維生素K3激活黃嘌呤氧化酶的動力學和分子機制

劉禮，趙文靜，肖麗君，齊曉怡，呂沐瀚，梁思成，吳敬敬

（西南醫科大學附屬醫院 1.消化內科，2.皮膚科，四川瀘州 646000；3.大連醫科大學藥學院臨床藥理學系，遼寧大連 116044）

維生素K 統指葉綠醌（K1）、甲基萘醌類（K2）和甲萘醌（K3）等結構類似物［1-2］。其中，維生素K1和K2是天然存在的，屬于脂溶性維生素。維生素K1廣泛分布于植物和藻類，維生素K2主要分布于各種乳制品。維生素K3是人工合成的止血藥物，也可由維生素K1和維生素K2在胃腸道中經微生物轉化生成［2-4］。維生素K 參與廣泛的生物過程并與許多疾病治療有關，如其是哺乳動物凝血和骨代謝的關鍵因子，可用于防止過度出血（如鼻出血和胃腸道出血等）和治療骨質疏松［5-6］。此外，維生素K 還可作為膳食補充劑，用于改善和保持人體健康［7］。據Gast 等［8-12］建議，維生素K 的平均攝入量為0.07～0.30 g·d-1。雖然維生素K補充劑的使用頻率很低，但消費者對膳食補充劑的偏好正在增長，目前發達國家的人均攝入量總體上高于這一建議［3，6，13］。因此，其對人體具有易暴露，不易察覺的特點。

近期，美國FDA 發布的臨床數據表明，服用維生素K（2-甲基-1，4-萘醌）用于治療骨質疏松的老年人患高尿酸及痛風的概率可能會增加［14］，但具體機制仍不清楚。本課題前期研究揭示了白花丹素（5-羥基-2-甲基-1，4-萘醌）具有黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）激活能力［15］，鑒于白花丹素與維生素K 均為萘醌類化合物，推測萘醌類化合物維生素K3也具有一定的XO 激活活性。XO 是哺乳動物細胞質中的一種高度保守的鉬黃素酶，在肝和腸道中高水平表達，在血液和其他組織中也有表達［16］。XO 負責激活/降解一些藥物（如多柔比星和甲苯磺丁脲）。更重要的是，它是內源性嘌呤轉化為尿酸的體內限速酶［16-17］，激活XO 可導致尿酸的異常升高。本研究旨在應用人肝S9 孵育體系，研究維生素K3對人源XO 的激活作用（圖1），并通過激活動力學及分子對接技術闡明其相關機制，為維生素K3的飲食管理和臨床合理應用提供指導。

Fig.1 Effect of vitamin K3 on conversion of xanthine to uric acid.XO：xanthine oxidase；MoCo：molybdopterin cofactor；Fe2S2（2Fe/S）：two non-identical iron-sulfur clusters；FAD：flavin adenine dinucleotide.

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

維生素K3（純度＞98%，批號71707303），上海邁瑞爾化學科技有限公司。黃嘌呤（純度＞98%，批號P1605538），上海阿達瑪試劑有限公司?；旌系娜烁蜸9（20 名供體，混合性別），美國康寧公司。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統（包含G7111A Quat 泵VL、G7129C Vialsampler 自動注射器、G7130A ICC 熱交換器和G7115A DAD WR 檢測器），美國安捷倫科技公司；超純水系統，美國Millipore 公司。所有試劑和溶劑均為市售分析純或色譜純。

1.2 黃嘌呤及其XO代謝物尿酸的HPLC分析條件

Diamonsil Plus C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；流動相為水（含0.1%磷酸）和乙腈（97/3，V/V），進樣量：60 μL；流速為1 mL·min-1；檢測波長284 nm。尿酸的線性范圍為0.16～2.5 μmol·L-1，R為0.9998。該方法重現性良好，日內和日間RSD均＜5.2%。

1.3 維生素K3對XO活性影響的初篩

首先，使用不同濃度黃嘌呤（0，2，4，8 和16 μmol·L-1）、磷酸鉀50 mmol·L-1緩沖液（PBS，pH 7.4）和S9（0.1 g·L-1）組成總體積為200 μL的孵育系統，在37 ℃條件下反應90 min，HPLC 法測定不同濃度黃嘌呤與XO 反應的尿酸生成量，計算XO介導的尿酸生成反應的動力學常數Km。之后，以不同濃度（1，10 和100 μmol·L-1）的維生素K3、XO 抑制劑別嘌呤醇或非布索坦分別與磷酸鉀50 mmol·L-1緩沖液（PBS，pH 7.4）、黃嘌呤（濃度為測得的Km值）和S9（0.1 g·L-1）組成總體積為200 μL的孵育系統，在37 ℃條件下反應90 min后，測定XO 活性（n=3）。在加入S9 啟始前，反應混合物均經3 min 的預培養步驟，加入S9 孵育90 min后，體系中加入200 μL 冰冷10%三氯乙酸（V/V）終止反應。反應樣品在4 ℃，20 000×g條件下離心10 min，上清液進行HPLC 分析，通過單位時間體系中尿酸的生產量反映XO 活性。黃嘌呤母液使用含0.2% NH3·H2O（V/V）的PBS溶解和保存，維生素K3用二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）稀釋，DMSO的體系終濃度小于1%（V/V）。

1.4 維生素K3激活XO的EC50和動力學曲線測定

為進一步評估維生素K3的XO 激活效果，使用濃度接近其Km值的黃嘌呤和不同濃度維生素K3（1，2，5，10，20，50，100，200 和400 μmol·L-1）確定半數有效濃度（EC50）和最大效應（Emax）（式①）。當維生素K3濃度接近其EC50值時，使用濃度范圍在＜1/3Km～＞3Km的底物進行激活動力學測定。使用GraphPad Prism 7.0 軟件（美國加利福尼亞州圣地亞哥）和Michaelis-Menten 方程（式②）進行非線性擬合估計酶動力學參數。通過Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖評估激活動力學類型。

其中，E是效應，Emax是最大效應，EC50是半數最大效應濃度，v是反應速率，Vmax是最大速度，Km（米氏常數）是0.5Vmax時的濃度，［S］是底物濃度。通過F統計量、R2值、參數標準誤差估計值和95%置信區間評估動力學模型的擬合度。

1.5 分子對接研究維生素K3與人肝XO 的相互作用機制

采用AutoDock 工具4.2 軟件進行分子對接，探索維生素K3與人源XO 之間的相互作用。從RCSB蛋白質數據庫中檢索人源XO 的X 射線晶體結構（PBD ID：2E1Q）。使用AlloSite 服務器并應用AlloSitePro方法分析人源XO中維生素K3的優選結合位點。在蛋白質上創建網格盒（X，Y和Z坐標尺寸為60×60×60 的網格框，網格間距為0.375 ?）并準備PDBQT 文件和配體后，使用AutoDockTools進行對接并得到結合能數值。使用PyMOL 2.5 和LigPlot 2.2軟件對對接結果進行可視化和分析。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 維生素K3對XO活性的影響

HPLC 數據顯示，黃嘌呤及其XO 代謝物尿酸的保留時間分別為7.6和6.6 min（圖2）。

Fig.2 ldentification of xanthine and its xanthine oxidase（XO）- mediated oxidative metabolite uric acid by high peformance liquid chromatography（HPLC）.The reactions of xanthine and XO were carried out at 37 ℃for 90 min.Liquid chromatography analysis conditions：diamonsil Plus C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm），column temperature 30 ℃，the mobile phases were water（containing 0.1% phosphoric acid）and acetonitrile（97/3，V/V），injection volume 60 μL，the flow rate 1 mL·min-1 and detection wavelength 284 nm.Standards：xanthine 100 μmol·L-1 and uric acid 50 μmol·L-1；control group：xanthine 200 μmol·L-1 without combination of 0.1 g·L-1 human liver S9；experimental group：xanthine 200 μmol·L-1 with combination of 0.1 g·L-1 human liver S9.

對于人肝XO，酶促反應遵循經典的米氏動力學，Km值為4.71 μmol·L-1，Vmax值為0.08 μmol·min-1·g-1（圖3）。

Fig.3 Michaelis-menten curve of S9 mediated xantihne oxidation.Xanthine（0，2，4，8，and 16 μmol·L-1）was incubated with S9（0.1 g·L-1）at 37 ℃for 90 min.±s，n=3.

在S9孵育體系中，與DMSO組比較，維生素K31，10 和100 μmol·L-1均表現出一定的激活能力（P＜0.01），其中，10和100 μmol·L-1組XO活性提高＞2倍（P＜0.01），而別嘌呤醇和非布索坦抑制XO 活性（P＜0.01）（圖4）。表明維生素K3具有激活XO 增加其代謝黃嘌呤產生尿酸的能力。

Fig.4 Activation of XO in S9 incubation system supplemented with vitamin K3 or control compounds allopurinol or febuxostat（1，10 and 100 μmol·L-1）.Vitamin K3，allopurinol or febuxostat were incubated with S9（0.1 g·L-1）and xanthine 5 μmol·L-1 at 37 ℃for 90 min.XO activity is expressed as fold change over the vehicle control（DMSO）.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.

2.2 維生素K3對XO的激活作用

維生素K3對XO 的EC50值為32.0 μmol·L-1，Emax值為7.73，非線性擬合數據獲得的相關系數R2值為0.9942（圖5），表明維生素K3對XO 介導的黃嘌呤氧化反應有激活作用。同時，使用Origin 7.0軟件對維生素K3激活XO 作logistic 分析發現，擬合公式為y=A2+（A1-A2）/（1+（x/x0）^p），其中y=XO活性（fold of control），x=log [vitamin K3（μmol·L-1）]，A1=1.43277±0.19338，A2=8.3244±0.68649，x0=1.56572±0.10257，p=4.21025±0.8579。擬合數據呈典型S形（圖5），說明維生素K3對XO的激活具有濃度依賴性。

Fig.5 Activation effect of vitamin K3 on production of uric acid catalyzed by XO in S9.Xanthine（approaching Km value）was incubated with S9（0.1 g·L-1）and vitamin K3（1，2，5，10，20，50，100，200 and 400 μmol·L-1）at 37 ℃for 90 min.±s，n=3.

2.3 維生素K3對XO 介導的黃嘌呤氧化反應動力學行為的影響

不同濃度維生素K3條件下，XO介導的黃嘌呤氧化反應動力學行為發生改變（表1），具體表現為Km值隨維生素K3濃度增加而減?。?.71～1.34 μmol·L-1），而Vmax值隨維生素K3濃度增加而增加（0.08～1.31 μmol·min-1·g-1）。維生素K3引起的動力學曲線變化增加了S9 的催化效率（Vmax/Km，17.0～977.6 mL·min-1·g-1）導致尿酸水平升高。如圖6所示，Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖的直線相交于第二象限，證實維生素K3對XO的激活特性為混合型。

Tab.1 Effect of vitamin K3 on kinetic parameters of S9 mediated xanthine oxidation.

Fig.6 Lineweaver-Burk of XO activation in S9 by vitamin K3.Vitamin K3 was incubated with S9 0.1 g·L-1 and xanthine at 37 ℃for 90 min.±s，n=3.

2.4 維生素K3通過氫鍵與XO相互作用

采用AllositePro 預測人肝XO（2E1Q）晶體結構中的變構位置，并進一步對接維生素K3。結果表明，維生素K3在變構位點結合良好（圖7），其與人肝XO 的結合能最高得分-5.39 kcal·mol-1。該值小于黃嘌呤與人肝XO的結合能（-5.12 kcal·mol-1），表明維生素K3與人肝XO的結合能力強于底物黃嘌呤。

Fig.7 Surface representation of three-dimensional crystal structure of XO derived from human（2E1Q）.2E1Q bound to both orthosteric substrate xanthine and the allosteric activator vitamin K3.Orthosteric and allosteric sites are highlighted in blue and red，respectively.

進一步分析發現，2E1Q 的變構位點由氨基酸殘基Asp595，Arg599，Ser605，Leu606，Arg607，Pro676，Thr679，Arg825 和Met827 組成（圖8）。維生素K3與蛋白質2E1Q 的殘基Arg599 和Ser605的側鏈形成氫鍵，且氫鍵長度分別為0.278 和0.296 nm（圖8）。

Fig.8 3D（A）and 2D（B）result of interactions of vitamin K3 with allosteric site of XO.The figures shown above are the distance（?）of hydrogen bond between vitamin K3 and the key amino acids of XO.

3 討論

本研究發現，維生素K3具有激活XO 升高尿酸作用，且該作用存在濃度依賴性。目前，盡管維生素K3（假設完全由維生素K1轉化而來）的體內暴露量（0.47～4.33 nmol·L-1）［18］未超過本研究中的EC50值（32.0 μmol·L-1），但考慮到每天經常食用含有維生素K 的水果（200～400 g），以及成年人的腸道容積（4～5 L），維生素K仍可能通過長期低濃度暴露，導致尿酸水平失衡。因此，本研究提示脂溶性維生素K3在體內的累積可能是導致臨床高尿酸血癥的關鍵影響因素，并可能進一步增加患痛風風險。此外，動力學研究顯示，維生素K3可通過影響底物黃嘌呤與XO 的親和力（Km值和Km值減小，親和力增大）來影響其催化能力。Lineweaver-Burk 雙倒數曲線結果還證實，維生素K3對XO 的激活可能為混合型，表明維生素K3可能在影響底物與XO 結合的同時，也影響了XO 空間構型的變化，最終導致XO催化效率上調。

同時，結合體外激活動力學結果，本研究推測維生素K3可能通過變構作用調控XO 活性，可能為XO 的變構激活劑。變構作為最重要的自然發生機制之一，可通過誘導靶生物分子的構象變化和功能調節來影響生物學功能［19］。為此，本研究借助AllositePro 預測變構位點并利用Autodock 對維生素K3的XO 激活機制作進一步解析。根據分子對接結果，同時結合XO 分子結構〔由約145 ku的2個相等的亞基組成，每個亞基包含1 個鉬酸鹽催化亞基（Moco，約85 ku）、1 個黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD，約40 ku）輔因子和2 個Fe/S 簇（2Fe-2S，約20 ku）［20-21］〕的氨基酸序列信息，可知維生素K3對XO 的別構調控可能是通過競爭人源XO 的Moco 結構域（維生素K3與XO 的結合部位包含于Moco 結構域），并與XO 酶變構位點Arg599 和Ser605 形成氫鍵相互作用而引起的。與許多變構劑相同，維生素K3的XO 結合位點遠離XO 活性中心［19］，抑制劑別嘌呤醇則與底物黃嘌呤競爭性結合XO 的活性中心。因此，本研究可為維生素K3作用的變構位點的藥物設計提供理論基礎。

近年來，針對維生素K3的研究日益增加。目前維生素K3不僅具有廣泛的生理和藥理活性（如促進凝血、治療骨質疏松［5］、抗炎［19］和抗癌［2，22］等），也作為膳食營養品廣泛使用。然而，這些研究主要針對疾病防治，仍缺乏對其潛在不良影響的探究。本研究揭示的維生素K3引起的尿酸升高的潛在不良影響，可為維生素K3作為膳食保健品以及抗炎、抗癌等疾病的治療藥物提供風險預警，以促進其安全引用。此外，本研究觀察到的維生素K3的XO 激活作用，不僅拓展了XO 激活劑的種類，豐富了對維生素K3功能的研究，同時也為維生素K3在更多領域的合理應用提供了理論依據。但實驗尚有不足，還需要進行細胞及動物實驗等研究，進一步考察維生素K3在體內的XO激活作用。