胰島素抵抗小鼠小腸類器官模型構建及黃諾瑪苷對此模型腸黏膜屏障的保護作用

依米妮古麗·麥麥提，麥麥提亞森·多力昆，古麗那孜·別克達吾來提，熱孜亞·阿不來孜，陳龍，鄭夢竹，3，楊占群，蔡梓恒，許諾，李琳琳

（1.新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011；2.北京大學第三醫院藥劑科，北京 100191；3.北京大學基因組學創新中心，北京 100091；4.新疆喀什地區第一人民醫院綜合心理科，新疆喀什 844000）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是包括2型糖尿?。╠iabetes mellitus type 2，T2DM）和心血管疾病在內的人類疾病最早表現之一［1］。根據國際糖尿病聯盟發布的第10版糖尿病圖譜，全球有5.37億成年人患有糖尿病，其中中國病例數為140.9萬，是全世界糖尿病患者最多的國家［2］。防治糖尿病已成為嚴峻的公共衛生問題。

當機體出現病理狀況時，由多種因素造成的緊密連接蛋白異常使腸道黏膜屏障功能受損，從而使腸上皮通透性發生改變，導致IR 的全身性低度炎癥反應，繼而誘導T2DM和肥胖等代謝性疾?。?-4］。因此，以胃腸道為靶點的治療在改善T2DM 方面可能發揮重要作用。db/db小鼠為瘦素受體基因缺陷引起的自發性T2DM 小鼠，可高度模擬人類具有明顯IR特點的自發性T2DM的發生發展［5］。

兩色金雞菊（Coreopsistinctoria）又稱昆侖雪菊，屬于菊科金雞菊屬植物［6］，具有改善IR［7］、抗炎、抗氧化和保護胰島β 細胞等［8］作用。本課題組前期研究發現，兩色金雞菊醇提取物可部分逆轉高脂飲食所導致的菌群結構改變，并對腸道產生保護作用［9］。兩色金雞菊中主要有效成分黃酮類物質含量可達18.3%［10］，其中黃諾瑪苷（flavanomarein）對糖尿病及其并發癥也具有一定的改善作用［11-12］，并在小腸吸收效率最好［13］，但其藥理作用機制有待研究。

腸類器官是小腸干細胞衍生的組織3D 培養模型，能夠模擬人類小腸的表型構造、蛋白質構成及組織結構功能［14］。傳統的Caco2 單層模型不能真實再現腸道黏液層組織結構，也不存在不同類型的腸細胞之間的相互作用［15］。小腸類器官可分化為腸上皮功能細胞，從而動態監測和分析小腸黏膜損傷修復的生理病理機制［16］。類器官作為疾病新型非臨床研究模型具有良好的應用前景，但尚無有關小腸IR 模型類器官建立相關的研究報道。因此，本研究建立并完善IR 小鼠小腸類器官模型，分析其形態及生物學特性，探究黃諾瑪苷對IR 小鼠小腸腸道屏障的保護作用，進一步闡明黃諾瑪苷改善糖脂代謝的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性C57BL/6J 小鼠，體重20～25 g，6～8 周齡；雄性db/db（IR）小鼠（C57BL/6J背景），體重35～40 g，6～8 周齡，均購自于斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物合格證號：SCXY（京）2019-0010；SPF 級實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003。本研究所涉及的動物實驗通過新疆醫科大學實驗動物倫理委員會批準，倫理審批號：IACUC-20210422-07。

1.2 藥品、主要試劑和儀器

黃諾瑪苷（純度≥99.9%），課題組自提［17］。類器官基礎培養基：DMEM/F12 培養基，美國Gibco公司；類器官完全培養基：基礎培養基添加10%重組小鼠R-脊椎蛋白Ⅰ（批號120-38-20）、5%重組小鼠Noggin蛋白（批號120-10C）、5×10-5mg·L-1重組小鼠表皮生長因子（批號315-09-100UG）和5×10-5mg·L-1重組小鼠Wnt3a（批號315-20-10），美國PeproTech公司；B27 添加劑1∶50（批號17504044）、N2 添加劑1∶100（批號17502048）、1%青-鏈霉素（批號15140122）、1%Hepes緩沖液（10 mmol·L-1）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（批號2414839RP）和Gluta MAXTM-Ⅰ添加劑（批號35050-061），美國Gibco公司；Rho激酶抑制劑（批號S1049），美國Selleck Chemicals 公司；500 nmol·L-1N-乙酰-L-半胱氨酸1∶150（批號A9165）、10 mmol·L-1煙酰胺（批號NO636）和500 nmol·L-1A83-01（批號SML0788-5MG），德國Sigma Aldrich 公司；杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS），美國Thermo Scientific 公司；基質膠，美國Corning 公司；溫和細胞解離（gentle cell dissocitation）試劑（批號100-0485），加拿大Stemcell公司；兔抗小鼠溶菌酶（lysozyme，Lyz）單克隆抗體（批號NBP2-61118），美國NOVUS 公司；兔抗小鼠Ki-67（D3B5）單克隆抗體、兔抗小鼠β-肌動蛋白單克隆抗體和HRP 標記山羊抗兔IgG 抗體（批號分別為718022，2099233 和9129S），美國Cell signaling公司；兔抗MUC-2 單克隆抗體（批號XF3625268），美國Invivogen 公司；兔抗小鼠胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）多克隆抗體和兔抗小鼠肽YY（peotide YY，PYY）多克隆抗體（55292-1-AP和24294-1-AP），美國Proteintech 公司；兔抗小鼠纖連蛋白（fibronectin，Fn）單克隆抗體（批號ab268620）、兔抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）單克隆抗體（批號EP700y）和熒光標記山羊抗兔IgG 抗體（批號ab150077），美國Abcam 公司；RIPA 裂解液，塞維爾生物科技有限公司；小鼠溶菌酶ELISA 試劑盒（批號SEKM-0276），美國Solarbio 公司；RNA 提取試劑盒（批號20220620），北京索萊寶公司；cDNA 鏈合成試劑盒（批號AM12936A），日本TAKARA公司；2×Realab Green PCR Fast mixture 試劑盒（批號R0201），北京蘭博利德生物科技有限公司；引物均為小鼠源，引物序列見表1，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Axio VerA1熒光顯微鏡，德國Carl Zeiss公司；HERACELL 150i CO2培養箱和Multifuge X1R 型低溫離心機，美國Thermo Scientific 公司；Nanodrop分光光度計，美國Pultton 公司；凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；Step One 實時熒光定量PCR 儀，美國Applied biosystems公司。

1.3 小鼠小腸類器官培養和處理

1.3.1 小腸類器官模型建立

將小鼠安樂死后浸泡于75%乙醇中，無菌環境下在靠近胃端取長度約20 cm 小腸，去除腸系膜、血管和脂肪。將腸段放入冷DPBS 中，用10 mL DPBS 沖洗腸段。小腸段切開，用蓋玻片刮掉小腸絨毛和剩余內容物后，剪成2 mm小片段放入50 mL離心管中，用5 mL 移液槍多次吹打洗滌。棄去上清，加溫和細胞解離試劑20 mL，搖床上20 r·min-1室溫消化15 min。自然沉降30 s，棄去上清，加入含1% FBS 的無Ca2+和Mg2+磷酸鹽緩沖液（1%FBS）10 mL，吹打5～10 次。將小腸組織用70 μm濾網過濾，在4 ℃，300×g離心5 min，棄上清。用1 mL DMEM/F12 重懸沉淀并轉移到1.5 mL 新EP 管中，取10 μL 在顯微鏡下觀察隱窩形態并計數。4 ℃，200×g再次離心3 min，棄上清。隱窩細胞團按1∶2比例加入到預先配制好的類器官培養基和基質膠中形成混懸物，以每孔180～200 個隱窩計算，取30 μL 加入預熱的48 孔板中。將48孔板放入37 ℃CO2培養箱中孵育15 min后沿壁加入類器官培養基繼續放回37 ℃CO2培養箱孵育。7 d 內按類器官狀態更換培養基2～3次。

Tab.1 Sequences of primers for real time-quantitative PCR（RT-qPCR）

1.3.2 類器官傳代、凍存和復蘇

按類器官生長情況，在7～10 d 對其進行傳代。吸除全部培養基，每孔加1 mL 溫和細胞解離試劑，反應1 min 后轉移到15 mL 離心管中。室溫搖床20 r·min-1孵育10 min，290×g，4 ℃離心5 min。棄上清后用1 mL DMEM/F12 重懸樣本，再200×g，4 ℃離心5 min。細胞按1∶2 比例加入類器官完全培養基和基質膠形成混懸物，取30 μL 加入預熱的48 孔板中進行培養；小鼠小腸類器官凍存方法步驟同傳代過程。計數離心后的細胞，按1×107L-1密度加入10%DMSO 1 mL，放入程序降溫凍存盒-80 ℃過夜，轉移到液氮中低溫保存。在37 ℃水浴鍋內復蘇凍存的類器官，離心、洗滌、接種、培養和傳代同前。

1.3.3 小腸類器官分組和處理

傳代3 d后小腸類器官分3組處理：正常對照組（C57BL/6J 小鼠小腸類器官）、IR 模型組（db/db小鼠小腸類器官用含0.1%DMSO 培養液處理48 h）和IR 模型+黃諾瑪苷組（db/db小鼠小腸類器官用黃諾瑪苷25，50和100 μmol·L-1處理48 h）。

1.4 免疫熒光檢測小腸類器官Ki-67，E-cad，Lyz和MUC-2蛋白表達

取1.3 制備的小腸類器官培養6 d 后棄去培養基，用冷DPBS 500 μL 洗滌3～4 次，在37 ℃條件下用4%多聚甲醛固定30 min。用0.1% Triton-100打孔15 min，室溫用含5%FBS的PBS封閉30 min。棄封閉液后加入一抗（Ki-67 和Lyz，1∶100；E-cad和MUC-2，1∶200）在4 ℃孵育12 h，用DPBS 洗3～5 次（每次5 min）。加入熒光二抗（1∶500）37 ℃孵育1 h，再用DPBS 洗3～5 次（每次5 min），最后用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染細胞核5 min，通過倒置顯微鏡觀察Ki-67，E-cad，Lyz 和MUC-2 熒光標記。以熒光強度反映目標蛋白表達水平。

1.5 ELlSA檢測小腸類器官Lyz分泌水平

取1.3制備的小腸類器官，培養6 d后將上清液以1000×g，4 ℃離心10 min 后轉移到EP 管中，按照ELISA 試劑盒說明書操作，用波長450 nm 處吸光度（A450nm）值反映Lyz分泌水平。

1.6 RT-qPCR 檢測小腸類器官Lyz，GLP-1，PYY和Fn mRNA表達

取1.3 制備的小腸類器官，培養6 d 后使用RNA 提取試劑盒提取各組樣本總RNA，用Nano-Drop 紫外分光光度計檢測RNA 濃度與純度。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 是否污染及其降解程度。用PrimeScriptTM第一鏈cDNA 合成試劑盒逆轉錄合成cDNA。使用2×Realab Green PCR Fast mixture試劑盒進行檢測，每待測樣品設3個平行樣本。反應體系：cDNA 模板1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，2×Realab Green PCR Fast mixture 10 μL，ROX 熒光標記0.4 μL，無脫氧核糖核酸酶水7.6 μL，總體積20 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環，熔解曲線采集程序為95 ℃30 s，55 ℃30 s。以β 肌動蛋白為內參，用2-△△Ct法計算目標基因mRNA相對表達水平。

1.7 Western 印跡法檢測小腸類器官Lyz，GLP-1，PYY和Fn蛋白表達

1.3.3 分組處理的類器官給藥干預48 h 后棄去全部培養基，每孔加1%FBS 500 μL 進行機械碎膠并轉移到EP 管中，800×g，4 ℃離心5 min，加入RIPA裂解液，4 ℃，9820×g離心30 min。上清轉入新EP 管中，用BCA 法定量蛋白濃度。制備SDSPAGE 凝膠，將各組蛋白溶液調整到同一濃度（1 mg·L-1），變性10 min，上樣（20 μg）。電泳1.5 h，轉膜75 min，常溫下用5%脫脂奶粉封閉90 min。加入一抗（Lyz，GLP-1，PYY 和Fn，稀釋比例均為1∶1000）溶液，4 ℃搖床孵育過夜，洗滌。室溫下加入HRP 標記的山羊抗兔IgG抗體（二抗）（稀釋比例1∶5000）孵育1 h，洗滌。滴加增強型化學發光液（現配現用），曝光后用Image J 軟件分析條帶積分吸光度值。以β-肌動蛋白為內參，用目標蛋白與內參的積分吸光度比值反映目標蛋白表達水平。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 正常小鼠和lR 模型小鼠小腸類器官模型的鑒定

如圖1所示，分離出的隱窩團培養4～5 h 后外圈開始增厚；培養第2 天開始形成輪廓清晰的圓圈狀結構，中間可見管腔；第4天，圓圈狀結構變大，開始出芽形成潘氏細胞和杯狀細胞；第6 天形成圍繞管腔周圍的環狀結構，形成成熟可傳代的類器官。C57BL/6J與db/db小鼠小腸類器官大小、生長速度以及隱窩細胞數量之間有所差異。免疫熒光法結果（圖2）表明，2種小鼠小腸類器官均表達生長及增殖細胞核核抗原Ki-67、上皮細胞E-Cad、潘氏細胞標志物Lyz和杯狀細胞標志物MUC-2。

Fig.1 Dynamic observation of small intestinal organoid formation of normal mice and insulin resistance（lR）mice.After the C57BL/6J and db/db mice were euthanized,the small intestine segments were cut into small fragments and added with a gentel cell dissociation reagent to digest the small intestinal crypts.After that，the crypt cell mass was added to the pre-prepared organoid medium and matrigel at a ratio of 1∶2 to form a suspension,which was added to a 48-well plate with 180-200 crypts per well and incubated in a CO2 incubator at 37 ℃.The medium was changed 2-3 times according to the state of organoids within 7 d.The crypt morphology was observed and counted under a microscope.

Fig.2 Expressions of Ki-67（A），E-cadherin（E-cad，B），Lyz（C）and mucin-2（MUC-2，D）in small intestinal organoids of normal mice and lR mice by immunofluorescence.Small intestinal organoids were cultured for 6 d.

2.2 db/db小鼠小腸類器官Fn，GLP-1和PYY mRNA表達水平

RT-qPCR結果（圖3）顯示，IR模型組FnmRNA表達明顯高于正常對照組（P＜0.05），腸道L 細胞標志物GLP-1和PYYmRNA 表達明顯低于正常對照組（P＜0.05）。

Fig.3 Expressions of Fn,GLP-1 and PYY mRNA in mouse small intestinal organoids by RT-qPCR.Small intestinal organoids were divided into two groups 6 d after subculturation:C57BL/6J mouse small intestinal organoids as normal control group,db/db mouse intestinal organoids as IR model group.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group.

2.3 db/db 小鼠小腸類器官Fn，GLP-1 和PYY 蛋白表達水平

Western印跡結果（圖4）顯示，IR模型組Fn蛋白表達明顯高于正常對照組（P＜0.01），L 細胞標志物GLP-1（P＜0.01）和PYY（P＜0.05）蛋白表達水平明顯低于正常對照組。

Fig.4 Expressions of Fn，GLP-1 and PYY protein in mouse small intestinal organoids by Western blotting.See Fig.3 for the organoid treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.4 db/db小鼠小腸類器官潘氏細胞Lyz分泌水平

如圖5所示，與正常對照組相比，IR模型組小腸類器官潘氏細胞Lyz分泌顯著減少（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of flavonmarin（FM）on Lyz secretion in small intestinal organoids of lR model mice by ELlSA.See Fig.3 for the organoid treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 黃諾瑪苷對lR模型小鼠小腸類器官Lyz mRNA表達水平的影響

如圖6所示，與正常對照組相比，IR模型組小鼠小腸類器官中LyzmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與IR 模型組相比，IR 模型+黃諾瑪苷50 和100 μmol·L-1組小鼠小腸類器官LyzmRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.6 Effect of FM on Lyz mRNA expression in small intestinal organoids of lR model mice by RT-qPCR.Small intestinal organoids were divided into five groups:C57BL/6J mouse small intestinal organoids as normal control group,db/db mouse intestinal organoids as IR model group,db/db mouse small intestinal organoids with FM 25,50 and 100 μmol·L-1 intervention 4 d after subculturation as IR model+FM groups,the intervention duration was 48 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with IR model group.

2.6 黃諾瑪苷對lR 模型小鼠小腸類器官Lyz 蛋白表達水平的影響

Western 印跡結果（圖7）顯示，IR 模型組Lyz表達明顯低于正常對照組（P＜0.01），IR 模型+黃諾瑪苷50 和100 μmol·L-1組小鼠小腸類器官Lyz 表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.7 Effect of FM on Lyz protein expression in small intestinal organoids by Western blotting.See Fig.6 for the organoid treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with IR model group.

3 討論

本研究通過在體外直接分離、培養小腸隱窩完成了C57BL/6J和db/db小鼠小腸類器官的建立、傳代、凍存和復蘇等工作。這與直接分離腸道干細胞的方法不同，省去了小腸干細胞的分選步驟，并發現建立的正常小鼠與IR 模型小鼠小腸類器官在隱窩細胞數量、生長速度和大小等方面有所差異。

免疫熒光結果顯示，本研究建立的小鼠小腸類器官均表達Ki-67，E-cad，Lyz 和MUC-2，表明建立的正常小鼠和IR小鼠小腸類器官很好地保留了來源于小腸隱窩團中腸道干細胞的增殖分化特征，且腸道類器官與小腸組織上皮的結構和組成具有一致性，與體內小腸組織具有相同的多細胞組成等特點。

RT-qPCR 和Western 印跡結果中，IR 模型小鼠Fn mRNA 和蛋白均高表達，腸道L 細胞標志物GLP-1 和PYY mRNA 和蛋白低表達。這可能跟高血糖促進成纖維細胞分泌Fn，從而引起纖維化病變有關。IR 模型小鼠小腸長期處于低度炎癥狀態，可能會使隱窩細胞生長速度變慢，細胞黏附性降低，從而導致腸黏膜屏障受損，腸道通透性增加。

傳統改善IR 的藥物不可避免地具有胃腸道反應、低血糖、體重增加和皮膚病變等不良反應［18-19］。根據報道，黃酮類、膳食纖維、皂苷和多糖等天然活性化合物具有改善IR 特性，不良反應少，依賴性低，資源豐富［20］。潘氏細胞是機體小腸特征性細胞，與腸道干細胞相鄰，能分泌Lyz 和α 防御素等抗菌分子到小腸管腔［21］，回腸中Lyz 水平的顯著下降可能參與IR 及T2DM 的發生發展［22］。ELISA 結果顯示，IR 模型小鼠小腸類器官Lyz 分泌水平顯著低于正常小鼠，表明IR 模型小鼠腸道局部防御能力下降可能與潘氏細胞分泌Lyz減少有關。

本研究通過對正常小鼠和IR 模型小鼠小腸類器官進行藥物干預發現，黃諾瑪苷具有回調IR 小鼠小腸類器官Lyz表達的作用。黃諾瑪苷可能通過增加遺傳因素導致的IR 小鼠腸道潘氏細胞Lyz 含量來減少腸道通透性，緩解腸道屏障受損，通過維護黏膜屏障改善IR。具體分子機制還需進一步研究。