干預自噬調控p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路對結直腸癌細胞鐵死亡及奧沙利鉑耐藥的影響

徐 磊,武 寒,王苗苗,張睿哲,溫菲菲,許曉陽,吳淑華

結直腸癌是全球第三大常見癌癥,也是癌癥相關死亡的第二大原因[1]。術后復發和轉移是結直腸癌患者死亡的重要原因,化療依然是術后重要的輔助治療。奧沙利鉑(OXA)是治療結直腸癌的一線化療藥物[2]。因腫瘤具有耐藥性和長期使用產生不良反應,導致不足40%的晚期結直腸癌患者受益于OXA[3]。因此,探究結直腸癌OXA耐藥的分子機制對改善OXA對晚期結直腸癌患者的預后具有重要意義。

近年研究發現,鐵死亡與腫瘤耐藥密切相關,鐵死亡是一種依賴于細胞內鐵積累和脂質過氧化的細胞程序性死亡形式[4]。谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)是鐵死亡的重要調節因子,干預以GPX4為代表的脂質過氧化物酶途徑促使腫瘤細胞發生鐵死亡可能成為逆轉腫瘤耐藥的新思路[5]。研究表明,GPX4表達與自噬適配器p62、Kelch樣Ech相關蛋白1(Kelchike Ech-associated protein 1, Keap1)、核轉錄因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)構成的p62-Keap1/Nrf2細胞氧化應激信號通路密切相關[6]。p62作為重要的選擇性自噬接頭蛋白,是重要的自噬激活標志物。自噬被認為是維持細胞穩態的關鍵過程,LC3是公認的自噬標志物[7]。目前,越來越多的研究表明自噬參與了鐵死亡調節[8]。本課題組前期實驗結果顯示,結直腸癌中存在鐵死亡現象,其與Keap1/Nrf2-GPX4表達有關,且與患者預后密切相關[9]。本實驗通過細胞培養、藥物干預,觀察干預結直腸癌細胞自噬對p62-Keap1/Nrf2-GPX4-鐵死亡及耐藥的影響,探討自噬調控鐵死亡抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和逆轉OXA耐藥性的可行性及其分子機制,為抑制結直腸癌的發生、發展并逆轉耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 人結腸癌細胞系HCT-8、COLO205、SW480、SW620、HCT-116及OXA耐藥細胞株HCT-116/OXA均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫,胎牛血清和RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司。

1.1.2試劑 β-actin、LC3、p62、Keap1、Nrf2抗體均購自美國Abcam公司;GPX4抗體購自Affinity公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔多克隆IgG二抗購自福州邁新公司;細胞增殖及細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8, CCK-8)購自日本同仁化學研究所;OXA、雷帕霉素(Rapa)、氯喹(CQ)、Erastin、Fer-1和FerroOrange熒光探針均購自GlpBio公司;細胞內自噬染色測定試劑盒[單丹磺酰尸胺(dansylcadaverine, MDC)法]、Western blot凝膠試劑盒、RIPA細胞裂解液等試劑盒和丙二醛(Malonic dialdehyde, MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)檢測試劑盒均購自上海碧云天公司,鐵離子檢測試劑盒購自Solarbio公司;吉姆薩染液購自北京索萊寶公司;Transwell雙層細胞培養板購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 HCT-8、COLO205、SW480、SW620、HCT-116和耐藥細胞株HCT-116/OXA接種于含5%胎牛血清的RPMI-1640培養基中,置于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養。OXA耐藥的HCT-116/OXA細胞在含5 μmol/L OXA的培養基中持續培養1周維持抗性。每隔2天換液1次,每3天用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.2.2Western blot法 收集細胞提取蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度。各組取30 μg蛋白進行凝膠電泳分離,并將其轉印至PVDF膜上,經10%脫脂奶粉封閉2 h。一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,滴加ECL發光液,成像系統曝光。利用Image J軟件分析目標圖像。

1.2.3自噬和鐵死亡干預實驗 選取HCT-116/OXA耐藥細胞株,分為自噬激活劑Rapa和自噬抑制劑CQ干預組,又根據對鐵死亡的干預分為不同亞組:Rapa組、Fer-1組、Rapa+Fer-1組、CQ組、Erastin組、CQ+Erastin組及相應的對照組。根據預實驗,設誘導自噬及鐵死亡改變的最低藥物濃度為干預劑濃度,在各組細胞系中分別加入Rapa(0.10 μmol/L)、CQ(10.00 μmol/L)、Erastin(10.00 μmol/L)、Fer-1(1.00 μmol/L)和完全培養基各200 μL,培養24 h。確定干預成功后,用于后續實驗。

1.2.4MDC染色 應用MDC染色檢測細胞系中自噬體的形成。制備細胞懸液,以每孔2×105個細胞接種于6孔板內,藥物干預后吸棄培養液,向每孔中加入1 mL MDC染液,溫箱孵育30 min后置于熒光顯微鏡下觀察,高倍鏡下隨機選取5個視野,計數自噬激活細胞數所占百分比,取其平均值。

1.2.5Fe2+、MDA和GSH含量測定 按照試劑盒說明書,使用相應試劑盒測定結直腸癌細胞中Fe2+、MDA和GSH的含量。酶標儀檢測各指標吸光度值,并計算其在細胞內的含量。

1.2.6FerroOrange熒光探針檢測活細胞內Fe2+含量 將HCT-116/OXA細胞計數后以每孔2×105個細胞接種于6孔板,藥物干預后吸棄培養液,向每孔加入500 μL經無血清培養稀釋的FerroOrange工作液(1 μmol/L),置于培養箱中孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察各組細胞的熒光強度。

1.2.7CCK-8實驗 應用CCK-8實驗對細胞系進行OXA藥物毒性測試。制備細胞懸液,設置實驗組和對照組,以每孔1×103個細胞接種于96孔板,每組設計4個復孔。在實驗組和對照組中分別注入200 μL含不同濃度OXA的培養基和不含藥物的培養基,培養24 h。棄置液體后注入10 μL CCK-8染液,37 ℃下溫育1 h后于酶標儀450 nm處測量吸光度(OD)值,計算細胞存活率/抑制率。

1.2.8聯合OXA干預HCT-116/OXA細胞株生物學活性實驗 選取聯合OXA干預實驗細胞株(分組同1.2.3),分別在6孔板中加入2 mL自噬干預劑或鐵死亡干預劑(藥物濃度同1.2.3)及等量生理鹽水預處理6 h,之后吸出培養液,取2 mL自噬干預劑或鐵死亡干預劑及OXA[OXA濃度為半數抑制濃度(IC50)=141.94 μmol/L]混合液加入實驗組中,OXA對照組中加入等量生理鹽水,培養24 h后,進行生物學活性實驗。

1.2.9細胞侵襲試驗 Transwell小室模型置于24孔板中,制備濃度為每毫升5×105個細胞懸液。并于小室上層加入100 μL細胞懸液,下室加入600 μL含20%的胎牛血清培養基,每組細胞重復2個小室,連續培養24 h。用棉簽輕輕擦除上室側細胞和基質膠,甲醇溶液固定30 min后用吉姆薩染液染色,鏡下觀察穿透細胞數。每個腔室隨機選取3個視野,計算平均值。

1.2.10平板克隆實驗 制備細胞懸液,每組細胞分別以每孔500～1 000個細胞接種于6孔板內,并加入2 mL完全培養基,培養約1周,至產生肉眼可見的克隆球時結束。甲醇固定30 min后用吉姆薩染液染色,沖洗染色并風干,拍照并計算各組的克隆形成數。

2 結果

2.1 不同細胞系中LC3、p62、GPX4的表達Western blot法檢測結果顯示(圖1A),LC3的表達量在HCT-8細胞中最低,在SW620細胞中最高(圖1B);p62的表達量在HCT-8細胞中最高,在SW620細胞中最低(圖1C);GPX4的表達量在HCT-8細胞中最高,在COLO205細胞中最低(圖1D)。選擇LC3中等表達量的HCT-116細胞株進行后續實驗。

圖1 結直腸癌細胞自噬關鍵蛋白和鐵死亡關鍵蛋白的表達水平:A.Western blot法檢測不同結直腸癌細胞系中LC3、p62、GPX4的表達;B.LC3的表達量柱狀統計圖;C.p62的表達量柱狀統計圖;D.GPX4的表達量柱狀統計圖;*P<0.05,**P<0.01

2.2 結直腸癌敏感、耐藥細胞株中自噬和鐵死亡相關因子的表達選擇HCT-116細胞株,并委托原公司將其誘導成OXA耐藥細胞株HCT-116/OXA進行后續實驗。CCK-8實驗檢測兩組細胞對OXA的敏感性,結果顯示:HCT-116細胞的IC50為9.87 μmol/L,耐藥細胞株HCT-116/OXA的IC50為141.94 μmol/L,明顯高于親本細胞株,差異有統計學意義(P<0.05,圖2A),提示耐藥誘導成功。采用Western blot法檢測兩組細胞中LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4的表達。結果顯示,HCT-116/OXA細胞中p62、Nrf2、GPX4蛋白表達明顯高于HCT-116細胞株,而LC3、Keap1蛋白表達則顯著降低(P<0.05,圖2B、C)。試劑盒檢測兩株細胞中Fe2+、GSH、MDA的含量,結果顯示,HCT-116/OXA細胞中Fe2+、GSH、MDA的含量均高于HCT-116細胞(P<0.05,圖2D～F)。

圖2 結直腸癌敏感、耐藥細胞株中自噬和鐵死亡相關因子的表達:A.CCK-8實驗檢測敏感和耐藥細胞對OXA的敏感性;B.Western blot法檢測兩組細胞中LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白表達;C.兩組細胞中LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白表達量柱狀統計圖;D.兩組細胞中Fe2+含量;E.兩組細胞中GSH含量;F.兩組細胞MDA中含量;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

2.3 干預自噬和鐵死亡對HCT-116/OXA細胞鐵死亡相關因子表達的影響選擇HCT-116/OXA細胞株進行自噬和鐵死亡干預實驗,應用MDC染色法觀察自噬活性,采用Western blot法檢測LC3、p62、Keap1、Nrf2和GPX4表達水平。結果顯示:自噬激活劑組中,Rapa組和Rapa+Fer-1組與其余兩組相比,細胞內熒光顆粒顯著增多,LC3表達升高,p62表達降低,提示自噬被激活;Keap1均呈高表達,Nrf2、GPX4均呈低表達,但Rapa+Fer-1組中GPX4的表達高于Rapa組(P<0.05)。而Fer-1組與對照組相比各項指標差異均無統計學意義(P>0.05,圖3)。

圖3 Rapa和Fer-1干預結直腸癌細胞后LC3、p62、Keap1、Nrf2及GPX4蛋白表達水平:A.MDC染色檢測不同干預組中的自噬水平;B.不同干預組中細胞自噬發生率;C.Western blot法檢測不同干預組的蛋白表達水平;D.LC3蛋白表達柱狀統計圖;E.p62蛋白表達柱狀統計圖;F.Keap1蛋白表達柱狀統計圖;G.Nrf2蛋白表達柱狀統計圖;H.GPX4蛋白表達柱狀統計圖;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

在自噬抑制劑組中,與對照組和Erastin組相比,CQ組和CQ+Erastin組細胞內熒光顆粒顯著增多,LC3、p62表達同步升高,提示自噬活性降低;Nrf2均呈高表達,Keap1均呈低表達(P<0.05)。對照組與Erastin組相比,CQ組與CQ+Erastin組相比,蛋白表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)。GPX4在Erastin組中的表達顯著低于其余三組,而在CQ組中的表達則高于其余三組(P<0.05,圖4)。以上結果提示干預自噬可能通過p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路調控結直腸癌細胞的鐵死亡。

圖4 CQ和Erastin干預結直腸癌細胞后LC3、p62、Keap1、Nrf2及GPX4蛋白表達水平:A.MDC染色檢測不同干預組中的自噬水平;B.不同干預組中細胞自噬發生率;C.Western blot法檢測不同干預組的蛋白表達水平;D.LC3蛋白表達柱狀統計圖;E.p62蛋白表達柱狀統計圖;F.Keap1蛋白表達柱狀統計圖;G.Nrf2蛋白表達柱狀統計圖;H.GPX4蛋白表達柱狀統計圖;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

2.4 干預自噬和鐵死亡對HCT-116/OXA細胞Fe2+、GSH、MDA含量的影響應用試劑盒檢測不同干預組中Fe2+、MDA、GSH的表達量,并采用FerroOrange熒光探針檢測各組細胞內Fe2+的含量。組間比較結果顯示,在自噬激活劑組中,Rapa組Fe2+、MDA的含量均高于其余三組,GSH的含量則低于其余三組(P<0.05)。Rapa+Fer-1組Fe2+、MDA含量低于Rapa組,而GSH含量高于Rapa干預組(P<0.05)。Fer-1組與對照組相比,各指標的表達差異均無統計學意義(P>0.05,圖5A～C),提示激活自噬可能引起結直腸癌細胞發生鐵死亡。

GControlRapaFer-1Rapa+Fer-1ControlCQErastinCQ+Erastin

在自噬抑制劑組中,CQ組Fe2+、MDA的含量低于其余三組,GSH含量高于其他組;Erastin組Fe2+、MDA含量高于其余三組,GSH含量則低于其他組(P<0.05);與Erastin組相比,Erastin+CQ干預組的Fe2+、MDA含量低,GSH含量高(P<0.05,圖5D～G),提示下調自噬活性可能抑制結直腸癌細胞鐵死亡的發生。

2.5 自噬和鐵死亡干預劑聯合OXA對HCT-116/OXA細胞株增殖活性的影響CCK-8實驗檢測自噬和鐵死亡干預劑預處理后聯合OXA對HCT-116/OXA細胞株增殖活性的影響。結果顯示,自噬激活劑組聯合應用OXA后,Rapa干預組對OXA的化學敏感性高于其余三組,細胞增殖活性明顯降低;Rapa+Fer-1組對OXA的敏感性低于Rapa組,但高于Fer-1組和對照組,組間相比差異有統計學意義(P<0.05)。Fer-1組細胞活性與對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05,表1)。

表1 CCK-8實驗檢測Rapa和Fer-1聯合OXA干預后HCT-116/OXA細胞株的存活情況

聯合應用OXA后,在自噬抑制劑組中,Erastin干預組細胞活性顯著降低于其余三組,而CQ+Erastin組雖較Erastin組細胞活性升高,但細胞活性低于CQ和對照組,組間相比差異有統計學意義(P<0.05)。CQ組細胞活性與對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05,表2)。

表2 CCK-8實驗檢測CQ和Erastin聯合OXA干預后HCT-116/OXA細胞株的存活情況

2.6 自噬和鐵死亡干預劑聯合OXA對HCT-116/OXA細胞株侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗顯示,聯合應用OXA后,自噬激活劑組中Rapa組遷移細胞數量明顯少于其余三組;而Rapa+Fer-1組遷移細胞數量較Rapa組增多,但低于其余2組,差異有統計學意義(P<0.05)。Fer-1組與對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05,圖6)。

圖6 Rapa和Fer-1聯合OXA對HCT-116/OXA細胞侵襲能力的影響:A.Transwell細胞侵襲實驗結果;B.不同干預組的遷移細胞數;??P<0.01,???P<0.001,????P<0.000 1

自噬抑制劑聯合應用OXA后,與對照組相比,Erastin組、CQ+Erastin組和CQ組細胞遷移數量均減少,其中Erastin組最低,CQ+Erastin組遷移細胞數量高于Erastin組、低于CQ組,各組間相比,差異均有統計學意義(P<0.05,圖7)。

圖7 CQ和Erastin聯合OXA對HCT-116/OXA細胞侵襲能力的影響:A.Transwell細胞侵襲實驗結果;B.不同干預組的遷移細胞數;?P<0.05,??P<0.01,????P<0.000 1

2.7 自噬和鐵死亡干預劑聯合OXA對HCT-116/OXA細胞株克隆形成能力的影響平板克隆實驗結果顯示,自噬激活劑聯合應用OXA后,Rapa組的細胞克隆形成數較其余三組明顯減少;Rapa+Fer-1組細胞克隆形成數量較Rapa組增多,但較其余兩組少,組間相比差異有統計學意義(P<0.05)。Fer-1組與對照組相比,差異無統計學意義(P>0.05,圖8)。

圖8 Rapa和Fer-1聯合OXA對HCT-116/OXA細胞克隆形成能力的影響:A.克隆形成實驗檢測細胞增殖;B.不同干預組細胞克隆形成數;**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

自噬抑制劑聯合應用OXA后,Erastin組、CQ+Erastin組和CQ組三組細胞克隆形成數量均低于對照組(P<0.05);其中Erastin組的細胞克隆形成數量最少,CQ+Erastin組高于Erastin組,但低于CQ組,各組間相比,差異均有統計學意義(P<0.05,圖9)。

圖9 CQ和Erastin聯合OXA對HCT-116/OXA細胞克隆形成能力的影響:A.克隆形成實驗檢測細胞增殖;B.不同干預組細胞克隆形成數;*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1

自噬抑制劑聯合應用OXA后,Erastin組、CQ+Erastin和CQ組三組細胞克隆形成數量均低于對照組(P<0.05);其中Erastin組的細胞克隆形成數量最少,CQ+Erastin組高于Erastin組,但低于CQ組,各組間相比,差異均具有統計學意義(P<0.05,圖9)。

3 討論

腫瘤耐藥是多基因、多信號通路的復雜過程,與藥物攝入減少、泵出增加、DNA修復能力增強、凋亡抑制等相關[10]。OXA作為中晚期結直腸癌一線化療藥物,其主要作用機制是與細胞核內DNA交聯,激活凋亡途徑,導致細胞死亡[11]。此外,OXA還可以通過破壞細胞內的氧化還原穩態,導致細胞死亡[12]。但部分中晚期結直腸癌患者對OXA產生的耐藥性已成為影響預后的重要因素,因此,逆轉OXA耐藥,更好地發揮其持久的抗癌作用,提高患者的生存率,成為臨床醫師和研究人員關注的熱點。

鐵死亡是近年來發現的一種新型細胞死亡形式,是一種鐵依賴性脂質過氧化物過度累積誘導細胞死亡的方式[4]。鐵死亡的發生機制復雜,主要通過內、外兩種途徑啟動:外源性的轉運蛋白依賴途徑和內源性的酶調節途徑。其中,以抗氧化酶GPX4為主內源性酶調節途徑最為經典[13]。鐵死亡發生時,過量的鐵離子導致大量活性氧的產生與積累,GSH耗竭,GPX4活性下降,繼而氧化膜脂質,MDA升高,促使細胞膜完整性缺失,引發鐵死亡。GPX4是抗氧化體系中的關鍵分子,以GSH作為電子供體,使過氧化脂質轉化為無毒的醇,減少對細胞損傷,從而抑制鐵死亡[14]。越來越多的證據表明,GPX4的降低是鐵死亡發生的關鍵標志。Lu等[15]研究發現,在腎透明細胞癌細胞中,抑制GPX4可激活鐵死亡,抑制細胞遷移和侵襲。Deng等[16]研究發現,抑制GPX4表達可激活鐵死亡,增強肺腺癌細胞對順鉑的藥物敏感性。本研究結果顯示,不同結直腸癌細胞中GPX4的表達不同,雖然OXA耐藥細胞株中鐵離子及脂質過氧化水平較高,但其GSH、GPX4表達水平顯著高于親本細胞株。作者認為該現象符合腫瘤耐藥細胞的生物學特點,高水平的鐵滿足了癌細胞的高代謝需求[17],而GPX4的增高又恰好增加了癌細胞的抗氧化應激能力,抵抗鐵死亡。因此,通過降低GPX4表達引發腫瘤細胞鐵死亡,有望成為腫瘤耐藥治療的新靶點。

自噬是真核細胞內高度保守的溶酶體介導的代謝途徑,主要負責清除錯誤折疊的蛋白質、受損的細胞器等,對于維持細胞穩態起重要作用[7]。作為重要的選擇性自噬接頭蛋白,p62被認為是清除泛素化蛋白的重要自噬生物學標志物,p62與泛素化的蛋白質結合并以其為靶點,通過自噬進行降解,其含量隨自噬流的產生而降低[18]。Nrf2是一種堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子,通過激活解毒酶、調控抗氧化基因和蛋白的表達來防止氧化損傷。GPX4已被確定為Nrf2的轉錄靶標,其表達可被Nrf2上調[19]。在正常生理情況下, Keap1與Nrf2結合并通過泛素-蛋白酶體途徑快速降解。而在氧化應激狀態下,Keap1介導的Nrf2降解受到抑制,Nrf2被激活并釋放入核,發揮轉錄功能[20]。有研究發現,自噬蛋白p62可以在Nrf2和Keap1的結合部位與Keap1競爭性結合,促進Nrf2釋放,激活抗氧化系統。Li等[21]研究報道,激活p62-Keap1/Nrf2通路可減輕輻射所致肺損傷中的鐵死亡。然而,關于p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路是否會影響結直腸癌鐵死亡的研究報道較少。本研究顯示,HCT-116/OXA細胞中鐵離子和脂質過氧化水平均處于較高水平,且GSH、GPX4等抗氧化的活性同樣維持在較高水平。同時,p62、Nrf2、GPX4蛋白高表達,提示HCT-116/OXA細胞的鐵死亡抑制和耐藥可能與p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路處于異常激活狀態有關。因此,通過影響p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路進而促進鐵死亡,有可能成為逆轉結直腸癌耐藥的新途徑。

自噬與鐵死亡關系密切,共同參與多種腫瘤的發生、發展,但目前兩者的關系尚不統一。Tang等[22]研究發現,姜黃素通過激活自噬誘導非小細胞肺癌鐵死亡,增強非小細胞肺癌的治療效果。而在膠質母細胞瘤干細胞中,抑制自噬可誘導鐵死亡的發生且增強細胞對替莫唑胺的敏感性[23]。然而,在結直腸癌中自噬對鐵死亡的影響尚未明確。本研究分別應用自噬激活劑Rapa和自噬抑制劑CQ,觀察兩者對鐵死亡影響的分子機制。結果顯示,在結直腸癌HCT-116/OXA細胞中,應用自噬激活劑Rapa后,LC3水平升高的同時伴隨p62水平降低、Keap1高表達、Nrf2低表達,GPX4表達下降,鐵死亡生化指標Fe2+、MDA含量上升,GSH含量下降,細胞存活率下降。應用自噬抑制劑CQ后,結果與之相反。提示,干預自噬可通過p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路影響鐵死亡。為進一步證明自噬與鐵死亡的關系,本研究同步應用了鐵死亡抑制劑Fer-1和激活劑Erastin。結果顯示,Rapa誘導的細胞死亡可被鐵死亡抑制劑Fer-1所抑制,而CQ抑制自噬則是通過提高抗氧化酶GSH和GPX4的表達,從而抑制鐵死亡激活劑Erastin誘導的細胞鐵死亡。因此,本研究結果提示,自噬可通過p62-Keap1-Nrf2-GPX4影響鐵死亡,進而影響細胞生存,干預此通路可能成為結直腸癌治療的新途徑。

許多研究表明,鐵死亡的激活有助于多種腫瘤的治療,在部分腫瘤中,鐵死亡可以增強化療藥物的療效。Du等[24]研究報道,雙氫青蒿素可通過誘導鐵死亡克服胰腺導管腺癌對順鉑的耐藥性。Song等[25]研究證實,抑制GPX4可刺激細胞鐵死亡,增強三陰型乳腺癌對吉非替尼的敏感性。但干預自噬調控鐵死亡這一過程是否能逆轉耐藥腫瘤細胞對OXA的敏感性尚不清楚。本研究結果顯示,應用自噬激活劑Rapa后誘導細胞發生鐵死亡,同時細胞對OXA的敏感性顯著升高,并且其增殖活性和遷移能力均顯著下降,而聯合應用鐵死亡抑制劑Fer-1后OXA的作用效果顯著降低。聯合應用鐵死亡激活劑Erastin后,細胞對OXA的敏感性升高,其增殖活性和遷移能力均顯著下降。作者認為,在腫瘤細胞高鐵代謝的環境中,激活自噬可誘導鐵死亡的發生,進一步增強了腫瘤細胞對OXA的敏感性。

綜上,本研究發現干預自噬可通過p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路調控鐵死亡,從而逆轉結直腸癌對OXA耐藥性。因此,深入探索自噬與鐵死亡的關系,研究其在抗腫瘤治療中的潛在作用,為逆轉腫瘤耐藥提供新思路。