基于改進逼近理想解排序法的復合菌固態發酵平菇菌糠飼料參數優化

張立東 段平平 李昌昌 胡麗紅 陸牡龍 許貴善,2*

(1.塔里木大學動物科學與技術學院,阿拉爾 843300;2.塔里木畜牧科技兵團重點實驗室,阿拉爾 843300)

優質飼料原料缺乏及其成本問題一直是困擾畜牧業快速發展的重要因素[1]。緩解飼料原料供需矛盾,需要加快優質非常規飼料資源的開發和利用。食用菌生產中采集菌菇后剩余的廢棄物培養基,稱為菌糠(SMS),又叫菌棒、菌渣[2]。我國是食用菌生產大國,據中國食用菌協會報道[3],2020年全國食用菌總產量4 061.43萬t,比2019年增長3.2%,其中平菇(Pleurotusostreatus)作為食用菌家族中的大宗品種,在2020年產量達到682.96萬t。按每生產1 kg的食用菌產生3.25～5.00 kg菌糠計[4],2020年我國產生食用菌菌糠總量在13 199.65萬～20 307.15萬t,其中平菇菌糠(P.SMS)總量在2 219.62萬～3 414.80萬t。

目前,處理和利用菌糠的方式為焚燒、還田、開發生物質燃料、用作飼料和提取菌糠中的活性成分。但絕大部分菌糠被焚燒或隨意丟棄,造成環境污染和資源浪費。菌糠本身含水量高、不易保存、粗纖維含量較高、適口性差,直接制備畜禽飼料效果不好。添加微生物發酵可以改善菌糠適口性,延長菌糠儲存時間,且能提高菌糠的營養價值。劉月等[5]在假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌菌液的用量比為6.8∶1.0、水料比為1.0∶1.1、菌液接種量為6.8%條件下發酵靈芝菌糠,發現發酵后的靈芝菌糠感官品質有較大改善,酒香味明顯,粗蛋白質(CP)含量提高14.51%,粗纖維(CF)含量略有降低。李佳騰等[6]用混菌發酵杏鮑菇菌糠,發現發酵后的杏鮑菇菌糠CP和粗脂肪(EE)含量顯著高于原料,中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量顯著低于原料。飼料原料經過微生物發酵后飼喂動物有較好的效果。Peng等[7]研究證明,微生物發酵飼料可以通過減少致病微生物來調節盲腸微生物群,從而改善有益微生物,同時也影響免疫力及其相關基因的表達。Yan等[8]研究發現,7.5%發酵飼料對鵝的體重和平均日增重有增加的趨勢,增加擬桿菌屬的豐度,并可能影響宿主生長、營養狀況和腸道健康。王樂樂等[9]研究發現,飼糧中添加12%的發酵木屑菌糠在一定程度上提高了綿羊免疫功能和抗氧化性能,對綿羊生長性能和營養物質表觀消化率無負面影響。因此,菌糠發酵飼料具有較好的利用價值和飼喂效果。

微生物發酵飼料的品質和營養不僅由飼料原料和菌種決定,還與菌液接種量、物料含水量、發酵時間和溫度等條件密切相關[10]。平菇菌糠飼料的最佳發酵工藝需分別對多因素和多指標進行篩選評價,針對多因素的篩選,正交試驗、響應面法的試驗次數少且結果更準確。陳詩宇等[11]采用單因素和正交試驗優化黑曲霉和乳酸桿菌二段固態發酵大豆皮和菜籽餅工藝條件,分別篩選出了黑曲霉和乳酸桿菌的最優發酵工藝。劉戰霞等[12]通過單因素和正交試驗對益生菌發酵南瓜子進行工藝優化,發現最優工藝條件為發酵時間5 d、接種量5%、菌種比例1∶1、發酵溫度36 ℃。飼料價值評價需考慮營養成分和發酵品質等多個指標,指標間易相互影響,某一條件不一定對多個指標同時有效。Rane等[13]運用空間分析多影響因子法(MIF)和逼近理想解排序法(TOPSIS),考慮12個氣候、地球物理和可達性因素對壩址建設潛力進行評價,得到5個適宜建壩地點。王彥等[14]通過改進TOPSIS評價不同酶、菌及復合酶菌制劑對葡萄籽混合飼料的發酵效果,發現在25和30 ℃下添加1×109CFU/kg的植物乳桿菌發酵15 d效果較優。本試驗采用TOPSIS對多個指標進行綜合評價。TOPSIS是多目標決策分析中一種常用的有效方法,通過計算評價對象與最優解、最劣解的距離來進行排序,若評價對象最靠近最優解又最遠離最劣解,則為最好,否則為最差[15]。

本試驗以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,BS)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,LP)為發酵菌種,以平菇菌糠和玉米粉為發酵底物,采用單因素試驗探究發酵條件的最適范圍,作為六因素三水平正交試驗的水平以常規營養成分和發酵品質的綜合評分為評價指標,結合嚴少樂等[16]將熵權法內嵌至TOPSIS中獲取指標權重的改進TOPSIS綜合評價,探究玉米粉添加量、菌液接種量、物料含水量、菌種比例、發酵時間及發酵溫度對復合益生菌發酵平菇菌糠的影響,以期優化菌糠飼料發酵條件,推動菌糠資源飼料化利用,解決飼料供需矛盾。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

發酵底物為出菇三茬后的平菇菌糠,取自新疆阿拉爾市某平菇種植基地,平菇培養基由棉籽殼、鋸末、小麥麩、石灰等原料組成。發酵原料營養水平見表1。試驗菌種BS:選用LB液體培養基,置于37 ℃,150 r/min、恒溫搖床培養12 h,采用稀釋平板涂布的方法進行活菌數測定,測得活菌數≥1×1010CFU/mL;試驗菌種LP:選用MRS液體培養基,置于37 ℃,厭氧、靜置培養12 h,采用稀釋平板涂布的方法進行活菌數測定,測得活菌數≥1×1010CFU/mL。帶有單向透氣閥的聚乙烯發酵袋購自浙江某塑業公司。

表1 發酵原料營養水平(干物質基礎)

1.2 單因素試驗設計

以原料平菇菌糠和輔料玉米粉作為發酵底物,自然pH條件下進行發酵試驗。發酵結束后,在65 ℃烘箱中烘至恒重,在空氣中回潮24 h,粉碎過40目篩,用于測定CP、EE、NDF、ADF含量,干物質損失率,pH和氨態氮(NH3-N)含量。

1.2.1 玉米粉添加量

玉米粉添加量以0、5%、10%、15%、20%和25%(添加的玉米粉干重與菌糠干重的比值)為單因素,每組3個重復,菌液接種量12%,BS和LP菌種比例1∶1,物料含水量80%,發酵時間7 d,發酵溫度37 ℃。

1.2.2 菌液接種量

菌液接種量以4%、8%、12%、16%、20%、24%(BS和LP混合液的總體積與菌糠干重的比值)和空白(不接種菌液)為單因素,每組3個重復,玉米粉添加量按優化結果選取,BS和LP菌種比例1∶1,物料含水量80%,發酵時間7 d,發酵溫度37 ℃。

1.2.3 物料含水量

物料含水量以50%、60%、70%、80%、90%和100%(超純水和菌液總質量與菌糠干重的比值)為單因素,每組3個重復,玉米粉添加量和菌液接種量按優化結果選取,BS和LP菌種比例1∶1,發酵時間7 d,發酵溫度37 ℃。

1.2.4 BS和LP菌種比例

菌種比例以BS和LP 2種菌種復配比例(3∶1、1∶3、1∶1、2∶1、1∶2)以及BS與LP分別單菌發酵為單因素,每組3個重復,玉米粉添加量、菌液接種量和物料含水量按優化結果選取,發酵時間7 d,發酵溫度37 ℃。

1.2.5 發酵時間

發酵時間以1、4、7、10、13和16 d(發酵飼料制作完成至將發酵袋取出培養箱所經歷的時間)為單因素,每組3個重復,玉米粉添加量、菌液接種量、物料含水量和BS和LP菌種比例按優化結果選取,發酵溫度37 ℃。

1.2.6 發酵溫度

發酵溫度以25(平均室溫)、37、50和60 ℃(培養箱的溫度)為單因素,每組3個重復,玉米粉添加量、菌液接種量、物料含水量、發酵時間和BS和LP菌種比例按優化結果選取。

1.3 正交試驗

綜合前人對發酵菌糠的研究以及單因素試驗,基于正交試驗設計原理,選取玉米粉添加量、菌液接種量、物料含水量、發酵時間、BS和LP菌種比例、發酵溫度6個具有代表性因素,每個因素3個水平,本研究不考慮因子間的交互作用,僅考慮主效應,選取L18(36)正交表進行試驗,正交試驗設計見表2。用電子秤稱取100 g平菇菌糠,按照單因素與正交試驗設計算玉米粉的質量、所需BS和LP復合菌液的體積數以及所用水的體積數(扣除菌液總體積),將菌液倒入水中搖勻,均勻灑在和玉米粉混合均勻的平菇菌糠上,拌勻之后裝入聚乙烯呼吸袋中,每組3個重復,單室真空包裝機抽真空后,按照試驗設計的溫度放入恒溫培養箱中,到試驗設計的時間取出。取10 g樣品于250 mL錐形瓶,加入90 mL蒸餾水在4 ℃冰箱保存24 h用于測定pH及NH3-N、乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)含量。其余樣品65 ℃烘干經中藥粉碎機粉碎后裝入自封袋用于測定CP、EE、NDF、ADF含量及干物質損失率。發酵結束后測定各組營養成分和發酵品質,根據改進TOPSIS中應用熵權法得到綜合評分分析發酵效果,篩選出發酵參數較優組合。

表2 L18(36)正交試驗設計

1.4 指標測定

1.4.1 營養成分

飼料中DM、CP、NDF、ADF、EE含量分別參照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6434—2006、NY/T 1459—2007和GB/T 6433—2006的方法測定。

干物質損失率(%)=[(發酵前DM重量-發酵后DM重量)/原料DM重量]×100。

1.4.2 發酵品質

稱取樣品10 g,加入90 mL蒸餾水,放入4 ℃冰箱24 h后用4層紗布過濾,擠凈殘渣中的浸提液,用定量濾紙過濾備用。使用pH計測定pH;采用苯酚-次氯酸鈉比色法[17]測定NH3-N含量;采用Thermo Scientific UltiMate 3000型高效液相色譜儀[UltiMate XB-C18型色譜柱;柱溫:35 ℃;流動相:0.1 mol/L磷酸二氫鉀(KH2PO4);流速:1 mL/min]測定LA、AA、PA和BA含量。

1.5 數據處理

本試驗數據采用Excel 2016初步處理后,采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan氏法進行多重比較,以P<0.05為差異顯著性標準。結合本課題組王彥等[14]TOPSIS篩選發酵參數較優組合。

2 結果與分析

2.1 玉米粉添加量的優化

由表3可見,隨著玉米粉添加量的增加,飼料中的CP、EE含量逐漸升高,NDF、ADF含量和pH逐漸降低,干物質損失率先升高后降低,NH3-N含量先降低后升高,添加玉米粉5%～25%組CP含量顯著高于不添加玉米粉組(P<0.05),添加玉米粉5%～25%組的NDF含量和pH顯著低于不添加玉米粉組(P<0.05)。通過玉米粉添加量與理想添加量的接近度可知(表4),各方案與“理想解”的相對接近度C,隨著玉米粉添加量的增加而增大,即添加越多的玉米粉方案越優。綜合考慮平菇菌糠開發利用的成本等因素,選擇5%、10%、15%玉米粉添加量為較優水平,供正交試驗進一步篩選。

表3 玉米粉添加量對菌糠發酵飼料營養成分和發酵品質的影響(干物質基礎)

表4 玉米粉添加量與理想添加量的接近度

2.2 菌液接種量的優化

由表5可知,隨著BS和LP復合菌液接種量的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物質損失率逐漸升高,pH逐漸降低,菌液接種量16%組CP含量顯著高于其他各組(P<0.05),菌液接種量12%～20%組的EE含量顯著高于其他各組(P<0.05)。由表6可知,各方案與“理想解”的相對接近度由大到小排在前3的菌液接種量依次是16%、12%、20%,與營養成分和發酵品質得出的結果一致。因此認為,BS和LP復合菌液接種量適宜范圍是12%～20%。

表5 菌液接種量對菌糠發酵飼料營養成分和發酵品質的影響(干物質基礎)

表6 菌液接種量和理想接種量的接近度

2.3 物料含水量的優化

由表7可知,隨著物料含水量的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物質損失率逐漸升高,pH逐漸降低,物料含水量80%組的CP含量顯著高于其他各組(P<0.05)。由表8可知,各方案與“理想解”的相對接近度由大到小排在前3的物料含水量依次是80%、70%、60%,與營養成分和發酵品質得出的結果一致。因此認為,物料含水量的適宜水平為80%、70%、60%。

表7 物料含水量對菌糠發酵飼料營養成分和發酵品質的影響(干物質基礎)

表8 物料含水量與理想添加量的接近度

2.4 BS和LP菌種比例的優化

由表9可見,BS和LP菌種比例為3∶1組的EE含量顯著高于其他各組(P<0.05),單菌BS組的NH3-N含量顯著高于其他各組(P<0.05),各組的CP、NDF含量差異不顯著(P>0.05)。由表10可知,各方案與“理想解”的相對接近度由大到小排在前3的BS和LP菌種比例依次是2∶1、3∶1、1∶1,因此認為,BS和LP菌種比例的較優水平為2∶1、3∶1、1∶1。

表9 BS和LP菌種比例對菌糠發酵飼料營養成分和發酵品質的影響(干物質基礎)

表10 BS和LP菌種比例與理想添加量的接近度

2.5 發酵時間的優化

由表11可知,隨著發酵時間的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,干物質損失率逐漸升高,pH逐漸降低,各組CP、EE含量差異不顯著(P>0.05),發酵7、10和13 d組的NDF含量顯著低于其他各組(P<0.05),發酵10 d組的pH與其他各組差異顯著(P<0.05)。由表12可知,各方案與“理想解”的相對接近度由大到小排在前3的發酵時間依次是4、1和10 d,但發酵1、10和7 d相對接近度相差不大,綜合營養成分和發酵品質,發酵時間的較優水平為7、10和13 d。

表11 發酵時間對菌糠發酵飼料營養成分和發酵品質的影響(干物質基礎)

表12 發酵時間與理想添加量的接近度

2.6 發酵溫度的優化

由表13可見,隨著發酵溫度的增加,飼料中的CP、EE含量及干物質損失率先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高,pH逐漸升高。由表14可知,各方案與“理想解”的相對接近度由大到小排在前3的發酵溫度依次是37、25(室溫)、49 ℃,但49 ℃相對接近度較小,綜合營養成分和發酵品質,發酵溫度的較優水平為25(室溫)、37、45 ℃。

表13 發酵溫度對菌糠發酵飼料營養成分和發酵品質的影響(干物質基礎)

表14 發酵溫度與理想添加量的接近度

2.7 正交設計結果

由表15可知,根據改進TOPSIS中應用熵權法得到CP、EE、NDF、ADF含量,干物質損失率,pH及NH3-N、LA、AA、PA、BA含量的權重值分別為0.086、0.089、0.087、0.039、0.247、0.053、0.104、0.082、0.241、0.032、0.026。綜合評分等于CP/CP最大值×0.086+EE/EE最大值×0.089+NDF/NDF最大值×0.087+ADF/ADF最大值×0.039+干物質損失率最大值×0.247+pH/pH最大值×0.053+NH3-N/NH3-N最大值×0.104+LA/LA最大值×0.082+AA/AA最大值×0.241+PA/PA最大值×0.032+BA/BA最大值×0.026。通過極差分析得出的主次序為:A>C>D>E>B>F,綜合評分受A因素(玉米粉添加量)影響最大,并且在A1水平下較高,得到優化組為G1(A1B1C1D1E1F1),綜合考慮單因素試驗、正交試驗優化結果和實際應用需要,選擇A2B2C2D1E2F1進一步優化。

表15 飼料中營養成分和發酵品質正交試驗結果表(干物質基礎)

由于G1(A1B1C1D1E1F1)在表中,單獨對A2B2C2D1E2F1做優化試驗,結果見表16,A2B2C2D1E2F1相比于G1(A1B1C1D1E1F1)的CP、EE含量相差不大,NDF含量降低了13.90%,干物質損失率降低了11.82%,pH降低了16.94%,A2B2C2D1E2F1的ADF、NH3-N含量分別為22.15%、6.56%,LA、AA、PA、BA含量分別為8.23、2.87、0.16和0.09 mmol/L。A2B2C2D1E2F1相比于平菇菌糠原料,CP含量升高了34.14%(6.21%),EE含量升高了19.41%(6.08%),NDF含量降低了40.38%(52.57%),ADF含量降低了44.47%(38.89%)。綜上所述,確定A2B2C2D1E2F1[即玉米添加量10%、菌液接種量16%、物料含水量80%、發酵時間7 d、BS和LP菌種比例2∶1、發酵溫度25 ℃(室溫)]為最優組合。

表16 最優組合篩選(干物質基礎)

3 討 論

利用微生物發酵非常規飼料不僅可以解決飼料資源浪費、污染環境等問題,還可以填補我國飼料供應的缺口,具有較大的應用前景[18-19]?；炀l酵飼料時的菌液接種量、物料含水量、菌種比例、發酵時間、發酵溫度以及底物的碳源氮源等,是影響飼料中微生物生長和飼料發酵品質的代謝物積累的重要因素[20-21]。菌液接種量會改變微生物的生長、繁殖、代謝,從而影響發酵結果,菌液接種量過高,代謝產物過多會反過來抑制代謝使發酵不充分,菌液接種量過低,不能有效改善飼料品質[22]。物料含水量過高,飼料中氧氣流通變少,影響微生物生長,物料含水量過低,底物溶解度太低,影響底物利用率。適宜的菌種比例可以使混菌的生長產生相互促進作用,相反某種菌比例過高,其代謝物可能產生拮抗作用,抑制其他微生物的生長。發酵時間過長,不僅會增加時間成本,還會增加底物的干物質損失率,發酵時間過短,飼料發酵品質改善不明顯。溫度主要影響發酵過程中的酶促效率,常用的芽孢桿菌和乳酸菌適宜溫度接近,只需考慮生產中應用的需要即可。飼料中CP、EE、LA、AA含量等較高為宜,NDF、ADF含量,干物質損失率,pH及NH3-N、PA、BA含量等較低為宜,本試驗以這些指標作為依據,采用單因素與正交試驗相結合,并用TOPSIS模型綜合評價,對發酵條件進一步篩選優化,為菌糠飼料工業化生產提供可能。

在微生物發酵飼料的發酵條件優化試驗中,單因素試驗是最能直觀反映各因素對發酵效果的影響[23]。探究玉米粉添加量的試驗中,隨著玉米粉添加量的增加,發酵菌糠飼料中的CP、EE含量逐漸升高。裴朝東[24]用響應面法優化混菌發酵肉鵝青貯飼料工藝,選擇酒糟、稻殼、玉米粉、象草等4個因素為自變量因子,發現各試驗組發酵后EE、CP的含量均有不同程度的增加,其中EE含量的增幅為1.34%～4.33%,CP含量的增幅為3.50%～5.10%,與本試驗結果一致。

玉米粉是菌糠發酵飼料中微生物初期的大量擴繁的碳源和氮源,TOPSIS綜合評價得出,添加越多的玉米粉方案越優,但過多的玉米粉添加會造成菌糠資源飼料化利用的成本增加。探究菌液接種量的試驗中,隨著菌液接種量的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低。黎光楊等[25]用解淀粉芽孢桿菌固態發酵全棉籽,發現隨著接種量的增加,CP含量先升高后下降,當接種量為25%時,CP含量顯著高于其余接種量,與本試驗結果一致。接種量過大,導致CP、EE含量下降的原因可能是在發酵后期底物里的營養物質不足以供給大量微生物生長繁殖,微生物消耗了能改善發酵效果的代謝產物[26]。因此菌液接種量不是越大越好,TOPSIS綜合評價也得出了相同的結果。探究物料含水量的試驗中,隨著物料含水量的增加,飼料中的CP、EE含量先升高后降低,NDF、ADF、NH3-N含量先降低后升高。因為物料含水量直接影響菌株的生存環境和活性,進而影響產酶效果。含水量過低,菌株生長環境缺水,菌株與底物沒能充分接觸,生長緩慢,代謝能力低;含水量過高,底物黏稠,含氧量減少,菌株的生長繁殖受到極大影響[27]。探究菌種比例的試驗中,BS、LP比例2∶1明顯優于其他各組,結果與改進TOPSIS綜合評價一致。在適宜的比例下,多菌株發酵能夠發揮菌株間的協同作用,使發酵效果優于單菌株發酵[28]。探究發酵時間與溫度的試驗中,從各指標的變化趨勢來看,時間、溫度均有適宜的范圍,溫度選擇室溫(均溫25 ℃)、37 ℃,發酵時間選擇7和10 d。微生物的生長、繁殖、代謝受溫度影響較大,溫度適宜,菌活酶活高,所需發酵時間短,因此發酵溫度和時間的優化是必要的。魏炳棟等[29]采用地衣芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、黑曲霉4株菌混合發酵玉米蛋白粉時在33 ℃發酵84 h時達到最佳效果。與本試驗結果不一致的原因可能是使用的菌種不同,適宜的發酵溫度也不同。

另外在正交試驗中,對于不同的評價指標,發酵工藝影響因素的主次順序不同。本研究表明,以綜合評分為評價標準時,影響平菇菌糠發酵的主次因素分別是玉米粉添加量、物料含水量、發酵時間、BS和LP菌種比例、菌液接種量、發酵溫度。Tao等[30]和王丹媚等[31]研究表明,影響發酵的主要因素是時間、溫度、接種量;Liu等[32]研究表明,物料含水量、發酵時間、發酵溫度是影響發酵的主要因素。吝常華等[33]的研究表明,影響發酵的主要因素有發酵溫度、發酵時間、料水比以及菌液接種量。產生不同結果的原因可能與發酵底物、菌種、各因素水平等因素有關。本試驗綜合考慮單因素與正交試驗優化結果和實際應用需要,選擇不在正交表中的A2B2C2D1E2F1,并對其進一步優化驗證,發現除CP、EE含量外,其余各指標在玉米粉添加量10%、菌液接種量16%、物料含水量80%、發酵時間7 d、BS和LP菌種比例2∶1、溫度25 ℃(室溫)條件下均有不同程度的改善。羅彥玉等[34]用一株蠟樣芽孢桿菌來固態發酵油茶餅粕,最佳工藝條件為含水量109.9%,發酵溫度31.1 ℃,接種量10.0%,發酵時間48.0 h。萬里等[35]用乳酸菌和酵母菌發酵精補料,最佳發酵條件為接種量5%,接種比例2∶1、發酵溫度30 ℃、水料比1∶1。沈城等[2]采用固態發酵金針菇菌糠,發現最佳的發酵參數是選擇釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌做發酵劑、發酵時間7 d、發酵溫度30 ℃。本試驗部分條件與以上研究一致,部分有差別,可能與所測指標、所選菌種、發酵底物不一致有關。

4 結 論

本試驗基于改進TOPSIS,通過單因素試驗與正交試驗結合探究玉米粉添加量、菌液接種量、BS和LP菌種比例、物料含水量、發酵時間、發酵溫度對平菇菌糠發酵產物的營養成分和發酵品質的影響,確定了最佳發酵參數:玉米粉添加量10%、菌液接種量16%、物料含水量80%、發酵時間7 d、BS和LP菌種比例2∶1、發酵溫度25 ℃(室溫)。