食管癌多倍體腫瘤巨細胞DNA定量分析

張國棟,任旖琳,王 衛

食管癌是全球第六大常見的癌癥死亡原因,患者預后較差,5年生存率僅為15%～25%[1]。近年來,多倍體腫瘤巨細胞(polyploid giant cancer cells, PGCCs)在惡性腫瘤研究中被重新重視,病理醫師在日常工作中常發現腫瘤組織中含有單個巨大的細胞核或多個細胞核的瘤巨細胞。Fei等[2]將細胞核體積與二倍體腫瘤細胞核的比例≥3的癌細胞定義為PGCCs。PGCCs促進實體腫瘤的異質性,具有腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)的特征[3]。PGCCs的數量通常隨著病理分級和分期程度的增高而增加[3-5]。CSCs具有自我更新和多能分化的能力,以促進癌癥進展和化療耐藥[6]。CD133是食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)CSCs的標志物[7],ESCC中CD133的中位陽性率為31.9%(21%～44.2%),CD133+ESCC患者的5年總生存率僅為1.27%(0.93%～1.73%)[8]。CD133+腫瘤細胞和PGCCs均與腫瘤的惡性進展相關,目前有關CD133+腫瘤細胞與PGCCs關系的相關研究報道較少,因此本文將重點分析CD133+CSCs與PGCCs DNA含量之間的關系,探究定義PGCCs DNA含量的閾值。

1 材料與方法

1.1 細胞培養人ESCC細胞系TE-1和KYSE-150購自德國生物材料資源中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ)。細胞系用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養液,在37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.2 PGCCs誘導TE-1細胞置于10 cm培養皿中培養,當細胞密度達90%時,加入300 nmol/L紫杉醇(M1970,Abmole公司)培養24 h,然后撤銷紫杉醇,更換培養基,繼續培養至第9天獲得TE-1-PGCCs。

1.3 細胞塊制作TE-1對照細胞和紫杉醇處理細胞分別消化,離心富集,在10%中性福爾馬林中固定12 h。按照細胞塊制備試劑盒(凈優,北京賽普九洲公司)說明書制作細胞塊,后經脫水、浸蠟、包埋制作成石蠟細胞塊。

1.4 免疫細胞化學染色將制成的石蠟細胞塊4 μm厚切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化,EDTA高溫抗原修復,隨后按照通用兩步法檢測試劑盒(小鼠/兔增強聚合物法檢測系統)(貨號PV-9000,北京中杉金橋公司)實驗步驟操作:內源性過氧化物酶阻斷,一抗CD133(稀釋比1 ∶100)、CD44(稀釋比1 ∶100)和c-Myc(稀釋比1 ∶100)4 ℃孵育過夜(均購自Proteintech公司),滴加反應增強劑,滴加HRP標記的抗小鼠/兔IgG聚合物室溫孵育1 h,DAB染色。

1.5 磁珠分選CD133+腫瘤細胞分別計數2×107個TE-1和KYSE-150細胞與CD133微珠(貨號130-097-049,Miltenyi公司)4 ℃孵育15 min,離心后棄上清液。細胞和磁珠被重懸并轉移至分離柱(貨號130-042-201,Miltenyi公司),安裝在MACS分離器上(miniMACS,貨號130-042-102)。用普通緩沖液洗滌獲得CD133-細胞(未結合磁珠),用洗脫緩沖液洗滌獲得CD133+細胞(結合磁珠)。

1.6 細胞DNA定量分析分選獲得的TE-1-CD133+、TE-1-CD133-、KYSE-150-CD133+、KYSE-150-CD133-細胞采用Liquid-Prep液基(廈門麥克奧迪醫療診斷公司)方法固定,滴片制成薄片,行Feulgen染色。所有Feulgen染色片用MotiCytometer全自動細胞DNA定量圖像分析系統進行掃描處理。定義掃描細胞數量為25 000,以標本中二倍體細胞作為內參照,并根據100多個參數特征值對被測細胞核進行自動分類和計數,其中DNA指數(DNA Index, DI)為關鍵參數,可表示DNA含量。DI計算方法:被測細胞的積分光密度(IOD)與二倍體細胞IOD的比值。如為二倍體細胞(N,染色體組的數量,作為單倍體基因組的倍數:1N是單倍體的精子或卵細胞染色體含量,2N是二倍體細胞的染色體含量),DI值為1±0.25;當1.25

1.7 統計學分析采用SPSS 16.0軟件對所有數據進行統計學分析,兩組間差異采用T檢驗分析,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫杉醇誘導食管癌細胞產生PGCCs驗證采用紫杉醇處理TE-1細胞誘導產生的TE-1-PGCCs經HE染色顯示,PGCCs細胞體積明顯大于對照組細胞(圖1A);DNA定量分析顯示,與對照組細胞相比,紫杉醇處理的細胞中≥5N亞群的比例顯著增加,而≤2N和2N～4N細胞亞群的比例顯著降低(P<0.000 1,圖1B);進一步觀察DI分布發現,紫杉醇誘導的細胞在DI≥4(≥8N)細胞亞群中顯著富集,對照組細胞也有少量≥8N細胞(圖1C),表明普通培養細胞中也存在一定數量的≥8N腫瘤細胞,這提示定義PGCCs DNA含量的最小數值可能是8N。

圖1 紫杉醇誘導食管癌細胞產生PGCCs驗證:A.HE染色顯示TE-1-DMSO細胞和紫杉醇誘導的TE-1-PGCCs體積大小;B.細胞DNA定量分析每個亞群中的細胞比例;C.細胞DNA定量分析不同DI細胞亞群的分布,每個“+”代表1個細胞;***P<0.000 1

2.2 PGCCs中CD133、CD44、c-Myc蛋白的表達免疫細胞化學染色檢測CSCs標志物CD133、CD44和c-Myc蛋白表達水平,結果顯示:TE-1-PGCCs高表達CD133,對照細胞弱表達CD133;部分TE-1-PGCCs高表達CD44和c-Myc,對照細胞則不表達CD44和c-Myc(圖2)。上述結果提示紫杉醇誘導的PGCCS高表達CSCs標志物,尤其是CD133。

DMSO紫杉醇CD133CD44c-Myc

2.3 CD133+和CD133-亞群細胞的形態學特征將采用CD133磁珠分選獲得的TE-1-CD133+細胞和TE-1-CD133-細胞分別行Feulgen染色,結果顯示:與TE-1-CD133-組相比,PGCCs主要富集于TE-1-CD133+組(圖3A)。CD133-細胞的有絲分裂相明顯多于CD133+細胞(P<0.000 1,圖3B、C),說明CD133-細胞的增殖能力強于CD133+細胞。與CD133-細胞相比,CD133+細胞含有更多的(直徑<20)小核或大核(直徑>30 μm)細胞,而中等大小核(直徑20～30 μm)細胞數量顯著低于CD133-組(圖3D)。

圖3 CD133-和CD133+食管癌的細胞特征:A.低倍視野廣泛分布PGCCs(500 μm);B.高倍視野有絲分裂細胞(黑箭頭),紅箭頭示PGCCs(50 μm);C.低倍視野下細胞有絲分裂相數量(5個隨機視野),***P<0.000 1;D.低倍視野中不同核直徑細胞的比例(5個隨機視野),***P<0.000 1

2.4 CD133+和CD133-亞群細胞DNA含量特征細胞DNA定量分析顯示,TE-1-CD133+和KYSE-150-CD133+中富集了DI≥4(≥8N)的PGCCs,而TE-1-CD133-和KYSE-150-CD133-細胞中幾乎不存在這種多倍體細胞(圖4)。本組結果提示,在ESCC中PGCCs(特別是≥8N的PGCCs)是CSCs的一個特殊亞群。

圖4 細胞DNA定量分析:A.TE-1-CD133-和TE-1-CD133+細胞亞群的DNA定量分析;B.KYSE-150-CD133-和KYSE-150-CD133+細胞亞群的DNA定量分析;DI=1(2N)為二倍體,DI=2(4N)為四倍體,DI=4(8N)為八倍體

3 討論

細胞多倍體化是由發育程序或應激誘導的,產生于細胞融合或細胞內復制的過程,內復制過程是細胞完成DNA復制后,不能完成胞質分裂或完全不進入M期[9]。多倍體現象在人類癌癥中較常見,PGCCs在多種癌癥中被發現,數量相對較少(5%～20%)[10]。在約37%的人類腫瘤中觀察到PGCCs,在化、放療和CoCl2模擬低氧環境下,PGCCs的數量可能顯著增加。在癌癥治療中,大多數基因毒性藥物可導致基因組休克和細胞體積增大,從而導致基因組復制和PGCCs形成。雖然PGCCs長期被忽略,但最近其被認為是引發癌癥、耐藥和轉移的罪魁禍首,PGCCs中核異型性的產生也是病理診斷中最重要的癌癥標志[11]。PGCCs基因組拷貝數增加,更適應缺氧微環境和各類應激,并通過無絲分裂更高效地產生子代細胞,這些機制可以共同工作,促進腫瘤快速惡性生長[12]。

PGCCs表達多種干細胞標志物,如胚胎干細胞標志物OCT4、NANOG、SOX2和YAP及某些CSCs標志物CD133、CD44等[3-4, 12-13],PGCCs與人類胚胎發生于早期的卵裂球高度相似,如果把腫瘤起源的第二條途徑(PGCCs途徑)與人類生命周期聯系起來,可將體細胞去分化經PGCCs形成的未分化腫瘤稱為卵裂球樣(性)腫瘤[3]。本實驗發現,紫杉醇誘導的TE-1-PGCCs高表達CSCs標志物CD133。未經紫杉醇處理的TE-1細胞中也含有少量的PGCCs,這部分PGCCs主要富集在CD133+細胞亞群,進一步對CD133+細胞進行DNA定量分析,發現八倍體(8N,相當于4個正常細胞核)及以上PGCCs幾乎完全富集在CD133+細胞亞群,提示≥8N的PGCCs是CSCs。

在另一項研究中,作者也發現PGCCs主要分布在鼻咽癌細胞CNE2-CD133+亞群,且分散在小細胞中,而CD133-細胞大小較為均一[14],本組在食管癌中觀察到的結果與之一致,提示這是在腫瘤中普遍存在的現象。PGCCs通過兩種不對稱分裂(非有絲分裂)方式產生子細胞:出芽和破裂,可以單獨或一起發生,隨后產生大量小體積的子代細胞[4]。卵巢癌HEY細胞的研究顯示,腫瘤出芽中的HEY-PGCCs高表達CD133和CD44,表明這些出芽的細胞具有CSCs樣特性[4],由于子細胞的數量遠超PGCCs,這可能解釋了CSCs的體積可以很小(子代細胞)或很大(PGCCs),但以小體積細胞為主。

Feulgen染色是一種DNA定量染色方法,染色強度與DNA濃度呈正比,通過測定染色細胞核的IOD來計算細胞核DNA含量,用DI來表示DNA含量。細胞DNA定量分析采用全自動數字掃描結合AI細胞識別和深度學習算法對細胞核中的DNA含量或染色體倍數進行定量檢測和分析,來判斷是否存在癌變或癌前病變的風險,同時為腫瘤的惡性程度提供參考依據。細胞DNA定量分析作為一種成熟的病理技術,已廣泛用于子宮頸脫落細胞的輔助診斷[15]。然而,當前仍主要通過細胞/細胞核等形態特征定義PGCCs。

綜上,本實驗通過分析食管癌細胞DNA含量、CSCs和PGCCs三者之間的關系,首次發現八倍體及以上的PGCCs是一類CD133+CSCs。這一發現可能為定義PGCCs提供了一個DNA含量的參考,也為開發靶向PGCCs治療腫瘤提供新思路。