增加。

反芻動物瘤胃微生物群落隨年齡呈現發育性變化,且所有年齡階段的優勢菌門均為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門[28]。在本試驗中,厚壁菌門相對豐度在斷奶期突增,而變形菌門的變化規律與之相反;新生期羔羊瘤胃擬桿菌門占比達到50%,在斷奶期和育肥后期有所下降。本試驗中,斷奶期至育肥期羔羊的營養結構從高蛋白質轉變為高碳水化合物,這一底物的改變也可能導致了瘤胃優勢菌門相對豐度的改變。

在屬水平上,叢毛單胞菌屬、腸單胞菌屬等在新生期顯著富集,而在其后相對豐度顯著降低至接近0水平。前人研究發現,新生期羔羊瘤胃微生物區系中存在一些與母乳的消化或免疫功能相關的暫時性菌群,開食料的攝入及周圍環境微生物的進入促使羔羊瘤胃建立新的優勢菌群[29],與本試驗中這一結果相符。瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬、Sodaliphilu等的功能均與纖維降解[30]相關,其相對豐度在斷奶期顯著上升的可能原因是羔羊飼糧由母乳向含有粗纖維的固體飼料轉變而導致的微生物區系的適應性改變[31]。普雷沃氏菌屬作為反芻動物瘤胃中核心菌屬,在降解多糖和蛋白質的過程中都發揮著積極作用[32],其相對豐度在育肥期的顯著上升可能與此時期機體的快速育肥相關,其代謝產物為丙酸鹽及琥珀酸鹽等VFA前體物[33]也可解釋這一時期瘤胃TVFA含量的上升。據報道,光岡菌屬的發酵產物主要是乳酸鹽[34],而月形單胞菌屬可利用乳酸鹽為底物生成丙酸鹽[35],其相對豐度在育肥中期的顯著上升,或許可以解釋該時期丙酸摩爾比例顯著上升。這一結果與Koike等[36]在斷奶犢牛上發現,光岡菌屬相對豐度與瘤胃液丙酸摩爾比例呈顯著正相關相吻合。值得關注的還有產乙酸糖發酵菌屬,在多種碳水化合物的發酵過程中發揮著重要作用[37],其功能可以解釋其相對豐度在新生期至斷奶期和育肥中期至育肥后期的2次顯著上升。

在種水平上,棲瘤胃普雷沃氏菌及多酸光崗菌等相對豐度在育肥中期的顯著提升也與其功能有關。Nathani等[38]報道稱,棲瘤胃普雷沃氏菌不僅直接參與蛋白質和可溶性碳水化合物的降解,而且還通過與瘤胃球菌等纖維分解菌的協同作用加速纖維的分解。Luo等[39]研究發現,多酸光崗菌因其以乳酸鹽及乙酸鹽為發酵底物而生成丙酸鹽的功能特性,且其相對豐度與后腸段中丙酸鹽的含量呈顯著正相關。Selenomonassputigena在瘤胃中的主要作用是分解乳酸并轉化為VFA為宿主供能[40],LefSE結果表明其在育肥中期顯著富集,也與該時期機體所需大量能量相關。產乙酸糖發酵菌屬sp003149065、解琥珀酸菌屬未培養瘤胃細菌及帕拉普氏菌屬sp003477995等菌種功能尚不明確,仍需進一步探究。此外,值得注意的是LefSE結果顯示,解肝素擬桿菌作為一種潛在的母畜子宮蓄膿致病菌[41]在新生期瘤胃顯著富集,可能的原因是母體對新生羔羊的微生物垂直傳遞。綜上所述,瘤胃微生物群落整體呈現生長發育性變化,隨日齡增長,逐步由母乳消化相關的兼性厭氧菌轉變為碳水化合物發酵相關的嚴格厭氧菌。

3.3 膻味脂肪酸含量與瘤胃微生物的相關性分析

有研究表明,瘤胃微生物生成大量VFA,當其生成的丙酸鹽含量超過肝臟的糖異生能力時,丙酸鹽在轉化成琥珀酸的中間體甲基丙二酸會被脂肪組織利用,成為脂肪酸從頭合成途徑的底物,最終生成支鏈脂肪酸,其中就包括3種膻味脂肪酸[42]。與此同時,飼糧中支鏈氨基酸為膻味脂肪酸的合成提供支鏈碳鏈,可在瘤胃微生物分泌的脫氫酶及羧化酶等作用下,可進一步生成支鏈脂肪酸[43]。

本研究其中之一的目的就是篩選與膻味脂肪酸合成相關的瘤胃微生物種群。值得注意的是,普雷沃氏菌屬未培養瘤胃細菌和棲瘤胃普雷沃菌的相對豐度與膻味脂肪酸含量呈顯著正相關,且在育肥期相對豐度最高。以上菌均可利用多種底物,直接或間接生成大量VFA[39],結合此生長階段機體處于快速育肥,亟需合成、累積大量脂肪[44],可推測它們可能在膻味脂肪酸的合成通路上扮演重要角色。另一正相關菌種-產乙酸糖發酵菌屬sp003149065在育肥后期顯著富集,該菌種除了具有生成乙酸的功能還可能具有促進丁酸的生成的作用[37],此結果提示丁酸可能與膻味脂肪酸大量合成相關。有趣的是,多酸光崗菌相對豐度與丙酸鹽的大量生成相關[39],此結果進一步提示膻味脂肪酸的合成或與瘤胃發酵類型從乙酸型向丙酸或丁酸型的轉變有關。VFA的種類對膻味脂肪酸合成的影響及其具體機制有待進一步研究。同樣重要的是,在我們篩選的11種負相關菌群中,Sun等[45]研究發現,Lentimicrobiumsaccharophilum可利用多糖底物,生成大量乙酸鹽,其余10種負相關菌種的具體功能尚不清楚,仍待進一步探索。綜上所述,在找準降低羊肉膻味的關鍵窗口期之后篩選出可能與膻味脂肪酸合成及沉積相關的關鍵菌種后,對其具體機制的闡釋及如何靶向調控以實現降膻目的便是下一步研究的重點。

4 結 論

呼倫貝爾羊瘤胃微生物的組成和群落結構存在生長階段間的差異性:隨著羊的生長發育,瘤胃微生物表現出更高的豐富度和多樣性,菌群構成呈發育性變化。瘤胃微生物組成由母乳消化相關的兼性厭氧菌逐步向碳水化合物發酵相關的嚴格厭氧菌轉變。篩選出與膻味脂肪酸沉積存在相關性的標志性菌種15個,其中解肝素擬桿菌、Lentimicrobiumsaccharophilum等11個菌種相對豐度呈顯著負相關;棲瘤胃普雷沃氏菌及多酸光崗菌等4個菌種相對豐度呈顯著正相關,可作為后續阻抑膻味物質沉積的微生物調控靶點。