氟諾哌齊對新西蘭家兔胚胎-胎仔發育毒性及毒代動力學

毛閃閃，李芳，蔡桂紅，朱云凱，許旭，崔艷君，周文，曹敏，周莉

（1.湖北天勤生物科技股份有限公司武漢分公司，湖北武漢 430075；2.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇連云港 222000；3.中藥制藥過程控制與智能制造技術全國重點實驗室，江蘇連云港 222000）

乙酰膽堿酯酶（acetylcholin esterase，AChE）抑制劑是臨床上用于阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）治療的一線藥物，氟諾哌齊（fronopezil）對AChE 具有選擇性抑制活性，且具備高親和力和慢解離動力學特征，比同類藥物藥效維持時間長；口服生物利用度高，組織分布廣泛，腦組織內藥物濃度高（為血漿藥物濃度的4.4 倍）；安全性良好，基因KCNH2（hERG）和遺傳毒性測試均顯示陰性，但相關生殖毒性的研究未見報道［1-3］。本研究采用新西蘭家兔，根據國家食品藥品監督管理局《藥物生殖毒性研究技術指導原則》的要求［4-5］，自胚胎著床至硬腭閉合期間，即妊娠第6～18 天（GD6-18）ig 給予不同劑量氟諾哌齊，觀察其對妊娠新西蘭家兔母體（孕兔）、胚胎和胎仔發育的影響，為母體孕期接觸氟諾哌齊對胎兒造成的影響提供非臨床試驗數據，為其臨床廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

氟諾哌齊（類白色粉末）（批號190801），江蘇康緣藥業股份有限公司。ELISA 試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；羥丙基甲基纖維素（批號D1908084），德國aladdin公司；聚乙二醇400（批號20190625），國藥集團化學試劑有限公司；環磷酰胺（批號20191026），山東西亞化學工業有限公司。

LS220A分析天平，瑞士Precisa公司；AX1502ZH/E電子天平，奧豪斯儀器有限公司；imark 酶標儀，美國Bio-Rad 公司；TSQ Quantum Access Max 三重四極桿液質聯用儀，美國Thermo 公司；色譜柱Ultimate XB-C18（2.1 mm×50 mm，5 μm），上海月旭科技股份有限公司。

1.2 動物

新西蘭家兔，普通級，雌性140 只，雄性18 只，購自邳州市東方養殖有限公司，動物生產合格證號SCXK（蘇）2017-0002。新西蘭家兔飼養在湖北天勤生物科技有限公司安評中心普通級兔觀察室，實驗開始前檢疫7 d，交配期飼養于1000 mm×700 mm×450 mm不銹鋼兔交配籠內，交配前和交配成功后飼養于500 mm×700 mm×450 mm 連體不銹鋼兔籠內，單籠飼養，自由飲水、攝食，溫度18～26 ℃（日溫差≤4 ℃），濕度40%～70%，每小時換氣次數≥8次，工作照度≥200 Lux，動物照度100～200 Lux，每12 h明暗交替（光照時間7∶00-19∶00）。本試驗所涉及的動物管理、使用和相關操作均經湖北天勤生物科技有限公司武漢分公司實驗動物管理和使用委員會審核和批準。

1.3 實驗分組和處理

挑選發情雌兔放入雄兔籠內，交配成功當天為GD0，根據孕兔妊娠順序進行隨機分組，分為溶媒對照（1%羥丙基甲基纖維素+1.5%聚乙二醇400水溶液）、環磷酰胺18 mg·kg-1及氟諾哌齊3.6，9.0 和22.5 mg·kg-1（相當于藥效起效劑量的20，50 和125 倍）組。于GD6-18溶媒對照組和氟諾哌齊組分別ig 給藥，每天1 次，連續13 d；于GD6-20環磷酰胺組ig給予環磷酰胺，每天1次，連續15 d。

1.4 觀察指標［6-7］

1.4.1 孕兔

①一般狀況：試驗期間每天1～2 次觀察動物的外觀、行為活動及異常分娩等情況；②GD0，GD3，GD6，GD10，GD13，GD15，GD18，GD20，GD24和GD28測量體重，GD0-1，GD6-7，GD13-14，GD19-20和GD27-28測量攝食量；③GD28剖宮檢查內臟，計數黃體數，稱量子宮連胎重，稱量胎盤重，檢查活胎、死胎和吸收胎數，計算著床數；④GD5，GD18和GD28分別采集血樣，離心提取血清，ELISA 檢測血清中黃體生成素、卵泡刺激素、孕酮、雌二醇和睪酮水平。

1.4.2 胎仔

GD28①檢查胎仔性別、重量、頂臀長和尾長；②檢查胎仔外觀、內臟和骨骼等［8-9］。

1.5 伴隨毒代動力學

1.5.1 方法學建立

據前期委托方提供的毒代動力學檢測方法和本實驗室預試驗中建立的檢測方法，采用DC511267作為內標，建立氟諾哌齊的兔毒代動力學高效液相色譜串聯質譜法，并進行方法學驗證。色譜條件：Ultimate XB-C18 柱（2.1 mm×50 mm，5 μm），柱溫40 ℃，流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序為0.01～1.0 min，5%B～10%B；1.0～1.6 min，10%B～50%B；1.6～2.6 min，50%B；2.6～2.61 min，50%B～5%B；2.61～3.2 min，5%B。流速0.6 mL·min-1，進樣體積2.0 μL。質譜條件：采用電噴霧電離源，正離子掃描，多反應監測模式，霧化氣50 psi，輔助加熱氣60 psi，源溫500 ℃，離子噴霧電壓5000 V，去簇電壓80 eV，氟諾哌齊檢測離子對m/z416.2/138.1，碎裂電壓16 kv；DC511267 檢測離子對m/z422.1/402.2，碎裂電壓22 kv。數據采集時間3.2 min。

1.5.2 毒代動力學

設氟諾哌齊3.6，9.0 和22.5 mg·kg-13 個劑量組［5］進行毒代動力學研究。首次（GD6）和末次（GD18）分別于給藥前和給藥后0.25，0.5，1，1.5，3，6，10 和24 h耳緣靜脈采血約0.5 mL，置于預先加有肝素鈉20 μL的抗凝管中，靜置1～2 h后4 ℃3500×g離心10 min，取上層血漿樣本置-80 ℃凍存待測。采用液質聯用法分析血漿和組織中氟諾哌齊濃度，擬合得到達峰時間（Tmax）、血藥峰濃度（Cmax）和藥時曲線下面積（AUC0-t）。

1.5.3 組織藥物濃度

GD18給藥后采集氟諾哌齊各劑量組孕兔24 h血樣后，GD19再次給藥，在約達到血藥濃度峰值時（約給藥后1 h）處死孕兔，取孕兔血漿、羊水和胎盤，同時取胎仔組織，勻漿、離心、分裝后置-80 ℃凍存待測。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 氟諾哌齊對孕兔妊娠期間一般狀況的影響

由表1 可知，GD0-28期間ig 給藥后，7 只孕兔流產（其中溶媒對照組1 只，環磷酰胺組5 只，氟諾哌齊3.6 mg·kg-1組1 只）；4 只陰道出血（環磷酰胺組）；其余動物活動正常，被毛濃密有光澤，眼睛鮮紅而有精神，呼吸正常，鼻部無血性分泌物，與溶媒對照組相比無明顯異常。

Tab.1 Abnormal signs and manifestations of animals after fronopezil ig administration in embryo-fetal developmental toxicity and concomitant toxicokinetic tests（phase Ⅱ）

2.2 氟諾哌齊對孕兔妊娠期間體重和宮外增重的影響

由圖1 和圖2 可知，與溶媒對照組比較，妊娠期間氟諾哌齊各劑量組體重和妊娠期宮外增重（GD28體重-GD6體重-子宮連胎重）均未見統計學差異。

Fig.1 Effect of fronopezil ig administration on body mass of pregnant rabbits in embryo-fetal developmental toxicity and concomitant toxicokinetic tests(phaseⅡ).See Tab.1 for the rabbit treatment.±s，n=17（vehicle control,flunopazil 9 and 22.5 mg·kg-1 group），18（cyclophosphamide group），16（flunopazil 3.6 mg·kg-1 group）.

Fig.2 Effect of fronopezil ig administration on extrauterine body mass gain of pregnant rabbits in embryofetal developmental toxicity and concomitant toxicokinetic tests.See Tab.1 for the rabbit treatment.±s，n=17（vehicle control,flunopazil 9 and 22.5 mg·kg-1 group），18（cyclophosphamide group），16（flunopazil 3.6 mg·kg-1 group）.

2.3 氟諾哌齊對孕兔妊娠期間攝食量的影響

由表2可知，與溶媒對照組比較，氟諾哌齊各劑量組攝食量均未見明顯差異。

Tab.2 Effect of fronopezil ig administration on food consumption of female rabbits during pregnancy in rabbit embryo-fetal developmental toxicity and concomitant toxicokinetic tests（phaseⅡ）

2.4 氟諾哌齊對孕兔胚胎發育指標的影響

由表3 可知，所有組別大體解剖內臟未見明顯異常；與溶媒對照組比較，氟諾哌齊各劑量組平均活胎數、平均黃體數、平均著床數、吸收胎率和死胎率均無明顯差異；僅9.0 mg·kg-1組活胎率高于溶媒對照組（P＜0.05）；環磷酰胺組活胎率明顯低于溶媒對照組（P＜0.01），吸收胎率明顯高于溶媒對照組（P＜0.01）。

Tab.3 Effect of flunopazil on pregnancy outcomes in pregnant rabbits

2.5 氟諾哌齊對孕兔激素水平的影響

由表4 可知，與同期溶媒對照組比較，GD5，GD18和GD28氟諾哌齊各劑量組激素水平均未見明顯差異。與GD5溶媒對照組比較，GD18溶媒對照組黃體生成素、卵泡刺激素和孕酮水平升高（P＜0.01），環磷酰胺及氟諾哌齊3.6 和22.5 mg·kg-1組孕酮水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；GD28溶媒對照組黃體生成素和卵泡刺激素水平升高（P＜0.01），環磷酰胺組孕酮和睪酮水平降低（P＜0.05，P＜0.01），氟諾哌齊3.6 mg·kg-1組雌二醇和孕酮水平降低（P＜0.05，P＜0.01），9.0 mg·kg-1組孕酮水平降低（P＜0.01），22.5 mg·kg-1組卵泡刺激素水平升高（P＜0.01），雌二醇水平降低（P＜0.05）。

Tab.4 Effect of flunopazil on hormone levels in pregnant rabbits

2.6 氟諾哌齊對孕兔胎仔發育的影響

由表5可知，與溶媒對照組比較，氟諾哌齊各劑量組胎仔的窩平均體重、頂臀長、尾長和胎盤重量未見明顯差異；環磷酰胺組胎仔體重、頂臀長和尾長均有不同程度降低（P＜0.01）。

Tab.5 Effect of flunopazil on growth and development of fetal rabbits

由表6和圖3（C 和E）可知，溶媒對照組和氟諾哌齊各劑量組共檢查580 只胎仔外觀和內臟，未見外觀和內臟畸形胎仔。

Tab.6 Effect of flunopazil on appearance，viscera and bone of fetal rabbits

Fig.3 Effect of flunopzil on fetal appearance，viscera and bone in developmental toxicity of embryos and fetuses in rabbits（phase Ⅱ）.See Tab.1 for the rabbit treatment.A：gastroschisis（arrow）in the 2F06 positive control group；B：fewer fingers（arrow）in the 2F06 positive control group；C：breastbone of normal fetus in 1F01 solvent control group；D：the fifth sternum is missing in the 2F10 positive control group；E：caudal vertebrae of normal fetus in 5F03 high-dose group；F：caudal ossification and caudal fusion in 2F10 positive control group（arrow）.

由表6 和圖3 可知，采用雙染法對580 只胎仔進行骨骼染色，溶媒對照組和氟諾哌齊各劑量組未檢查出頭面部骨、肋骨、四肢、胸骨和尾椎的畸形或變異。與溶媒對照組比較，氟諾哌齊9.0和22.5 mg·kg-1胸骨骨化點為6 個的胎仔增多（P＜0.01），胸骨骨化點為4～5 個的胎仔減少（P＜0.01），各劑量組未見胸骨骨化點為0～3個的胎仔。

環磷酰胺組外觀：主要表現為皮下出血35.0%（28/80）、口唇異常6.3%（5/80）、少指/趾26.3%（21/80）、足內翻20.0%（16/80）、短尾11.3%（9/80）、腹裂2.5%（2/80）、無眼1.3%（1/80）和卷尾15.0%（12/80），整體異?；蚧温剩?5.0%）明顯高于溶媒對照組（P＜0.01）。環磷酰胺組共檢查10 窩80 只胎仔內臟，其中7 只（8.8%）胎仔內臟畸形，主要表現為肝葉增多、不規則、形狀異常、腎盂擴張、腎皮質與髓質分界不清和心室擴張，與溶媒對照組相比具有統計學差異（P＜0.01）。胸骨節骨化點為6 個、4～5 個和≤3 個的分別為55 只（68.8%）、21 只（26.3%）和4 只（5.0%），其中胸骨節為4～5 個胎仔數明顯低于溶媒對照組（P＜0.05），胸骨節骨化點＜3的胎仔數和頭面部骨異常率明顯高于溶媒對照組（P＜0.01）。環磷酰胺組畸形表現為胸骨融合、胸骨裂和胸骨骨化不全，肋骨融合和肋骨錯位，尾椎融合、尾椎骨化不全和尾椎排列不齊，指（趾）缺失等，（表6及圖3A，B，D和F）。

2.7 氟諾哌齊伴隨毒動學

2.7.1 孕兔體內藥動學

由圖4 和表7 可知，孕兔首次、末次給藥后，隨著時間延長，氟諾哌齊血藥濃度呈現逐漸增加趨勢，達峰后，逐漸減少。AUC0-24h值與給藥劑量呈線性關系（首次給藥r=0.9957；末次給藥r=0.9830），Cmax值均與給藥劑量呈非線性關系。氟諾哌齊3.6，9.0，22.5 mg·kg-1末次給藥Cmax值與首次比值分別為0.839，1.226 和1.128；AUC（0-24h），與首次的比值分別為0.963，0.993和0.813。

Fig.4 First（GD6，A）and last（GD18，B）blood concentration-time curve of flunopazil in pregnant rabbits after ig administration.See Tab.1 for the rabbit treatment.±s，n=7.

Tab.7 Concomitant toxicity kinetic parameters of flunopazil in pregrant rabbits

2.7.2 組織分布

由表8 可知，GD19給藥后，采集1 h 孕兔血漿、羊水、胎仔和胎盤組織勻漿進行藥物濃度檢測，結果表明，氟諾哌齊3.6、9.0 和22.5 mg·kg-1組孕兔血漿藥物濃度呈逐漸增加趨勢，比值為1∶2.78∶10.74，羊水、胎仔和胎盤中藥物濃度比值分別為1∶3.11∶8.37，1∶3.23∶6.35和1∶3.09∶8.79。

Tab.8 Tissue drug concentrations of flunomazil in pregnant rabbits after ig administration

3 討論

本研究采用氟諾哌齊3 個劑量對妊娠期孕兔ig給藥，各劑量組孕兔妊娠期各時間點的一般狀況、體重、攝食量均未見明顯差異，表明氟諾哌齊沒有造成明顯的母體毒性。據孕兔的妊娠結局，各劑量組胎仔的平均黃體數和平均著床數等均未見明顯差異，表明氟諾哌齊對親代的生殖能力未產生明顯影響。氟諾哌齊各劑量組胎仔的窩均體重、頂臀長和尾長未見明顯差異，表明未對胎仔的體格生長發育產生毒性作用。

氟諾哌齊各劑量組胎仔外觀、內臟和骨骼檢查均未見變異或畸形。為考察氟諾哌齊對孕兔激素是否有影響［10］，本研究進行了激素水平檢測。與GD5比較，溶媒對照組GD18和GD28黃體生成素、卵泡刺激素及GD18孕酮水平均升高。溶媒對照組給予的是含1%羥丙基甲基纖維素和1.5%聚乙二醇400的水溶液，二者均為普通藥用輔料，故認為激素水平的改變與妊娠有一定關系；氟諾哌齊各劑量組卵泡和激素、孕酮和雌二醇水平有一定波動，變化范圍均在溶媒對照組波動范圍內或附近，與同期溶媒對照組比較無明顯差異；且未發現對妊娠結局以及胚胎-胎仔發育產生影響。一定程度內的激素波動屬于正常范圍內的波動，但提示臨床給予大劑量氟諾哌齊時，應注意監測激素水平的變化。

本研究根據文獻［11］設計了環磷酰胺的劑量，試驗中環磷酰胺組流產略多，考慮可能與陽性藥的生產廠家、批號和動物的個體差異等有關。陽性對照環磷酰胺采用的是對妊娠期孕兔ig 給藥，主要目的是為了驗證試驗系統，為生殖毒性試驗陽性指標的判定提供依據。與溶媒對照組比較，環磷酰胺組孕兔妊娠期各時間點的體重、攝食量均未見明顯差異，但流產數量較多，同時孕兔的活胎率降低，吸收胎率升高，表明環磷酰胺具有一定的胚胎毒性；環磷酰胺組胎仔的窩均體重、頂臀長和尾長均低于溶媒對照組，其胎仔外觀、內臟和骨骼畸形或變異均高于溶媒對照組，表明環磷酰胺對胎仔的體格生長發育產生明顯影響，并具致畸作用。據報道，新西蘭家兔（GD6-20）ig 給予環磷酰胺18 mg·kg-1，胎仔外觀檢查發現口唇異常、缺指和眼球缺失等［12］，與本研究結果一致。

伴隨毒代動力學結果表明，孕兔在3.6～22.5 mg·kg-1劑量范圍內ig 給予氟諾哌齊后，首次給藥（GD6）和末次給藥（GD18）平均Cmax和AUC（0-24h）隨劑量增加而增大；與GD6比較，GD18的平均Cmax和AUC（0-24h）均無明顯增加；3.6，9.0和22.5 mg·kg-1蓄積因子〔AUC（0-24h）末次/首次比值〕約為1，認為受試物在孕兔體內無明顯蓄積；孕兔血藥濃度、羊水、胎仔和胎盤中藥物濃度均隨劑量增加呈現逐漸增加趨勢，羊水中藥物濃度在1∶3.11∶8.37 之間，胎仔和胎盤在1∶3.23∶6.35和1∶3.09∶8.79之間，約等于劑量比1∶2.5∶6.25，表明受試物可透過胎盤屏障。結合胎仔的各項檢查結果，認為氟諾哌齊不會對胚胎-胎仔發育產生明顯影響。

在本試驗條件下，ig 給予氟諾哌齊對孕兔妊娠期體重、體增重、攝食量、妊娠結局（平均黃體數、平均著床數、平均活胎數、活胎率和吸收胎率）以及胎仔外觀、內臟和骨骼等均未引起明顯變化；僅在GD18或GD28卵泡刺激素、雌二醇和孕酮水平有一定程度波動，提示臨床給予大劑量氟諾哌齊時應注意監測激素水平的變化。伴隨毒代動力學研究表明，氟諾哌齊可透過胎盤屏障，但在孕兔體內無明顯蓄積。綜上，氟諾哌齊對孕兔、胚胎-胎仔發育毒性的未見有害作用劑量為22.5 mg·kg-1，為藥效起效劑量的125倍。