蛋雞禽致病性大腸桿菌分離鑒定及噬菌體制劑體外殺菌研究

劉 亮

江蘇省南通市如東縣栟茶畜牧獸醫站,江蘇 南通 226406

0 引言

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌感染引起的一類疾病的總稱,由于感染時間、免疫力、感染途徑以及菌株毒力的差異,引起的臨床癥狀也有所不同[1-2]。急性發病者以病程十分短、體溫急劇升高和突然死亡為主要特征;慢性發病者以精神萎靡、劇烈腹瀉、轉圈運動等癥狀為主要特征;成年雞感染后可見關節滑膜炎、輸卵管炎和腹膜炎等癥狀。病理變化表現不一,多表現為肝周炎、氣囊炎,心包炎等。該病的發生無明顯的季節性,多以春季、夏季等溫度偏高季節多發[3]。該病常與其他疾病并發或繼發感染而使死亡率升高,給養禽業帶來了巨大損失[4-5]。

抗生素常用于治療大腸桿菌等細菌感染性疾病,但在獸醫臨床應用過程中存在用藥劑量過大、不遵守休藥期、盲目用藥等諸多問題,導致細菌耐藥譜越來越廣,多重耐藥現象嚴重,此外,另外致病性大腸桿菌感染動物體內可形成生物被膜也會影響抗生素等藥物的治療效果[6]。因此亟須研發抗生素替代品來防控細菌性疾病。噬菌體是一種可侵染細菌的病毒,在自然界中廣泛存在,可以靶向感染宿主菌導致崩解,且不影響其他正常菌群功能的發揮。目前有較多噬菌體產品已成功用于細菌性疾病治療和防控,隨著抗生素耐藥性日益嚴重,噬菌體將進一步替代抗生素在臨床上的應用[7-8]。本研究于2021年3月—2023年5月采集某蛋雞養殖場疑似禽致病性大腸桿菌感染的病料,進行病原的分離鑒定、生物學特性分析和藥物敏感試驗等操作,進而選擇其中代表性菌株開展噬菌體制劑體外殺菌試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

基因組DNA/RNA提取試劑盒、2×ES Taq Master Mix、DNA Marker和DNA凝膠回收劑盒購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司;PrimeScript RT Master Mix購自寶生物工程有限公司;革蘭氏染色液(結晶紫、碘液、95%酒精、復紅(沙黃)、蒸餾水等)、藥敏紙片和生化發酵管購自杭州天和微生物試劑有限公司;GelRed染劑購自Biotium公司;麥康凱瓊脂和伊紅美蘭培養基購自青島海博生物公司;病料為某蛋雞養殖場的發病雞和病死雞,采取心臟、肝臟,脾臟和腎臟等組織用于細菌的分離鑒定。復合噬菌體制劑為A公司市售產品。

1.2 細菌分離培養與染色鏡檢

用一次性接種環無菌蘸取組織病料內部組織液劃線接種于伊紅美蘭平板上,于37 ℃下倒置培養18～20 h。觀察是否生長出帶有金屬光澤的藍黑色、中等大小的菌落。觀察菌落形態特征,挑取疑似菌落進行染色鏡檢。按照革蘭氏染色的常規步驟進行染色后,油鏡觀察染色情況和細菌形態。

1.3 細菌的生化鑒定

對所有分離株進行常規生化指標進行接種測定,于37 ℃下培養24 h后觀察結果。若細菌能分解某一發酵管內的糖,則此種糖類能產生酸,指示劑呈酸性變化,發酵管中顏色發生改變;若不分解此糖類,則無顏色變化;產氣者于倒置的小管內出現氣泡。

1.4 細菌的PCR鑒定

挑取上述帶有金屬光澤的藍黑色菌落接種于LB液體培養基,于37℃下培養12 h以備用。菌液按DNA提取試劑盒說明書提取DNA進行PCR鑒定。擴增引物為F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。預計擴增片段長度約500 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系25 μL:2×PCR Master Mix 12.5 μL、引物各1 μL、模板2 μL、 ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序:95℃預變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72 ℃延伸60 s;共進行35次循環;最后,72 ℃再延伸10 min。最終的PCR產物于4 ℃下保存。擴增產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.5 細菌的藥敏試驗

選取2021年3月—2023年5月獲得的49株細菌,選用14種抗生素進行藥物敏感性試驗,觀察有無抑菌圈的形成,且根據直徑的大小判定藥物敏感程度。

1.6 噬菌體制劑體外殺菌

將A公司市售產品復合噬菌體制劑按說明書稀釋至104倍,稀釋后噬菌體濃度大于105,然后選取代表性的5株進行體外殺菌試驗。配置100 mL液體LB培養基,高壓滅菌,恢復室溫后按1：100分別轉接上述代表性5株大腸桿菌,分裝到7只(第1～7組)10 mL的無菌EP管中。第1～5組(噬菌體制劑組)管分別加入100 μL上述10 000倍稀釋后的菌益;第6組(氟苯尼考對照組)管加入氟苯尼考;第7組(對照組)管不加任何試劑。1～7號管置于37 ℃搖床培養,分別在0 min,60 min,120 min,180 min用分光光度計測量1～9號管內液體的光密度(OD),觀察體外殺菌效果。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養及染色鏡檢結果

蘸取新鮮組織的接種環在伊紅美藍培養基上進行劃線,將劃好的平板放入培養箱于37 ℃下進行培養,18～24 h觀察平板菌落性狀。觀察發現在伊紅美藍培養基上長出帶有金屬光澤、深紫黑色菌落,檢測結果初步判定分離菌株為大腸桿菌(見圖1)。革蘭氏染色鏡檢結果可見革蘭氏陰性,兩端鈍圓的短桿菌,符合大腸桿菌的形態特點。

圖1 分離菌株在伊紅美藍培養基的生長情況

2.2 生化特性鑒定結果

實驗結果表明:分離的細菌能使木糖、蔗糖產酸產氣,甘露醇、乳糖、葡萄糖產氣不產酸,硫化氫、棉子糖、蛋白胨不分解,山梨醇、肌醇、水楊苷產酸不產氣(見表1),符合大腸桿菌的生化特性。

表1 生化反應結果

2.3 細菌的PCR檢測結果

PCR方法擴增大腸桿菌目的片段,結果表明,待檢菌株和陽性樣品能夠擴增到預期大小的片段,為500 bp,而陰性對照未擴增出任何片段如圖2所示。將擴增的片段送生工生物進行測序,表明結果分離菌株為禽致病性大腸桿菌。根據病死雞的臨床癥狀、病理變化,通過伊紅美藍培養基的培養篩選、生化鑒定以及PCR鑒定等,從152份樣品中共分離到大腸桿菌49株。

2.4 藥物敏感試驗結果

藥敏試驗結果見表2,顯示49株分離菌對環丙沙星、阿莫西林、頭孢他啶、強力霉素、復方新諾明、林可霉素等耐藥率分別高達89.8%、89.8%、93.6%、98.0%、85.7%、100%,均超過85%。敏感性最高的是氟苯尼考,為53.0%,其次是慶大霉素,為40.8%。根據臨床用藥情況結合藥敏試驗結果,選用氟苯尼考作為噬菌體制劑體外殺菌的陽性對照。

M—DL-2000 Marker;1—待檢樣品;2—陽性對照;3—陰性對照。

表2 大腸桿菌藥物敏感性試驗結果單位:%

2.5 噬菌體制劑體外殺菌結果

殺菌試驗結果顯示:第1～3組60 min后OD值均有增加,但第1、2組比第3組增加的慢,可以推測第1組中的噬菌體以及第2組中的氟苯尼考已發揮了殺菌作用;120 min后,第1組OD值明顯下降至起始濃度以下,表示噬菌體已基本殺死了培養基中全部的大腸桿菌,180 min后的結果與120 min相同。120 min時第2組的OD值明顯小于第3組但均大于第1組,說明第2組中的氟苯尼考發揮了殺菌作用但殺菌作用弱于第1組,180 min后的數據結果與120 min相同,如圖3所示。研究結果表明噬菌體制劑體外殺菌優于氟苯尼考。

1—噬菌體制劑;2—氟苯尼考對照;3—陰性對照

3 討論

本研究累計分離獲得49株禽致病性大腸桿菌,藥敏試驗結果顯示,發病雞場的大腸桿菌對大部分抗菌藥產生耐藥性,表明該雞場大腸桿菌多重耐藥問題已十分嚴重,這些抗生素在臨床上治療效果不佳,這對防控造成了十分大的阻礙,另外抗生素不規范使用引起藥物殘留、養殖環境菌群不平衡等問題,嚴重威脅人類健康[9]。

針對以上問題,國家相關部門出臺了一系列限抗禁抗和研發替抗產品的政策措施,鼓勵高等學校和科研院所研發抗生素替代品來防控耐藥菌感染。噬菌體是極具潛力的抗生素替代產品[10-12]。本研究結果表明噬菌體制劑體外殺菌優于氟苯尼考,提示可用于蛋雞禽致病性大腸桿菌病的治療。

4 結論

通過病料采集、細菌分離鑒定、生物學特性分析和藥物敏感試驗等,分離獲得49株致病性大腸桿菌,藥敏試驗結果顯示臨床上多重耐藥性較為嚴重。選用A公司市售產品復合噬菌體制劑進行殺菌試驗,結果表明其殺菌效果優于氟苯尼考。因此,該復合噬菌體制劑可用于該雞場蛋雞禽致病性大腸桿菌病的治療。