基于JAK/STAT信號通路探討PRELID1表達在胃癌惡性生物學行為中的作用

夏勇生,趙 萌,楊一群,馬珍麗,桑夢倩,陳德利

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤,其病死率位居全球第4位[1]。我國是胃癌高發國家之一[2],且多數患者在就診時已處于進展期,以手術為主的綜合治療尚不能有效提升胃癌患者的5年生存率[3]。腫瘤細胞的無限增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為是導致胃癌預后不良的重要因素[4-5]。相關進化和淋巴興趣域蛋白1(PRELID1)在肝癌、子宮內膜癌和膠質瘤中的表達升高,其可通過增強線粒體內的物質轉運參與腫瘤細胞的惡性增殖過程[6-8]。目前,PRELID1在胃癌中的表達和生物學功能尚未見相關報道。本實驗利用TCGA數據庫和蚌埠醫學院第一附屬醫院診治的111例胃癌病例聯合分析PRELID1在胃癌和癌旁組織中的表達及與臨床病理特征的關系,利用生物信息學技術預測PRELID1調控胃癌的分子機制,并通過體內和體外實驗驗證,旨在豐富對PRELID1生物學功能的認識,為改善胃癌的遠期預后提供新思路[9]。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2013年1月～2016年12月在蚌埠醫學院第一附屬醫院行胃癌根治術的胃癌患者。納入標準:診斷為原發性胃癌;成功行胃癌根治術。排除標準:合并其他惡性腫瘤;術后死于非胃癌因素;患者病例資料缺失。依據以上標準最終入選111例胃癌患者,采集患者相關信息:(1)臨床資料:姓名、性別、年齡、術前腫瘤標志物指標如CEA、CA19-9、病理報告等;(2)生存資料:通過電話隨訪和門診復查等方式采集患者術后5年生存信息。(3)胃癌組織蠟塊:從蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科調取患者的手術標本蠟塊,包括癌組織和配對癌旁正常組織。本實驗獲蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會審核[倫科批字(2022)第199號],患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 將手術標本蠟塊連續切片后經脫蠟水化處理,再經抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉后,孵育一抗和二抗,DAB顯色和蘇木精復染細胞核后封固。鏡下(400×)隨機挑選5個不重復的視野,采用Image J軟件計算目標蛋白的積分光密度值(integrated optical density, IOD),并以癌旁IOD值為基準,計算癌組織和癌旁組織的相對IOD值。一抗PRELID1(稀釋比1 ∶200)購自Proteintech公司,Ki67(稀釋比1 ∶200)購自Abcam公司。

1.2.2生物信息學分析 GEPIA數據庫分析PRELID1在多種惡性腫瘤的表達情況。UALCAN數據庫分析PRELID1在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達差異及其與臨床特征的關系。Kaplan-Meier Plotter數據庫分析PRELID1的表達對預后的影響。由UCSC XENA下載STAD的HTSeq-Counts格式的文件并進行log2轉化,在基迪奧生物信息云平臺畫出滿足∣log2(FC)>2∣且P<0.05的DEGs火山圖,以P值為篩選條件選取前20的基因做KEGG分析,再將差異基因進行GSEA分析,預測PRELID1調控胃癌的途徑和機制。

1.2.3慢病毒轉染實驗 MGC803購自國家生物醫學實驗細胞資源庫,采用RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清)培養。利用慢病毒(上海吉凱基因公司)轉染調控MGC803細胞中PRELID1的表達,依據其表達量的高低分為LV-PRELID1組和Si-PRELID1組,Control組為未經處理的MGC803細胞。操作簡述為:將MGC803細胞鋪于6孔板中,37 ℃培養6 h,分別加入感染增強液、過表達慢病毒載體和特異性干擾(siRNA:AAGACTATGAAGGGTTTT GAATA),經12 h后更換為完全培養基再培養3天,最后通過含1 μg/mL嘌呤霉素的完全培養篩選出穩定表達細胞株,采用Western blot法驗證轉染效果。

1.2.4CCK-8實驗和Transwell實驗 CCK-8實驗:將MGC803細胞按3×103個/孔的密度鋪于96孔板中,37 ℃培養24 h,每孔加入20 μL的CCK-8溶液(北京索萊寶科技公司),繼續培養3 h,最后置于酶標儀中測定A450 nm。侵襲實驗:將20 μL基質膠(美國康寧公司)加入Transwell上室,37 ℃培養4 h。用無血清培養基重懸MGC803細胞,按1×104個/孔的密度加入上室,再將800 μL完全培養基加入下室,37 ℃培養24 h。吸除下室的培養基,擦去上室的剩余細胞,4%多聚甲醛固定侵襲到下室的細胞并用0.2%結晶紫染色,置于顯微鏡下觀察并采集照片。遷移實驗:除不加基質膠外,其余同侵襲實驗。

1.2.5Western blot法 利用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞或組織的總蛋白并進行定量,再依次進行SDS-PAGE電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉、孵育一抗和二抗,利用化學發光法和多功能凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)采集圖片,采用Image J軟件分析目標蛋白的相對表達量。一抗PRELID1購自Proteintech公司,JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3購自Abcam公司,以β-actin為內參,抗體稀釋比均為1 ∶1 000。

1.2.6裸鼠皮下成瘤模型 將購自江蘇集萃藥康生物公司的18只雄性BALB/c-Nude裸鼠[8周齡、體重約(20±2)g]隨機分為3組,每組6只,分別接種PRELID1表達量不同的3組MGC803細胞,并據此將小鼠分為LV-PRELID1組、Si-PRELID1組和Control組。操作步驟:將MGC803細胞消化、離心并重懸成密度為每毫升1×108個細胞懸液,用注射器抽取100 μL懸液接種到裸鼠的背部皮下,正常飼養14天后,麻醉狀態下處死小鼠,取出瘤體,拍照并計算腫瘤體積。

2 結果

2.1 胃癌組織中PRELID1的表達GEPIA和UALCAN數據庫分析發現PRELID1在胃癌組織中高表達且明顯高于癌旁組織(P<0.001,圖1A、B)。免疫組化檢測結果顯示,111例胃癌組織中PRELID1和Ki67的表達高于癌旁組織(圖1C)。Spearman相關性分析顯示,胃癌組織中PRELID1表達與Ki67的表達呈正相關(P<0.001,圖1D)。

C胃癌組織癌旁組織

2.2 PRELID1表達與臨床病理特征的關系UALCAN數據庫顯示PRELID1的表達量與淋巴結轉移和腫瘤分期呈正相關(P<0.05,圖2)。以胃癌組織中PRELID1相對IOD值的中位數為界,將本組病例分為低表達組(n=55)和高表達組(n=56)。統計分析發現,PRELID1高表達組中CEA≥5 μg/L(P=0.004)、N2+N3分期(P=0.003)的患者比例顯著高于PRELID1低表達組(表1)。

表1 PRELID1表達與胃癌臨床病理特征的關系[n(%)]

圖2 胃癌組織中PRELID1表達量與淋巴結轉移和腫瘤分期的關系:A.PRELID1表達與淋巴結轉移的關系;B.PRELID1表達水平與腫瘤分期的關系;*P<0.05

2.3 PRELID1表達與胃癌患者預后的關系Kaplan-Meier Plotter數據庫表明PRELID1高表達組患者的總生存期比低表達組患者短(P=0.003 9,圖3A);Kaplan-Meier法分析本組111例患者的生存數據顯示,PRELID1高表達組患者的5年生存率顯著低于PRELID1低表達組(P<0.000 1,圖3B)。

圖3 PRELID1表達水平與胃癌患者預后的關系:A.Kaplan-Meier Plotter數據庫分析PRELID1高表達降低胃癌患者的總生存率;B.Kaplan-Meier法分析PRELID1高表達降低胃癌患者術后5年生存率

2.4 影響胃癌根治術后5年生存率的危險因素分析單因素分析聯合多因素Cox回歸分析顯示:PRELID1高表達、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3+T4分期和N2+N3分期是影響胃癌患者根治術后5年生存率的獨立危險因素(P均<0.05)。ROC曲線表明PRELID1的表達對胃癌患者行根治術后的5年生存率具有一定的預判價值(P<0.001,圖4,表2)。

表2 影響胃癌患者根治術后5年生存率的危險因素分析

圖4 ROC曲線分析PRELID1表達對胃癌患者術后5年生存率的預判價值

2.5 生物信息學預測PRELID1的生物學功能基于TCGA-STAD數據集對胃癌樣本及正常樣本進行差異表達基因分析,發現PRELID1在胃癌組織中表達顯著上調(P<0.05,圖5A)。KEGG富集分析結果提示PRELID1在胃癌中的作用機制和JAK-STAT信號以及癌癥中的轉錄調控異常有關(P<0.05,圖5B)。GSEA富集分析結果顯示DNA復制功能被上調(P<0.05,圖5C)。

圖5 生物信息學預測PRELID1的生物學功能:A.火山圖分析PRELID1在胃癌組織中的表達水平;B.KEGG富集分析PRELID1在胃癌中的作用機制;C.PRELID1在胃癌組織中的GSEA富集分析

2.6 PRELID1體外通過JAK/STAT信號對胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響慢病毒成功調控MGC803細胞中PRELID1的表達量(P<0.05,圖6A、B)。CCK-8結果顯示,與Control組相比,Si-PRELID1組胃癌細胞增殖能力減弱(P=0.026),而LV-PRELID1組增殖能力則增強(P=0.016,圖6C)。Transwell實驗表明,LV-PRELID1組胃癌細胞的遷移(P=0.016)和侵襲(P=0.025)能力較Control組增強,而Si-PRELID1組則遷移(P=0.048)和侵襲(P=0.029)能力降低(圖6D)。Western blot實驗發現,與Control組相比,p-JAK(P<0.001)和p-STAT(P=0.002)蛋白在LV-PRELID1組中表達升高,在Si-PRELID1組中p-JAK(P=0.044)和p-STAT(P=0.048)蛋白表達則降低(圖6E、F)。

圖6 PRELID1體外通過JAK/STAT信號對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響:A、B.慢病毒調控MGC803細胞中PRELID1的表達;C.PRELID1表達對胃癌細胞增殖的影響;D.Transwell實驗檢測PRELID1表達對胃癌細胞遷移和侵襲的影響;E、F.Western blot實驗檢測PRELID1表達對胃癌細胞中JAK/STAT信號的影響;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.7 PRELID1體內通過JAK/STAT信號對胃癌細胞增殖的影響裸鼠皮下成瘤實驗顯示,LV-PRELID1組裸鼠的腫瘤組織體積值高于Control組(P=0.047,圖7A、B),而Si-PRELID1組則低于Control組(P=0.005,圖7A、B)。Western blot法檢測結果發現:與Control組相比,LV-PRELID1組中p-JAK(P<0.001)和p-STAT(P<0.001)蛋白的表達被促進,Si-PRELID1組中p-JAK(P=0.021)和p-STAT(P=0.017)蛋白表達被抑制(圖7C、D)。

圖7 體內實驗檢測PRELID1通過JAK/STAT信號對胃癌細胞增殖的影響:A、B.裸鼠皮下成瘤體積;C、D.Western blot法檢測PRELID1表達對胃癌組織中JAK/STAT信號的影響;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

胃癌細胞的惡性增殖和侵襲導致了腫瘤的生長和轉移,從而加劇了胃癌的惡化[10-11]。近年來,針對抑制癌細胞惡性增殖的研究,已受到大量學者的重視。本實驗聯合在線癌癥數據庫和蚌埠醫學院第一附屬醫院存檔的胃癌患者臨床數據,發現PRELID1在胃癌中的表達升高且與較差的生存率有關,細胞學實驗和動物實驗結果表明,PRELID1可能通過上調JAK/STAT信號促進胃癌細胞的惡性增殖、遷移和侵襲。

新近研究顯示:PRELID1編碼的蛋白質定位于線粒體膜間隙,其可通過調控心磷脂的合成影響氧化磷酸化進程、線粒體分裂、線粒體活性氧的產生等一系列線粒體驅動功能[12]。此外,PRELID1亦可通過調控線粒體的生物學功能參與腫瘤細胞的惡性增殖過程[13],且PRELID在肝癌、子宮內膜癌和膠質瘤中的表達升高,并與患者的生存期縮短有關[6-8]。本實驗利用GEPIA和UALCAN數據庫分析發現PRELID1在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織,并通過本實驗的臨床病例得到驗證。通過分析PRELID1表達與臨床病理特征的關系發現:PRELID1高表達、CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T3+T4分期和N2+N3分期是影響胃癌患者根治術后5年生存率的獨立危險因素,且PRELID1的表達對患者根治術后5年生存率具有一定的預判價值。目前,PRELID1調控胃癌的作用途徑并不明確。

回顧文獻發現,PRELID1在癌細胞增殖過程中發揮關鍵作用,參與腫瘤細胞生長和凋亡的調控,被認為是癌癥預后不良的標志[12-13]。作者基于TCGA數據分析并獲得PRELID1高、低表達組的差異基因,并進行基因富集分析。GSEA結果顯示DNA復制和細胞增殖的相關生物學過程被促進,且KEGG富集分析結果表明,PRELID1調控胃癌可能與癌癥中的轉錄調控異常有關,作者進一步開展體外和體內實驗進行驗證。首先,體外實驗利用慢病毒調控胃癌細胞中PRELID1的表達水平,并通過CCK-8和Transwell實驗發現PRELID1促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲;其次,通過體內實驗構建裸鼠皮下成瘤模型發現PRELID1促進腫瘤生長。KEGG富集分析結果提示PRELID1可能通過JAK/STAT信號促進胃癌細胞的惡性生物學行為。JAK/STAT途徑作為多種細胞因子和生長因子的主要信號傳導機制,促進腫瘤細胞發生增殖和遷移[14-16]。Western blot實驗檢測結果發現,胃癌細胞和腫瘤組織中PRELID1表達可促進JAK/STAT信號蛋白的表達。因此,PRELID1可能通過上調JAK/STAT信號促進胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲的惡性生物學行為。

本實驗首先通過對UALCAN和Kaplan-Meier-plotter等數據庫和蚌埠醫學院第一附屬醫院的臨床病例進行深入分析:首先,PRELID1在胃癌組織中的表達異常升高且與臨床預后不良有關,豐富了PRELID1生物學功能的認識,也為改善胃癌患者預后提供了新視角[17-18];其次,本實驗通過細胞學研究和動物實驗驗證PRELID1通過上調JAK/STAT信號調控胃癌細胞的惡性生物學行為,對于PRELID1調控胃癌的分子機制的深入研究有望為胃癌治療策略的革新提供更多可能[19]。本實驗尚存在一定的局限性:單中心的研究樣本數量有限,有待擴大樣本量以明確結果的可靠性;本實驗只驗證了PRELID1通過JAK/STAT信號調控胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲,可能忽略了PRELID1作用于胃癌的其他途徑和分子機制。

綜上,本實驗發現PRELID1在胃癌組織中表達升高,其可能通過激活JAK/STAT信號促進胃癌細胞的惡性生物學行為。