結直腸癌中GIPC2表達及臨床病理意義

劉雅新,閆文卿,馬怡君,韓 微,周彩婷,吳 艷,嚴雪冰,徐 健,王 磊

我國結直腸癌的發病率位居所有惡性腫瘤的第3位,病死率位居第5位[1],早期因無明顯癥狀易被忽視[2]。目前臨床多采用腸鏡、影像學檢查、病理活檢等方式綜合診斷,術后主要依據TNM分期進行預后評判,目前仍缺乏更為有效的早期診斷和預后評判標志物。多項研究表明GIPC2在多種腫瘤中的表達發生變化,如在胃癌中表達上調,在腎癌和腎上腺皮質癌中表達下調[3]。GIPC2在結直腸癌中的表達尚無相關報道。本組前期在以m6A甲基化修飾和上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)構建的結直腸癌多基因模型分析中發現,GIPC2表達發生顯著改變[4]?，F通過GEPIA數據庫檢索并預測GIPC2在結直腸癌中的表達情況;采用免疫組化法檢測GIPC2在結直腸癌組織中的表達,分析其與臨床病理特征、患者預后之間的關系,以探討GIPC2在結直腸癌診療和預后評判中的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2021～2022年揚州大學附屬醫院行手術治療的結直腸癌患者95例,所有病例均經術后病理檢查確診,且均為結直腸原發病例,患者術前未行其他相關治療,臨床資料均完整?；仡櫺苑治銎渑R床資料并通過電話隨訪,將臨床病理特征分組:年齡、性別、大體類型、腫瘤最大徑、分化程度、淋巴結轉移情況、TNM分期。其中,≤60歲21例,>60歲74例;男性54例,女性41例;腫瘤最大徑≤5 cm的62例,>5 cm的33例;大體類型中,隆起型36例,潰瘍型59例,無彌漫型;高分化4例,中分化70例,低分化21例;淋巴結轉移38例,無淋巴結節轉移57例;Ⅰ期12例,Ⅱ期44例,Ⅲ期36例,Ⅳ期3例。

1.2 方法免疫組化檢測采用手工SP染色法:73 ℃烤片箱烤片后,脫蠟脫水,于高壓鍋中以pH 6.0的檸檬酸鹽修復液煮沸后晾涼;再加入適量內源性過氧化物酶阻斷劑,室溫10 min后PBS洗凈;加入適量GIPC2(上海雅吉生物公司)過夜后用PBS沖洗,再加入適量二抗37 ℃孵育30 min;加入DAB顯色后用水沖洗,蘇木精染色,分化、沖洗反藍、脫水透明,封固[5]。

1.3 結果判定免疫組化染色強度分數判定:(1)按染色強度評分:無陽性著色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。(2)按陽性細胞百分比評分:≤5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,≥76%為4分。將兩項得分結果相乘:0～7分為低表達,8～12分為高表達[6]。依據抗體使用說明,GIPC2陽性定位于細胞質。

1.4 GEPIA數據庫分析GEPIA是以癌癥基因組圖譜TCGA和基因型-組織表達GTEx數據為基礎的應用程序[7]。本研究通過GEPIA數據庫分析GIPC2在不同腫瘤和其對應癌旁正常組織中的表達差異,及其與結直腸癌患者TNM分期和預后的相關性。

1.5 統計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析,計數資料以例數和百分率(%)描述,組間差異采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。生存分析采用Kaplan-Meier法,生存曲線比較采用Log-rank檢驗,評估GIPC2表達與結直腸癌患者預后的關系。以上均為雙側檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GEPIA數據庫分析結直腸癌中GIPC2表達在m6A甲基化修飾及EMT構建的結直腸癌多基因模型的生信分析中,篩選EMT基因進行加權基因共表達網絡分析,應用Cox分析篩選出與m6A相關的模塊基因,通過分析風險比及預后顯著性,得到特征基因合計9個,其中GIPC2:HR=1.57,P<0.001,提示GIPC2與結直腸癌的發生密切相關;GEPIA數據庫檢索結果顯示,GIPC2在多種腫瘤中的表達發生變化,其在結直腸癌組織中的表達顯著低于癌旁正常腸組織(圖1A);生存預測顯示,低表達GIPC2的患者生存率更低(圖1B);GIPC2與結直腸癌的TNM分期密切相關(圖1C)(P<0.01)。

圖1 GEPIA數據庫分析:A.GIPC2在結直腸癌組織和癌旁正常腸組織中的表達;B.GIPC2表達與結直腸癌患者預后的關系;C.GIPC2表達與結直腸癌TNM分期的關系

2.2 結直腸癌組織和癌旁正常腸組織中GIPC2的表達免疫組化結果顯示,GIPC2表達定位于腺上皮胞質(圖2)。95例結直腸癌中GIPC2高表達40例(42.1%)(圖2A),低表達55例(57.9%)(圖2B);對應癌旁正常腸組織中GIPC2高表達82例(86.3%)(圖2C),低表達13例(13.7%)(圖2D)。與癌旁正常腸組織相比,結直腸癌組織中GIPC2多呈低表達,兩組相比差異有顯著性(P<0.001)。

ABCD

2.3 GIPC2表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性統計分析顯示,GIPC2表達與患者性別、年齡、腫瘤大體類型和腫瘤最大徑無關(P均>0.05);與淋巴結轉移、腫瘤分化程度和TNM分期相關(P均<0.05,表1)。

表1 GIPC2表達與結直腸癌臨床病理特征的相關性[n(%)]

2.4 GIPC2表達與結直腸癌患者預后的關系95例結直腸癌患者中19例失訪。生存分析結果顯示,低表達GIPC2結直腸癌患者的2年生存率(47.3%)明顯低于高表達GIPC2患者(72.5%),差異有統計學意義(P<0.05,圖3)。

圖3 Kaplan-Meier法分析GIPC2表達與結直腸癌患者預后的關系

3 討論

結直腸癌來源于結直腸黏膜上皮,常由基因突變引起,基因異常表達可影響結直腸癌的發生[8]。結直腸癌腫瘤標志物現以CEA、CK20、Villin、CDX-2、HER2等為主,對診斷、治療和預后具有一定的意義[9]。因結直腸癌早期缺乏特異性體征,中晚期病變深入盆腔,導致患者預后不良[10]。因此,尋找有效的早期診斷指標和治療靶點成為臨床研究的熱點。

GIPC基因由GH1、GH2和PDZ三個結構域共同構成[11]。GIPC2(GIPC PDZ domain containing family member 2)與GIPC1和GIPC3共同構成GIPC家族,具有進化的保守性和功能的相似性。GIPC1可與多種蛋白相互作用,參與跨膜分化程度和TNM分期的組間比較采用Fisher確切概率法,其余采用χ2檢驗蛋白轉運、調控信號通路等[12]。有報道稱,GIPC2是一種內分泌特異性腫瘤抑制基因,在嗜鉻細胞瘤中表達下調,激活p27的轉錄和表達,從而抑制細胞增殖和細胞周期[13]。此外GIPC2在急性淋巴細胞白血病中的表達下調,在雌激素誘導的乳腺腫瘤中表達上調;GIPC2的體細胞突變發生于黑色素瘤和卵巢癌中;GIPC2的高甲基化和低表達則導致乳頭狀腎細胞癌患者的存活率低[14]。最新研究表明m6A甲基化修飾通過多種途徑參與調控結直腸癌的分化增殖過程,其主要轉錄因子Snail、ZEB1/2和Twist1/2可能發揮重要作用[15]。有研究證實EMT轉錄因子的表達水平與結直腸癌患者的總生存率有關[16]。還有研究指出,在結直腸癌組織中GIPC2 mRNA和蛋白水平均顯著下調[17]。截至目前,GIPC2在結直腸癌中的表達及臨床意義尚未見詳細報道。

基于m6A甲基化修飾和EMT構建結直腸癌多基因預后模型的研究結果提示,GIPC2表達與結直腸癌的發生、發展可能密切相關[4]。GEPIA數據庫的檢索也預測了結直腸癌中GIPC2的表達低于癌旁正常腸組織。本組免疫組化染色顯示,GIPC2表達于腺上皮胞質,在正常腸組織中呈高表達,在結直腸癌組織中呈低表達;GIPC2在結直腸癌中的陽性率明顯降低(P<0.05)。GIPC2表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移和TNM分期相關(P<0.05),這些結果均提示了GIPC2參與腫瘤侵襲和發展的過程,并且其表達水平越低,腫瘤分化越差。生存分析表明,低表達GIPC2患者較高表達患者的生存率更低(47.3%vs72.5%,P<0.05),推測GIPC2的下調很可能導致患者不良預后,其可以作為評估患者預后的指標。臨床可通過免疫組化檢測GIPC2表達為結直腸癌患者的臨床治療和預后評判提供一定的參考。

綜上,GIPC2可能參與結直腸癌的發生、發展、侵襲和轉移,影響患者預后,未來有可能作為新的結直腸癌臨床診斷和預后評估的可靠指標。后續我們將擴大樣本量并改進免疫組化手工染色方法,進一步探討GIPC2在結直腸癌中的作用機制。