SOX9活化Wnt/β-catenin信號通路對食管鱗狀細胞癌細胞增殖的影響

張之鈺,王良海,徐貴璇,李 鋒,陳 紅

食管癌病死率位居全球惡性腫瘤的第6位[1]。我國是食管癌高發地區,其中約90%為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[2]。食管癌的發生是由環境因素(如吸煙、飲酒、飲食等)和遺傳因素(如甲基化、表觀遺傳學改變等)等多因素、多途徑相互作用的復雜過程[3-5]。近年來癌癥在診斷和治療等方面雖發展飛速,但食管癌的5年生存率仍不足30%[6]。因此,揭示食管癌發生、發展的分子機制對探尋其有效的治療靶點十分必要。

SOX9是SRY-type HMG box(Sex determining region Y-related high-mobility-group box)基因家族成員之一,主要參與早期胚胎發育的調控[7]。最近有研究表明SOX9與胃腺癌[8]、肝細胞癌[9]、結直腸癌[10]等消化道腫瘤的進展密切相關。在食管癌中,SOX9被證實呈高表達[11-12]。本團隊前期研究發現,SOX9與miR-203a、YAP和linc-ROR共同參與ESCC的發生、發展[13-15]。然而,SOX9調節ESCC進展的分子機制尚未完全闡明,本實驗通過探討SOX9過表達對ESCC細胞增殖能力和相關通路的影響,旨為進一步明確ESCC發生、發展機制及靶向治療提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015～2021年首都醫科大學附屬北京朝陽醫院和石河子大學醫學院第一附屬醫院存檔的188例ESCC手術切除標本和134例癌旁正常組織,患者年齡34～78歲,中位年齡59.5歲?；颊咝g前均未接受任何放、化療。標本均經兩位高年資病理醫師復閱。本實驗經我院倫理委員會批準,患者均知情同意。

1.2 細胞和主要試劑人類ESCC細胞系Eca109、TE-1由我院醫學研究中心保留并傳代。Total RNA Kit I購自OMEGA公司,SuperQuickRT MasterMix(for Real-Time PCR)、UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀公司,胎牛血清和RPMI Medium 1640培養液購自美國GBICO公司,Lipofectamine 2000 Regent購自美國Invitrogen公司,CCK-8購自日本同仁公司,RIPA真核細胞裂解液、PMSF、PVDF膜購自北京Solarbio公司,ECL高敏化學發光檢測試劑盒購自美國Thermo公司,SOX9(AB5535)抗體購自Millipores公司,β-catenin(sc-7963)抗體購自Santa公司,LGK974購自MCE公司,免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司,siRNA和過表達SOX9的慢病毒由上海吉瑪制藥公司設計與構建,qRT-PCR相關引物由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1組織芯片制備 設計組織芯片排版,使用組織芯片蠟塊制備儀制作空白受體蠟塊,孔徑設定為2 mm,HE染色切片由病理醫師重新判讀,在顯微鏡下標記腫瘤區域和癌旁正常組織各2處,用穿刺針將標記區域組織取出按照排版順序和方向依次填入空白受體蠟塊上提前打好的孔中。將制備好的組織芯片蠟塊于42 ℃烤30 min,室溫冷卻后再烤10 min,直至組織與蠟塊充分融合。

1.3.2免疫組化 采用免疫組化EnVision法檢測SOX9蛋白表達。將石蠟組織芯片4 μm厚切片置于防脫玻片上烤片60 min,脫蠟,水化,用EDTA高壓抗原熱修復,內源性過氧化物酶滅活封閉,添加一抗SOX9(稀釋比1 ∶600)4 ℃冰箱孵育過夜,PBS沖洗后加適量酶標抗兔IgG聚合物37 ℃孵育30 min,PBS緩沖液震洗,DAB顯色2 min,清水沖洗后蘇木精復染,脫水,封片。

結果判讀:SOX9免疫組化結果由兩位高年資病理醫師獨立閱讀,高倍鏡下觀察切片,陽性染色評分標準以著色強度和著色細胞數綜合判斷:(1)按陽性細胞染色強度評分:未著色為0分,淡棕黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;(2)按陽性細胞百分比評分:無陽性細胞為0分,陽性細胞數≤25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。將兩項得分結果相乘作為最終評分:<4分為低表達,≥4分為高表達。

1.3.3細胞培養和轉染 細胞系Eca109、TE-1均常規培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中,37 ℃、5%CO2培養細胞。將狀態良好處于對數生長期的Eca109、TE-1細胞接種于6孔板中繼續培養,當細胞生長融合為50%～60%時,參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書,給TE-1細胞分別轉染siSOX9和siNC;在嚴格遵守慢病毒操作手冊前提下,將Eca109細胞轉染過表達SOX9和Vector病毒。siSOX9序列:正義鏈5′-GGAGACUUCUGAACGAGAGTT-3′,反義鏈3′-CUCUCGUUCAGAAGUCUCCTT-5′。

1.3.4全轉錄組芯片HTA2.0(Affymetrix) 本團隊提供Eca109-Vector和Eca109-SOX9細胞樣品,由北京康普森生物公司進行全轉錄組芯片檢測。使用Expression Console(version 1.4.1,Affymetrix)軟件處理原始數據文件,提取原始探針信號值,使用RMA算法對原始探針信號值進行背景校正和標準化。然后使用Transcriptome Analysis Console(version 3.0,Affymetrix)軟件對不同分組進行差異分析和可變剪接分析,統計學檢驗使用單因素方差分析結果的顯著性。

1.3.5qRT-PCR 使用Total RNA Kit I試劑盒提取細胞總RNA,提取RNA后用RNA瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性,電泳結果為出現28S、18S條帶,且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍,則認定RNA樣品合格;隨后用酶標儀檢測RNA樣品OD260 nm/280 nm,數值位于1.8～2.0為合格樣品。參照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA,用cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件:預變性95 ℃ 600 s,1個循環;變性95 ℃ 15 s,退火/延伸60 ℃ 60 s,40個循環。所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.6CCK-8 將5 000個細胞接種于96孔板中,每組5個復孔,根據實驗設計使用不同濃度(0、0.25、0.5、1、2 μmol/L)LGK974處理細胞,將孔板置于培養箱(37 ℃、5%CO2)中分別培養0、1、2、3天,根據時間點取出孔板利用酶標儀在450 nm條件下檢測OD值并記錄。

1.3.7Western blot法 收集細胞,加入按RIPA ∶PMSF=100 ∶1比例配制的裂解液,離心后吸取上清液,用Nano Drop分光光度計檢測蛋白樣品的純度和濃度,通過加入細胞裂解液使各管樣品濃度一致,用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,加入一抗SOX9(稀釋比1 ∶1 000)、β-catenin(稀釋比1 ∶200)和β-actin(稀釋比1 ∶10 000)4 ℃孵育過夜,二抗(稀釋比1 ∶10 000)室溫孵育2 h,按照發光試劑說明書步驟在暗室中曝光。用Image J軟件對結果進行灰度值分析。

1.4 隨訪患者術后定期電話隨訪,開始時間為手術之日,平均每6個月隨訪1次,以患者死亡時間為截止時間,中途失訪者將最后1次隨訪時間納入生存分析,隨訪截至2023年3月。

2 結果

2.1 ESCC和癌旁正常組織中SOX9的表達免疫組化結果顯示,SOX9蛋白表達主要位于癌細胞胞核(圖1A)。188例ESCC中111例(111/188,59%)呈SOX9蛋白高表達,134例癌旁正常組織中22例(22/134,16.4%)呈SOX9高表達。SOX9在ESCC組織(4.58±3.04)中的表達顯著高于癌旁正常組織(1.56±2.08,P<0.001,圖1B)。

圖1 A. 食管鱗狀細胞癌組織和癌旁正常組織中SOX9的表達,EnVision法;B.食管鱗狀細胞癌和癌旁正常組織中SOX9的表達評分,***P<0.001

2.2 SOX9表達與ESCC臨床病理特征的相關性SOX9表達與ESCC患者性別、年齡和TNM分期均無關,與腫瘤分化程度和浸潤深度有關(P<0.05,表2)。其中,SOX9蛋白在低分化組中的高表達率(83.3%,20/24)明顯高于高分化組(51.8%,28/54)和中分化(57.3%,63/110)組。

表2 SOX9表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系

2.3 SOX9表達與ESCC患者預后的關系188例中58例患者獲得隨訪,隨訪1～96個月,中位生存期35.2個月。Kaplan-Meier曲線顯示SOX9高表達患者的生存率明顯低于SOX9低表達患者,兩組間差異有統計學意義(P<0.05,圖2)。

圖2 SOX9表達與食管鱗狀細胞癌患者總生存率的關系

2.4 SOX9對Wnt/β-catenin信號通路的影響全轉錄芯片檢測發現,Eca109-SOX9中Wnt/β-catenin通路的關鍵分子WNT5A、AXIN2和FZD7的表達顯著高于Eca109-Vector(圖3A)。干擾TE-1中SOX9表達后,qRT-PCR檢測顯示,WNT5A(0.77±0.068)、AXIN2(0.81±0.023)和FZD7(0.83±0.047)的mRNA表達顯著低于對照組(P均<0.01,圖3B)。Western blot法檢測結果顯示,過表達SOX9后活化/非磷酸化β-catenin蛋白表達水平比對照組明顯增高,干擾SOX9后活化/非磷酸化β-catenin的蛋白表達水平明顯降低(圖3C)。

圖3 SOX9對Wnt/β-catenin信號通路的影響:A.熱圖顯示Eca109-Vector與Eca109-SOX9中Wnt信號通路相關分子的表達差異;B.qRT-PCR分析干擾TE-1中SOX9的表達,Wnt/β-catenin通路中關鍵分子WNT5A、AXIN2和FZD7 mRNA的表達,**P<0.01,***P<0.001;C.SOX9蛋白和活化/非磷酸化β-catenin蛋白在Eca109-Vector、Eca109-SOX9和TE-1-NC、TE-1-siSOX9中的表達

2.5 LGK974對ESCC細胞增殖的影響用不同濃度(0、0.25、0.5、1、2 μmol/L)LGK974處理高表達SOX9的細胞系(TE-1、Eca109-SOX9),CCK-8結果顯示,LGK974抑制TE-1(P<0.05,圖4A)、Eca109-SOX9(P<0.05,圖4B)細胞的增殖能力。

圖4 不同濃度LGK974處理后TE-1(A)、Eca109-SOX9(B)細胞增殖能力的變化,***P<0.001

2.6 SOX9調節LGK974對ESCC細胞增殖的影響用1 μmol/L LGK974分別處理Eca109-Vector、Eca109-SOX9細胞,CCK-8結果顯示LGK974對低表達SOX9的Eca109-Vector細胞增殖能力無影響,卻能顯著降低Eca109-SOX9的增殖能力(P<0.001,圖5)。

圖5 SOX9表達對LGK974抑制ESCC細胞增殖能力的影響,***P<0.001

2.7 LGK974對SOX9蛋白表達的影響用不同濃度(0、0.25、0.5、1、2 μmol/L)LGK974處理高表達SOX9的細胞系TE-1(圖6),Western blot法檢測結果顯示SOX9蛋白表達不受LGK974調節。

圖6 Western blot法檢測LGK974對SOX9蛋白表達的影響

3 討論

本實驗采用免疫組化法檢測ESCC組織中SOX9的表達,結果發現SOX9在ESCC組織中的表達顯著高于癌旁正常組織(P<0.001),并且高表達SOX9患者的總生存率明顯低于低表達者(P<0.05),這與SOX9在胰腺癌[16]、前列腺癌[17]、肝癌[18]和非小細胞肺癌[19]等腫瘤中的作用一致。此外,SOX9蛋白表達與ESCC患者性別、年齡和TNM分期無關,而與腫瘤分化程度和浸潤深度有關(P<0.05),表明隨著疾病惡性程度的增加,SOX9蛋白高表達的患者增多,提示SOX9可能是一項對診斷和預后有重要指導意義的指標。

前期研究發現SOX9在Eca109中低表達,在TE-1中高表達[14],因此本實驗在Eca109中構建過表達模型,在TE-1中構建沉默模型。通過對全轉錄組芯片檢測結果進行生物信息學分析發現,過表達SOX9的Eca109-SOX9細胞中WNT5A、AXIN2和FZD7表達顯著高于對照組。WNT5A是Wnt蛋白家族重要成員之一,主要介導激活非經典Wnt信號通路,目前已證實WNT5A參與多種腫瘤的發生、發展,但其在不同腫瘤中所扮演的角色可能完全相反[20]。AXIN2是Wnt/β-catenin信號通路中的重要調節因子,參與細胞增殖、分化、遷移、凋亡等多種生物學功能[21]。FZD7是Wnt/β-catenin信號通路的重要受體,已被證實可促進腫瘤生長、轉移、腫瘤干細胞特性維持和耐藥等[22]。這就提示SOX9可能調節Wnt/β-catenin信號通路,這與在肝癌[23]、非小細胞肺癌[24]、結直腸癌[25]中的研究結果一致。本實驗干擾TE-1細胞中SOX9的表達后,用qRT-PCR檢測WNT5A、AXIN2和FZD7,結果提示干擾組mRNA表達水平顯著低于對照組,且差異有統計學意義。進一步檢測發現,在Eca109中過表達SOX9,活化/非磷酸化β-catenin蛋白表達水平比對照組明顯增高,干擾TE-1中SOX9的表達后β-catenin蛋白表達水平顯著降低。上述結果證實了SOX9可能活化Wnt/β-catenin信號通路。

眾所周知,小分子化合物LGK974是Wnt特異性?；D移酶Porcupine抑制劑,通過阻止Wnt配體的十六烷?；?阻斷Wnt的包膜外運輸,進而抑制β-catenin過度生成,最終抑制細胞的過度生長。有研究證明LGK974在多種腫瘤進展中具有抑制作用[26],但在ESCC中的相關研究證據較少。臨床上食管癌患者的主要治療方法為手術切除和化療,治療效果不盡人意,因此靶向藥物的研發將是ESCC治療的重點和熱點。本實驗設計檢測不同濃度LGK974對高表達SOX9 ESCC細胞TE-1、Eca109-SOX9和Eca109-Vector細胞增殖能力的影響,來進一步驗證SOX9能否通過Wnt信號通路對ESCC增殖產生影響,并驗證LGK974作為ESCC治療的潛在價值。結果顯示LGK974可顯著抑制高表達SOX9細胞的增殖能力,卻對低表達SOX9的Eca109細胞無影響,這提示LGK974對細胞增殖能力的抑制作用可能需要SOX9的介導。為驗證SOX9表達是否受LGK974影響,本實驗用LGK974處理內源性高表達SOX9的細胞系TE-1,結果顯示SOX9蛋白表達不受LGK974調節。本實驗證實了SOX9能通過Wnt信號通路抑制ESCC的增殖,并為LGK974作為一種治療高表達SOX9 ESCC患者的靶向藥物提供了證據。

綜上所述,SOX9在ESCC組織中表達上調,與腫瘤分化程度和浸潤深度相關,同時SOX9高表達與ESCC患者的不良預后明顯相關。SOX9可通過Wnt/β-catenin通路促進ESCC細胞的增殖,提示SOX9可能參與ESCC的發生、發展,有望成為ESCC預后的生物學標志物和治療靶點。但由于本實驗只分析了SOX9通過Wnt/β-catenin通路對ESCC細胞增殖能力的影響,兩者對ESCC其它生物學行為的作用還需進一步研究。