神經調控技術在腦科學研究中的應用研究進展

劉夢楠，田蕭羽，2，李奕潼，吳寧，李錦，李紅

（1.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，神經精神藥理學北京市重點實驗室，北京 100850；2.中國人民解放軍醫學院，北京 100853；3.沈陽藥科大學無涯創新學院，遼寧沈陽 110016）

21世紀是腦科學的時代，腦科學研究主要是從生物醫學角度闡明大腦功能的神經基礎和工作原理［1］。抑郁、精神分裂癥和阿爾茨海默病等精神疾病危害人體健康和社會穩定。據世界衛生組織報道，腦疾病患者人數占比28%，已超越心血管和癌癥患者數量，給社會帶來了巨大負擔。了解大腦的結構和功能是當前最前沿的科學問題之一，因此腦科學研究的戰略地位至關重要［2］，世界各國對腦科學研究給予高度重視。

大腦是一個復雜的結構，過去對于大腦的研究聚焦于單個細胞或幾個細胞組成的簡單神經回路［3］，對于大批神經元是如何動態調控行為活動仍未完全解析。近年來，腦科學研究技術不斷涌現，化學遺傳、光遺傳等技術正朝向精準、瞬時、非侵入控制神經元活動的方向發展。在此基礎上又出現了利用磁熱、磁力效應控制細胞功能的磁遺傳技術，該技術有望克服化學遺傳技術的藥物起效延遲和光遺傳技術需光纖植入手術等局限，在新一代的腦科學研究中發揮重要作用。同時，經顱電刺激（transcranial electrical stimulation，TES）、經顱磁刺激（transcranial magnetic stimulation，TMS）、深部腦刺激（deep brain stimulation，DBS）和經顱超聲刺激（transcranial ultrasound stimulation，TUS）等技術在腦疾病的功能調控中也顯示出一定的效果。

1 化學遺傳技術

化學遺傳技術結合了化學方法與遺傳學原理，將人工設計的受體在特定細胞內表達，隨后與特異性藥物結合，從而激活或抑制細胞活性。

1.1 化學遺傳受體及配體

化學遺傳技術于20世紀80年代興起，早期的應用集中于對G 蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCR）的研究。GPCR 是真核生物細胞膜上最大的一類受體家族，與配體結合后可激活下游一系列信號通路，廣泛應用于神經科學領域。1991年，Strader 等［4］設計了一種突變型β2腎上腺素能受體，通過結合位點上的氨基酸突變改變受體的特異性結合能力，該受體不能與其相應的天然配體腎上腺素結合，而可被兒茶酚胺酯和酮激活。隨后，Coward等［5］于1998年在合成小分子激活GPCR策略的基礎上開發了工程化受體，命名為“僅由合成配體激活的受體（receptor activated solely by a synthetic ligand，RASSL）”。他們在κ 阿片受體原型基礎上引入突變，構建了2 個RASSL，這2 個受體對天然肽（如強啡肽）不敏感，但可被小分子藥物螺朵林（spiradoline）激活，從而抑制腺苷酸環化酶的活性［6］（表1）。但RASSL容易與其內源性受體競爭配體，存在配體和受體的非特異結合，且異位表達RASSL 可能會造成信號傳導異常。為克服以上問題，2007年Armbruster等［7］開發了“由人工設計藥物激活的人工設計受體（designer receptor exclusively activated by a designer drug，DREARD）”，該受體只能與人工設計的藥物結合，從而控制神經元活性，藥物代謝完成后神經元恢復原來狀態。在腦科學研究中最常用的是氯氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide，CNO）-毒蕈堿受體系統［7］（表1）。毒蕈堿受體是一種廣泛存在于動物體內的GPCR，其天然配體是乙酰膽堿，二者結合后可引發下游信號轉導，激活或抑制神經元。Armbruster等［7］將人源的毒蕈堿型受體突變，構建了人工設計的人源毒蕈堿M4 受體（human M4 muscarinic DREADD receptor coupled to Gi，hM4Di）和人工設計的人源毒蕈堿M3 受體（human M3 muscarinic DREADD receptor coupled to Gq，hM3Dq）。CNO 是非典型抗精神病藥物氯氮平的一種惰性代謝產物［8］，其不能激活內源性毒蕈堿受體，但可激活突變型毒蕈堿受體。在CNO 作用下，hM4Di 受體可通過激活Gi蛋白進而抑制神經元；hM3Dq 受體則可通過激活Gq蛋白進而激活神經元。CNO 可通過口服等非侵入方式給藥，調節神經元持續時間長，且在藥物擴散后能作用于分散分布的神經元［9］。最近，基于化學遺傳工具的研究集中于工程化的配體門控離子通道［10］。利用離子通道及其小分子激動劑可激活神經元中指定的離子電導，用于刺激或沉默神經元。其特點在于通過藥物選擇性配體結合域和離子通道孔域組合，允許不同的離子快速通過，可進行遠程控制，因此適用于對神經元的瞬時控制［9］，克服化學遺傳技術配體不穩定、藥物起效延遲等不足。

表1 常用神經調控技術的優勢和不足

1.2 化學遺傳技術在腦科學研究中的應用

由于化學遺傳技術可針對神經系統的特定細胞類型設計工程受體，通過系統一次性給予化學藥物來調控腦神經回路功能，實現了神經功能的高度選擇性藥物控制，因此該技術在神經科學研究中得到了廣泛應用，如學習記憶、焦慮、抑郁和藥物成癮等［11］。在細胞活性依賴標記的小鼠中，急性社交挫敗應激可標記被活化的屏狀核神經元。應用化學遺傳技術激活或沉默這群細胞的功能，可引發或減弱焦慮相關行為［12］?？茖W家設計并應用重組腺相關病毒載體在大鼠黑質中表達了興奮性受體hM3Dq 和A53T 突變型α-突觸核蛋白，發現慢性神經調控加重了A53T 突變型α-突觸核蛋白誘導的運動障礙，而不會改變多巴胺能神經變性［13］。Mimura等［14］將表達興奮性hM3Dq 的腺相關病毒載體注射到狨猴單側黑質中，在食用含有高效DREADD 激動劑的食物30～90 min后，狨猴出現向激活側對側方向旋轉行為。

1.3 化學遺傳技術的優勢和不足

化學遺傳最大的特點是通過特異性藥物作用于相應受體遠程控制神經元，為解析神經元回路和破解神經元功能提供了有力的工具?；瘜W遺傳相比于其他技術的優勢在于：①可長時間激活或抑制神經元活動；②非侵入性，操作簡單，只需注射或喂食特異性藥物即可，常規實驗室就可達到；③安全性相對較高，在體內應用比較安全。隨著技術不斷發展，化學遺傳的不足也顯現出來：①化學遺傳中藥物發揮作用需要一定的時間，這就意味著對于神經元的控制難以精確到秒，盡管這種緩慢作用的藥動學特點在研究簡單的神經回路方面具有優勢，但在研究復雜神經回路時缺乏精確的時間控制，且需要控制用藥劑量，否則可能會導致精神不振、活動減少等并發癥［15］；②藥物經代謝后作用減弱或消失，需反復注射，會對動物產生傷害，且配體長時間暴露會使受體脫敏［16］。

綜上，化學遺傳技術是一個強大的神經調節工具，可將其作為治療手段治療精神疾病。雖然化學遺傳在應用上還有一些問題，但隨著不斷的改進與優化，這項技術一定會廣泛應用于腦科學研究，為科研工作者帶來新的驚喜。

2 光遺傳技術

光遺傳技術是將光學與遺傳學技術結合，將光敏蛋白導入特定神經元細胞，利用光調控細胞活動的技術［17］。在特定波長的光照射下，光敏蛋白的構象發生改變，導致與之相互作用的蛋白解離或聚合，從而引發下游信號活動，如基因表達、酶與底物相互作用和神經元活化等［18］。

2.1 光敏蛋白的發展

光遺傳于2005年由斯坦福大學的Deisseroth等［19］首次提出，他們將綠藻中提取的視紫紅質通道蛋白2（channelrhodopsin-2，ChR2）導入哺乳動物神經元并能穩定表達，在光照下能夠使神經元興奮。

光敏蛋白的選擇是該技術的關鍵。光敏蛋白種類繁多，通常由生色基團和效應蛋白構成，其特點是由較小的蛋白質或蛋白結構域構成，受到光照時能傳遞信號，并在光照停止后恢復到原來的構象［20］。光敏蛋白根據其作用可分為興奮型、抑制型和控制G 蛋白偶聯型［21］，常見的主要有視紫紅質、視黃質、光氧電壓傳感蛋白、核黃素藍光受體、隱花色素、光敏色素［22］和紫外光受體8［23］等（表1）。除天然光敏蛋白，還有對離子通道蛋白進行改造的新光敏蛋白工具，這些離子通道的傳導速度、激發光譜和光電敏感性等生物物理性質都不同，可滿足不同的實驗需求。Cosentino等［24］將植物的LOV2-Jα的感光模塊與鉀離子通道Kcv 融合，構建了感應藍光的鉀離子通道（表1）。Brown 等［25］將視紫紅質進行拓撲反轉產生了新的變體。新的光遺傳工具仍在不斷開發中。

2.2 光遺傳技術在腦科學研究中的應用

光遺傳對各類神經元的精確控制為神經環路和精神疾病的研究提供了新手段，同時其也是探索神經發育和神經發生機制的重要工具。2007年，Adamantidis 等［26］通過光遺傳對特定的神經元進行光刺激，影響了動物的睡眠行為，使得該技術可進一步應用于探測復雜的神經行為（表1）。2011年有研究報道，對中央核基底外側杏仁核的末端進行時間精確性光遺傳學刺激，可引起急性、可逆的抗焦慮作用［27］。2013年，Kay團隊利用光遺傳學技術激活基底杏仁核-腹側海馬的投射增加了焦慮相關行為［28］；同年，有研究通過在腦內植入電極和光纖，實時監測癲癇發作并給予光刺激進行治療，將抑制性視蛋白在興奮性神經元表達或興奮性視蛋白在γ-氨基丁酸能神經元表達，均可控制癲癇的發生［29］。在小鼠中腦多巴胺能神經元轉入光遺傳病毒，可實現對神經元的瞬時雙向控制（抑制或激發），進而雙向調節（誘導或緩解）由慢性應激引起的抑郁癥狀［30］。

2.3 光遺傳技術的優勢和不足

光遺傳技術的優勢在于：①能夠控制光照時間，從而使細胞功能控制精確到毫秒甚至微秒級別；②通過控制光的強度，可瞬時控制刺激強度；③腦注射特異性啟動子可將光敏蛋白精確到某個細胞或細胞器，實現精準控制細胞活動，在清醒動物上具有時間精準性；此外，通過改造光敏蛋白已獲得許多新的光遺傳工具，選擇多樣?？偟膩碚f，光遺傳的誕生讓腦科學研究達到了前所未有的高度。

光遺傳技術仍然存在一些不足，如光纖的插入會對腦組織造成一定損傷，長期植入后可形成機化包裹使光控強度減弱，并且動物的自由活動也會受到所連接光纖的限制，需要開發具有遠程控制功能的無線光源植入物以降低侵入性［31］；光敏蛋白的外源性高度表達可能會對細胞產生毒性等。

Hsueh 等［32］將視蛋白在心肌細胞中表達，并給小鼠體外安裝微型LED 光源來誘導心臟節律，開創了對動物器官進行無創光遺傳控制的策略，此研究結果發表在2023年Nature雜志上。相信通過不斷改進，光遺傳技術在腦科學研究和臨床腦疾病治療中將發揮更大作用。

3 磁遺傳技術

磁遺傳技術是將磁感應元件導入大腦特定區域，使其在特定神經元中表達，在外部磁場刺激下激活大腦特定區域。磁遺傳技術為深部腦刺激帶來了新機遇。

3.1 磁遺傳相關感受器

多項研究表明，利用磁場作用于磁感應元件可達到對瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）離子通道門控效果［33］。TRP 通道廣泛存在于從酵母到人類中，每個成員都有不同的功能和分布。該受體家族成員主要參與對刺激的感知，其中瞬時感受器電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）離子通道是溫度和痛覺感受器，TRPV4則對滲透壓和機械刺激敏感［34］。

TRPV1 結合磁納米?；蜩F蛋白利用磁熱效應可操控細胞活性。2012年，Stanley 等［35］利用磁熱效應證明了磁性納米顆?？蛇h程控制體內蛋白的合成（表1）。該技術利用包裹His 標簽抗體的氧化鐵納米顆?？膳c融合His 標簽的TRPV1 通道蛋白特異性結合的特點，在465 kHz無線電磁波作用下，鐵納米顆粒產生的磁熱效應使TRPV1 通道打開，引起細胞鈣內流，并開啟下游鈣依賴的胰島素基因表達。同樣，Anikeeva 團隊也通過磁性納米顆粒在磁場下的熱效應打開TRPV1，觀察到HEK293細胞鈣內流，還可激發神經元可逆性放電［36］。利用磁性納米顆粒在磁場作用下熱效應激活神經元，進而實現了對動物的行為控制［37］。2015年，Stanley 團隊突破了外源納米顆粒侵入性注射和納米顆粒細胞內化后效果降低的局限性，將外源鐵納米顆粒換成了內源表達的鐵蛋白，在電磁波刺激下利用磁熱效應將鐵蛋白連接的TRPV1 通道打開，促進了胰島素的合成及分泌［38］（表1）。在另一研究中，他們將TRPV1 通道的S6 區域引入突變，使其成為氯離子選擇性通道，在磁熱效應下抑制了葡萄糖感應神經元，從而降低血糖，提高胰島素水平，并抑制進食［39］。

TRPV4 結合磁性納米?；蜩F蛋白利用磁力效應可操控細胞活性。Wheeler 等［40］構建并優化了TRPV4 通道與鐵蛋白的融合蛋白，并命名為Magneto，在體外實驗中驗證了在磁場作用下鐵蛋白通過磁力效應打開TRPV4通道，引起神經元動作電位發放，進一步的體內實驗也證實，該策略能引起斑馬魚的自旋行為和調控小鼠的獎賞行為（表1）。本課題組也對磁遺傳新策略進行了探索。通過His抗體修飾的磁性納米顆粒特異結合在插入His 標簽的TRPV4，從而靶向激活TRPV4 離子通道。激活的TRPV4 離子通道可引發神經元鈣內流。此外，這種方法在自由移動的小鼠中得到了證實，可有效控制動物繞體軸旋轉和步態凍結的行為［41］。

除以上2 種機制，2015年，Zhang 團隊通過myo-3 和mec-4 啟動子驅動IscA1基因在秀麗隱桿線蟲的肌肉細胞和機械敏感神經元中特異性表達，引發了肌肉收縮和后退行為［42］（表1）；Xie研究組也證明了IscA1編碼的蛋白具有磁感應功能，因此將此蛋白命名為磁受體蛋白（magnetic receptor，MagR）。MagR 與光感受器隱花色素組合形成桿狀復合物，在磁場的作用下可發生旋轉，因此該研究也將其稱為“生物指南針”［43］。Li 等［44］設計合成了一種含鐵的蛋白質晶體，每個晶體中都含有超過1000萬個鐵蛋白亞基，大大提高了礦化鐵的量。當將晶體從細胞中分離并在體外加載磁鐵時，晶體會向磁鐵移動，證明了磁性蛋白組裝的可能性。

3.2 對磁遺傳技術的質疑

磁遺傳技術在多項研究中已被證明是可發揮作用的，能以獨特優勢調控細胞活動，但同時也受到了來自多方的質疑。2016年，Meister［45］基于物理學理論對磁遺傳技術的有效性提出質疑，認為實驗中由磁場強度和頻率產生的熱量或力遠遠達不到打開離子通道的效果。對于MagR 的作用，也有人質疑單獨的MagR不足以使細胞對加載的磁場做出反應［46］，但原發現者認為，實驗中未觀察到陽性結果可能是質粒設計和表達效率所造成的。同時，作為新興技術，磁遺傳技術研究中的實驗材料和儀器設備等也缺乏統一標準。2020年，Shen 研究團隊將Magneto 在小腦浦肯野細胞表達，施加磁場后發現并沒有改變浦肯野細胞的電活動［47］。而2019年，Barbic［48］提出氧化鐵粒子在磁場作用下發生自旋產生的能量有可能打開離子通道實現磁感應效果。最近有研究對基于鐵蛋白的磁遺傳策略的實施方案進行了評估，從轉染時間、溫度、鐵源和鈣指示劑等方面進行測試，得出較為優化的實驗方案，為磁遺傳技術的有效應用提供了參考［49］。

磁遺傳技術因其非侵入、作用迅速、重復性好的特點而倍受關注，磁遺傳技術的提出無疑為腦科學研究工具的開發提供了新方向。對不同磁遺傳策略發揮作用的分子機制還應進一步深入研究。

4 其他調控技術

化學遺傳、光遺傳和磁遺傳技術可做到特定腦區指定類型神經元的操控，是腦核團環路功能研究中的常用工具。此外還有TES，TMS 和DBS 等物理調控技術在腦疾病的功能調控中發揮重要作用。TES 和TMS 技術的特點是從顱腦外非侵入性發送刺激信號，但腦區調控精準度有限。而DBS 需侵入性顱內植入電極，可達到腦區精準控制，但亦無法做到對指定類型細胞的操控。

4.1 經顱電刺激

TES 是一種非侵入的腦刺激技術，通過顱腦外粘貼電極將不同強度和頻率的電流作用于特定腦區可改變神經元興奮性，實現對大腦神經活動的調控，主要包括經顱直流電刺激（transcranial direct current stimulation，tDCS）和經顱交流電刺激（transcranial alternating current stimulation，tACS）。

tDCS 是利用低強度直流電（1～2 mA）調節大腦皮質神經元活動。直流電電極的負極可使神經元靜息膜電位升高，產生超極化，降低神經元放電頻率，產生抑制細胞活性的效果；反之，正極則使神經元發生去極化，增加神經元放電頻率，從而激活細胞的活性。tDCS 已經成功應用于抑郁癥和阿爾茨海默病等疾病的臨床治療［50-51］。tACS 是將有節律的正弦和雙相交流電傳遞到目標腦區的神經元。目前其調節機制可能是通過同步腦波震蕩進行，改變神經遞質水平，長期誘導神經元突觸可塑性，達到調節大腦功能和遠期改善疾病臨床癥狀的效果，臨床用于強迫癥、妄想和癡呆等疾病的治療［52］（表1）。

4.2 經顱磁刺激

TMS 于1985年由Barker 等［53］首次創立，是一種利用脈沖磁場無創穿透皮膚和顱骨作用于大腦中樞神經系統，改變大腦皮質神經細胞膜電位，使之產生感應電流，影響腦內代謝和神經電活動的磁刺激技術［54］。其基本原理是在線圈中通入脈沖電流，使線圈周圍產生脈沖磁場，將其置于頭部上方，脈沖磁場在頭部產生感應電流可刺激相應的神經元。高頻TMS可瞬間提高運動皮質興奮性，而低頻TMS 有抑制興奮的作用［55］。TMS 是一種大腦皮質神經的無創性刺激技術，相對電刺激，該技術無需電極也不用直接接觸人體，是一項無創、簡便的技術，已廣泛應用于疼痛、帕金森病和抑郁癥等精神疾病的治療［56］（表1）。

4.3 深部腦刺激

DBS 是一種新興的治療腦部疾病的神經調控技術，其原理是通過腦立體定位手術將DBS 電極植入患者腦內特定區域，通過電刺激達到治療疾病的目的［57］，故有“腦起搏器”之稱。該技術可根據患者病狀特點設置不同參數，大多采用＞100 Hz的高頻電刺激，一般是130～180 Hz，相比于傳統的物理方法該技術具有副作用小、可控、可逆的優點，在實施中患者一旦有不適即可停止，已被美國FDA 批準用于治療帕金森?。?8］（表1）、肌張力障礙和原發性震顫。隨著研究的深入，適應證已逐步擴展至強迫癥、抑郁癥和癲癇等疾?。?9-60］，DBS 已經在神經精神疾病的治療中取得突破性進展。

4.4 經顱超聲刺激

TUS 技術的原理是將超聲連續波或脈沖波穿透顱骨作用于大腦組織，可調控特定神經元的活動。目前該技術的超聲加載有2 種：高強度聚焦超聲和低強度聚焦超聲。高強度聚焦超聲會產生高強度能量，對腦組織會造成不可逆的損傷，也會產生熱量對其他部位造成傷害，所以目前研究較多的且更有效的是低強度聚焦超聲［61］。超聲刺激既可激活又可抑制神經活性，因此選擇合適的刺激參數非常重要，目前推薦的中心頻率為0.75～3 MHz。相比于TES 和TMS，TUS 具有更高的空間分辨率，穿透力更強，可刺激深部腦區。對于深部腦刺激，超聲刺激可以做到無創，而目前該技術的作用機制尚不清楚，仍需進一步研究，但其無疑擁有巨大潛力［62-63］（表1）。

5 結語

化學遺傳、光遺傳和磁遺傳技術是研究大腦功能強有力的工具，都可通過病毒注射以及轉基因動物實現特異性受體在腦目標核團的感興趣類型神經元中表達［64-65］。然而化學藥物起效延遲和光纖穿透組織的局限等問題也不容忽視。磁場可穿透組織和骨骼到達大腦的深部，且無需植入性手術就可控制大腦神經元的活化與失活，是更為有效且微創的方法［66］。未來磁遺傳技術可針對磁感應元件的開發、實驗設備和方案的標準化等方面進行優化［33］。如果能克服以上難題，那么磁遺傳技術未來在腦科學上的應用也將更為深入和廣泛，并有望用于臨床疾病的治療。TES，TMS，DBS 和TUS 等技術在臨床腦疾病治療中應用已獲得良好效果。隨著神經調控技術的研究不斷發展壯大，研究人員在研究大腦結構和作用機制時有了更豐富的選擇的同時，也將為腦疾病患者帶來新的希望。