唑吡坦對低壓低氧致失眠模型小鼠的鎮靜催眠作用

梁歡歡，許琳，俞綱，蘇瑞斌，李明媛

（1.天津科技大學生物工程學院，天津市透明質酸應用研究企業重點實驗室，天津 300457；2.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

高原地區海拔高、空氣密度低，致使機體產生應激反應，其中高原睡眠障礙作為最常見的不適反應之一而備受關注［1］。睡眠障礙可使機體功能紊亂，引發食欲不振、精神萎靡、免疫力下降等不良反應，長期睡眠障礙可造成不可逆的腦功能損害，甚至誘發心腦血管疾病、抑郁等嚴重疾?。?］。通過藥物治療有效緩解高原睡眠障礙、提高睡眠質量已經成為高原條件下保障正常生活工作的迫切需要。目前臨床用于治療高原睡眠障礙的首選藥物為經典鎮靜催眠藥苯二氮類及非苯二氮類藥物［3］。非苯二氮類藥物如唑吡坦和右佐匹克隆等具有半衰期短、不易產生耐受和依賴的優點［4］。

腦內存在多個睡眠-覺醒調節系統，通過不同腦區的神經元投射和突觸傳遞共同參與睡眠-覺醒狀態的調節［5］。促覺醒系統通過中腦的旁正中區域進入丘腦形成的背側通路，使丘腦能夠處理與感覺、運動反應和認知相關的信號。研究表明，丘腦損傷患者和動物往往難以保持清醒，睡眠時間過長［6］。而睡眠狀態是由丘腦網狀核中抑制性γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神經元、丘腦皮質中繼神經元和皮質錐體神經元之間相互作用產生的結果，其中丘腦皮質中繼神經元通過去極化/超極化的方式產生緊張性/抑制性活動，提供狀態依賴的感覺信息門控，從而調節清醒和睡眠狀態［7］。下丘腦視交叉上核在晝夜間分別通過GABA 能或谷氨酸（glutamic acid，Glu）能神經元節律性控制松果體褪黑激素分泌，快動眼睡眠期間視交叉上核神經元活動增加，非快動眼睡眠期間減少［8］。下丘腦腹外側視前區以釋放GABA 和甘丙肽的方式向促覺醒區域傳遞抑制性信號，促進睡眠發生；當其受損時，機體睡眠結構發生改變且睡眠時間減少［9-10］。此外，下丘腦外側神經元中促食欲素神經元為促覺醒的關鍵細胞類型，其特異性丟失會產生嗜睡癥［11］。綜上所述，丘腦和下丘腦及Glu 能和GABA 能傳遞在睡眠-覺醒狀態調節中至關重要。

本研究采用低壓低氧動物實驗艙建立小鼠高原睡眠障礙模型，以評價唑吡坦對高原睡眠障礙的治療作用，并通過檢測神經遞質Glu 和GABA 的含量探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，6～8周，體重18～20 g，購于北京斯貝福生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養環境溫度24 ℃，濕度55%～65%，12 h 晝夜更替（光照時間8∶00～20∶00），小鼠可自由攝食飲水。

1.2 藥品、試劑和儀器

戊巴比妥鈉（批號020919），北京化學試劑公司；唑吡坦（純度97.2%，批號171258-201602），中國食品藥品檢定研究院；標準品Glu 和GABA（色譜純），美國Sigma 公司；無水甲醇（色譜純），德國賽默飛公司；超純水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其余試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

FLYDWC50-11C 低壓低氧實驗動物艙，貴州風雷航空軍械有限責任公司；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵，鞏義市英峪儀器廠；安捷倫1260 型色譜儀，美國安捷倫公司；TissuelyserⅡ高通量組織研磨儀，德國Qiagen 公司；Centrifuge 5424R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；TP 300 超聲波清洗機，北京天鵬電子新技術有限公司。

1.3 常壓常氧條件下翻正反射消失（loss of righting reflex，LORR）實驗及戊巴比妥鈉致小鼠鎮靜催眠閾下和閾上劑量的確定

在相對安靜的實驗環境下，小鼠ip 給予戊巴比妥鈉20，25，30，35，40，45 和50 mg·kg-1后以仰臥位輕輕置于籠中，每隔1 min 翻轉小鼠1 次，若其保持仰臥位時間≥1 min，則判定為LORR；若小鼠在1 min 內恢復至俯臥位的次數≥2 次，則判定為翻正反射恢復［12］。觀察小鼠LORR 率、首次出現LORR的潛伏期和LORR 持續時間。將LORR 率介于0%～10%和100%的劑量分別確定為戊巴比妥鈉鎮靜催眠閾下和閾上劑量［13］。其中，LORR率（%）=出現LORR動物數/動物例數×100%。

1.4 小鼠低壓低氧致失眠模型的建立

小鼠適應性飼養后，按體重隨機分為常壓常氧對照組和低壓低氧處理1，2 或5 d 組，每組10 只。常壓常氧對照組小鼠在常壓常氧環境（海拔55 m，大氣壓101.3 kPa、氧分壓21.1 kPa）中飼養1 d，低壓低氧處理組置于低壓低氧實驗動物艙內分別處理1，2 或5 d，處理開始時在10 min 內將艙內大氣壓力和氧分壓勻速降至51.7 和0 kPa，以模擬海拔5500 m 高原環境。艙內溫度控制在（23±2）℃，小鼠可自由攝食、飲水。處理結束時將艙內大氣壓力和氧分壓在3 min 內上升至101.3 和21.1 kPa，將低壓低氧處理組小鼠從氧艙內取出后ip 給予閾上劑量戊巴比妥鈉并觀察其LORR 情況。以LORR潛伏期顯著延長、LORR 持續時間顯著縮短作為低壓低氧致失眠模型造模成功的判斷標準。

1.5 唑吡坦與戊巴比妥鈉鎮靜催眠協同實驗

小鼠按體重均衡分為常壓常氧溶媒組、常壓常氧唑吡坦組、低壓低氧致失眠模型組和低壓低氧致失眠模型+唑吡坦組，每組8只。各組小鼠經常壓常氧或低壓低氧處理1 d 后，常壓常氧溶媒組和低壓低氧致失眠模型組ip 給予溶媒（含4% DMSO 和2% 吐溫-80 的水溶液），常壓常氧唑吡坦組和低壓低氧致失眠模型+唑吡坦組ip 給予唑吡坦0.33，1，3，9 和27 mg·kg-1，20 min 后各組小鼠ip 給予閾下劑量（20 mg·kg-1）或閾上劑量（50 mg·kg-1）戊巴比妥鈉，記錄小鼠LORR潛伏期和LORR持續時間。

1.6 唑吡坦致小鼠翻正反射消失實驗

小鼠分為常壓常氧唑吡坦組和低壓低氧唑吡坦組，分別在常壓常氧或低壓低氧環境處理1 d，而后各組分別ip 給予唑吡坦10，13，17，20，23，30 和40 mg·kg-1，觀察各組小鼠LORR率。

1.7 高效液相熒光法測定小鼠丘腦和下丘腦中神經遞質Glu和GABA含量

1.7.1 色譜條件［14］

新時期公路橋梁檢測質量控制與檢測技術應用實踐分析……………………………………………………… 曾邵梅（8-100）

安捷倫C18 反相色譜柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）。流動相A：含磷酸氫二鈉0.04 mol·L-1，乙二胺四乙酸二鈉0.1 mol·L-1和0.2%三乙胺的水溶液，用磷酸調節pH 至6.3；流動相B：將50%甲醇、10%四氫呋喃和40%流動相A 混勻，用磷酸調節pH 至6.3，0.45 μm 微孔濾膜抽濾脫氣，超聲40 min備用。設定激發波長340 nm，發射波長450 nm；柱溫：18 ℃。梯度洗脫條件：0～8 min，100%流動相A，流速0.8 mL·min-1；8～17 min，45%流動相A+55%流動相B，流速0.8 mL·min-1；17～25 min，25%流動相A+75%流動相B，流速1.0 mL·min-1；25～33 min，70%流動相A+30%流動相B，流速1.0 mL·min-1。

1.7.2 標準曲線繪制

用人工腦脊液配制Glu 和GABA 標準品溶液，濃度梯度為0.195，0.39，0.78，1.5625，3.125 和6.25 μmol·L-1。取20 μL 不同濃度標準溶液，加入10 μL 鄰苯二甲醛衍生化試劑（鄰苯二甲醛2.5 mg溶于0.5 mL 無水甲醇中，加入0.5 mL 0.1 mol·L-1的四硼酸鈉溶液，再加入4 μL β-巰基乙醇，混勻后4 ℃避光保存），混勻后避光反應1.5 min，取20 μL進樣，檢測Glu和GABA含量。以標準品濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸分析得到Glu和GABA標準曲線。

1.7.3 實驗分組處理及Glu和GABA含量測定

小鼠分為常壓常氧溶媒組、常壓常氧唑吡坦組、低壓低氧致失眠模型組和低壓低氧致失眠模型+唑吡坦組，各組小鼠在常壓常氧或低壓低氧環境中處理1 d 后，常壓常氧溶媒組和低壓低氧致失眠模型組ip 給予溶媒，常壓常氧唑吡坦組和低壓低氧致失眠模型+唑吡坦組ip 給予唑吡坦10，20 和40 mg·kg-1，給藥后常壓常氧溶媒組和常壓常氧唑吡坦組置于常壓常氧環境，低壓低氧致失眠模型組和低壓低氧致失眠模型+唑吡坦組放入低壓低氧環境中，1 h后迅速處死并取腦，于冰上快速剝離出丘腦和下丘腦放入液氮，稱重后轉移至EP管中，加入2顆直徑4 mm 鋼珠，按10 mL·g-1加入超純水，勻漿2 min。4 ℃，15 984×g離心10 min，將上清液轉移至新EP 管中。衍生化反應后，取20 μL 進樣，檢測Glu和GABA含量。

由標準曲線求得樣品中Glu 和GABA 濃度（μmol·L-1）。腦組織神經遞質含量（ng·g-1丘腦或下丘腦濕重）=樣品神經遞質濃度（μmol·L-1）×進樣體積（μL）/樣品重量（g）。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 常壓常氧環境下不同劑量戊巴比妥鈉對小鼠LORR的影響

實驗結果顯示，ip給予戊巴比妥鈉20，25,30,35,40,45 和50 mg·kg-1時，小鼠LORR 率分別為0%，20%，60%，90%，90%，100%和100%，其中戊巴比妥鈉50 mg·kg-1誘導效應最穩定且重現性好，故確定50 mg·kg-1為戊巴比妥鈉鎮靜催眠閾上劑量。以20 mg·kg-1為戊巴比妥鈉鎮靜催眠閾下劑量。

2.2 低壓低氧環境對戊巴比妥鈉鎮靜催眠閾上劑量誘導小鼠LORR效應的影響

與常壓常氧對照組相比，低壓低氧處理1，2 或5 d使小鼠LORR潛伏期顯著縮短（P＜0.01，圖1A），低壓低氧處理1 或2 d 小鼠LORR 持續時間顯著縮短（P＜0.05，P＜0.01，圖1B）。

2.3 常壓常氧或低壓低氧環境對唑吡坦協同戊巴比妥鈉致小鼠鎮靜催眠效應的影響

常壓常氧唑吡坦0.33，1，3，9 和27 mg·kg-1組小鼠協同閾下劑量戊巴比妥鈉誘導LORR 率分別為0%，0%，50%，87.5%和100%，ED50為2.94 mg·kg-1（圖2A），提示唑吡坦可協同閾下劑量戊巴比妥鈉發揮鎮靜催眠作用。與常壓常氧溶媒組比較，常壓常氧唑吡坦3，9 和27 mg·kg-1組LORR 潛伏期顯著縮短（P＜0.01，圖2B），9 和27 mg·kg-1組LORR 持續時間顯著延長（P＜0.01，2C）。

在閾上劑量戊巴比妥鈉協同實驗中，與常壓常氧溶媒組相比，常壓常氧唑吡坦9 和27 mg·kg-1組LORR 潛伏期顯著縮短（P＜0.01，圖2D），3，9 和27 mg·kg-1組LORR 持續時間顯著延長（P＜0.05，P＜0.01，圖2E）。

Fig.2 Effect of zolpidem on LORR induced by zolpidem synergy subthreshold（A，B and C）and upper-threshold（D and E）pentobarbital sodium in normoxic environment.Mice in normoxia vehicle group and normoxia zolpidem groups were treated in a normoxia environment for 1 d，and were ip given vehicle or zolpidem（0.33，1，3，9 and 27 mg·kg-1）20 min before being ip treated with 20 mg·kg-1（subthreshold）or 50 mg·kg-1（upper-threshold）pentobarbital sodium，then LORR was observed.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normoxia vehicle（Veh）group.

低壓低氧致失眠模型+唑吡坦0.33，1，3，9 和27 mg·kg-1組協同閾下劑量戊巴比妥鈉引起LORR率分別為0%，0%，0%，87.5%和100%（圖3A），ED50為9.22 mg·kg-1。與低壓低氧致失眠溶媒組相比，低壓低氧致失眠模型+唑吡坦9 和27 mg·kg-1組LORR 潛伏期顯著縮短（P＜0.01，圖3B），LORR持續時間顯著延長（P＜0.05，P＜0.01，圖3C）。

Fig.3 Effect of zolpidem on LORR induced by zolpidem synergy subthreshold（A，B and C）and upper-threshold（D and E）pentobarbital sodium in hypoxic environment.Mice in hypoxia induced insomnia vehicle group and hypoxia induced insomnia zolpidem groups were treated in a hypoxic environment for 1 d，and were ip given vehicle or zolpidem（0.33，1，3，9，27 mg·kg-1）20 min before being ip treated with pentobarbital sodium 20 mg·kg-1（subthreshold）or 50 mg·kg-1（upper-threshold），then LORR was observed.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with hypoxia induced insomnia Veh group.

在閾上劑量戊巴比妥鈉協同實驗中，低壓低氧致失眠模型+唑吡坦9 和27 mg·kg-1組較低壓低氧致失眠模型組LORR 潛伏期顯著縮短（P＜0.05，P＜0.01，圖3D），LORR持續時間顯著延長（P＜0.05，P＜0.01，圖3E）。

2.4 常壓常氧或低壓低氧環境下唑吡坦對小鼠LORR的影響

在常壓常氧和低壓低氧環境下，唑吡坦誘導LORR 的ED50分別為16.21 和20.55 mg·kg-1（圖4）。提示在低壓低氧環境下，唑吡坦的鎮靜催眠作用減弱。

Fig.4 Effect of zolpidem on LORR of mice in normoxic and hypoxic environments.Mice were treated in a normoxic or hypoxic environment for 1 d，normoxia and hypoxia groups were ip given zolpidem 10，13，17，20，23，30 and 40 mg·kg-1，respectively.Then LORR was observed.n=10.

2.5 常壓常氧或低壓低氧環境下唑吡坦對小鼠丘腦和下丘腦Glu 和GABA 含量及Glu/GABA 比值的影響

與常壓常氧溶媒組相比，常壓常氧唑吡坦40 mg·kg-1組小鼠丘腦中Glu 含量顯著降低（P＜0.01，圖5A），各組GABA 含量及Glu/GABA 比值均無顯著變化（圖5A 和C）。與常壓常氧溶媒組相比，常壓常氧唑吡坦40 mg·kg-1組下丘腦中Glu含量顯著降低（P＜0.05，圖5B），GABA 含量各組間無顯著差異（圖5B），Glu/GABA 比值顯著下降（P＜0.05，圖5D）。

與常壓常氧溶媒組相比，低壓低氧致失眠模型組小鼠丘腦中Glu 和GABA 含量及Glu/GABA 比值均無顯著變化（圖6A 和C）；下丘腦中Glu 含量顯著升高（P＜0.01，圖6B），Glu/GABA 比值顯著升高（P＜0.05，圖6D）。與低壓低氧致失眠模型組相比，低壓低氧致失眠模型+唑吡坦組小鼠丘腦中Glu 和GABA 含量及Glu/GABA 比值均無顯著變化（圖6A和C）；下丘腦中低壓低氧致失眠模型+唑吡坦40 mg·kg-1組Glu 含量顯著降低（P＜0.05，圖6B）；低壓低氧致失眠模型+唑吡坦20 和40 mg·kg-1組Glu/GABA比值顯著降低（P＜0.05，圖6D）。

Fig.5 Effect of zolpidem on glutamic acid（Glu），γ-aminobutyric acid（GABA）and Glu/GABA in thalamus（A and C）and hypothalamus（B and D）of mice in normoxic environment.Mice were treated in a normoxic environment for 1 d，and then were ip given vehicle or zolpidem（10，20，40 mg·kg-1）1 h before sample collection.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with veh group.

Fig.6 Effect of zolpidem on Glu，GABA and Glu/GABA in thalamus（A and C）and hypothalamus（B and D）of mice in hypoxic environment.Mice in the normoxia veh group were treated in normoxic environment for 1 d，hypoxia model group and hypoxia+zolpidem groups were treated in a hypoxic environment for 1 d，normoxia veh and hypoxia model groups were ip given vehicle，and hypoxia+zolpidem groups were ip given zolpidem（10，20，40 mg·kg-1）1 h before sample collection.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normoxia veh group；#P＜0.05，compared with hypoxia model group.

3 討論

低氧是造成高原睡眠障礙最直接、最重要因素。研究發現，從平原進入高原后，高原睡眠障礙發生率為41.5%，其中急進高原睡眠障礙發生率為71%～93%，均顯著高于平原睡眠障礙發生率［15-16］。目前，針對高原睡眠障礙采取的預防及治療措施主要包括氧療、預習服、重復經顱磁刺激等，但這些方法不適用于急進高原，藥物療法因其便利性和有效性仍是主流療法［17］。

高原低氧引起的睡眠障礙受神經網絡系統調控，是一個復雜的病理過程，很難用離體實驗進行模擬，其發病機制研究及防治藥物研發需要整體動物體內實驗驗證［12］。藥典推薦可以采用戊巴比妥鈉協同誘導大鼠、小鼠LORR 實驗作為簡便快捷的催眠藥物篩選方法來評判藥物鎮靜催眠效果［18］。開展高原睡眠障礙藥物治療研究需要依托于良好的能夠復制出高原睡眠障礙的模型，本課題選取能夠模擬低壓低氧環境的動物實驗艙開展高原睡眠障礙模型構建及唑吡坦的藥效評價研究［19］。同時以經典閾上劑量戊巴比妥鈉誘導LORR 效應作為睡眠評價模型［20］。與文獻［21］報道一致，小鼠缺氧處理1～5 d 均出現一定程度的神經功能紊亂，其中第1～2 天失眠狀況最為顯著，具體表現為閾上劑量戊巴比妥鈉誘導小鼠LORR 持續時間較常壓常氧對照組顯著縮短，綜合上述實驗結果，最終確定以小鼠LORR 持續時間（睡眠穩定性）作為主要觀察目標，以低壓低氧處理1 d 作為低氧誘導睡眠障礙模型，開展后續研究。

本研究發現，唑吡坦在常壓常氧或低壓低氧條件下均可增加閾下劑量戊巴比妥鈉誘導的LORR率、縮短LORR 潛伏期和延長LORR 持續時間，且縮短閾上劑量戊巴比妥鈉誘導的LORR 潛伏期，延長LORR 持續時間，說明唑吡坦對高原睡眠障礙具有一定治療效果。但在低壓低氧條件下，同等劑量唑吡坦與閾下及閾上劑量戊巴比妥鈉協同誘導LORR 效應弱于常壓常氧條件。與此類似，低壓低氧條件下，相同劑量的唑吡坦對小鼠鎮靜催眠作用弱于常壓常氧條件下，該結果可能與低壓低氧環境降低機體肝臟藥物代謝相關酶細胞色素P450 表達水平及活性相關［22］。唑吡坦進入人體后的代謝與細胞色素P450 密切相關，抑制該酶活性時，血液中唑吡坦水平升高［23］，所以理論上，要達到相同的催眠效應，低壓低氧條件下唑吡坦使用劑量應低于常壓常氧條件下所需劑量，然而本實驗結果卻與之相反，說明存在其他的機制介導了該結果的產生。前期Gao 等［24］研究發現，低氧降低GABAA受體亞基α1mRNA 表達水平，使唑吡坦與GABAA受體親合力減弱，對中樞神經系統產生的抑制作用減小。推測低壓低氧使得中樞系統內GABAA受體表達量減少，藥物進入體內后與受體結合率降低，進而使得藥物鎮靜催眠作用減弱。

GABA是哺乳動物中樞神經系統中主要的抑制性神經遞質，增強GABA 能神經傳遞可延長睡眠時間。唑吡坦作為GABAA受體的正向變構調節劑可延長抑制性突觸后電流的持續時間，從而引發神經網絡抑制，產生鎮靜催眠效應［25］。常壓常氧條件下，隨唑吡坦劑量增加，丘腦和下丘腦中Glu含量逐漸降低，其中40 mg·kg-1組效應顯著，唑吡坦各劑量組對GABA 含量無明顯影響，但40 mg·kg-1組顯著性降低下丘腦中Glu/GABA 比值。此外，與常壓常氧溶媒組相比，低壓低氧處理使小鼠下丘腦中Glu含量和Glu/GABA 比值顯著升高。下丘腦中，與低壓低氧致失眠模型組相比，低壓低氧致失眠模型+唑吡坦40 mg·kg-1組小鼠Glu 含量顯著降低，GABA 含量無顯著性變化，低壓低氧致失眠模型+唑吡坦20 和40 mg·kg-1組Glu/GABA 比值顯著降低。以上結果表明，唑吡坦與GABAA受體結合后產生的中樞抑制效應與其調節Glu而非GABA 水平相關，而Glu/GABA 比值的變化主要取決于Glu 水平的變化量。此外，研究發現常壓常氧環境條件下，唑吡坦40 mg·kg-1對丘腦和下丘腦Glu 含量均有顯著性影響，而在低壓低氧條件下，相同劑量唑吡坦僅引起下丘腦Glu 含量的顯著變化，提示低壓低氧條件下唑吡坦對中樞神經系統影響范圍變小，這一結果可能與低壓低氧條件下唑吡坦鎮靜催眠效應減弱的現象有關，提示唑吡坦在治療高原睡眠障礙時需要合理調整劑量，以達到理想的治療效果。