NLRP3和白細胞介素6受體與房顫相關性研究

劉晨陽,楊海晨,耿嘉逸,李浩宇,雷思思,康品方,唐 碧

(1.蚌埠醫科大學第一附屬醫院 心血管科,安徽 蚌埠 233004;蚌埠醫科大學 2.心腦血管病研究中心,3.公共衛生學院2020級預防醫學4班,安徽 蚌埠 233030;4.安徽醫科大學 臨床醫學院公共事業管理,安徽 合肥 230000)

心房顫動(AF)目前已成為臨床上最常見的心律失常之一,在整個世界范圍內的發病率呈現日益增長的趨勢,它不僅增加了腦卒中和惡化性心力衰竭的風險[1],同時AF還能讓心力衰竭的患病率擴大3倍,并且加劇心力衰竭的臨床癥狀[2]。在心房重構引起的AF的病理生理過程中,經?？梢杂^察到炎癥反應的增強[3-4]。

炎癥小體是免疫細胞和其他細胞胞質中的高分子量蛋白質復合物,在固有免疫系統對細胞應激反應起著關鍵作用。NLRP3炎癥小體是特征性最顯著且被廣泛研究的炎癥小體,它是由NLRP3、胱冬肽酶-1(caspase-1)及凋亡相關微粒蛋白(ASC)組成的一種蛋白復合物[5]。研究[6]已證實了NLRP3炎癥小體在缺血性和非缺血性心肌病小鼠模型中的中心作用。白細胞介素6(IL-6)是一種具有多種效能的細胞因子,其循環水平已被確定為不同心血管疾病(如AF和冠心病)的發生及預后標志[7]。在血漿中,IL-6受體的可溶部分(sIL6R)與可溶性gp130相結合形成復合物(sgp130/sIL6ST),這是一種IL-6的抑制復合物[8],血漿中的sIL-6R作為誘餌受體,負調節IL-6信號。研究[9]發現,AF病人外周血中IL-6水平高于正常人,并且推測因為AF病人血清中的NLRP3炎癥小體的異常激活導致下游轉導途徑開啟,使IL-6表達上調,從而加劇部分或整個心臟的炎性活動,促進對心房電重構與結構重構的形成,進而促進AF的發生發展以及維持。一項全基因組關聯研究發現了一種有針對性的方法可以識別出IL-6R位點中具有顯著性的基因變體名為rs4845625的變異體,它位于IL-6R基因的內含子中,與AF緊密相關[10]。本研究旨在探討通過血清NLRP3和IL-6R表達水平以及進行兩者與左心房內徑的相關性,分析NLRP3、IL-6R與AF之間的關系?，F作報道。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇我院2019年7月至2020年7月收住的AF病例150例作為觀察組,入院檢查均有12導聯心電圖和/或24 h動態心電圖所記錄的AF波形,根據相關檢查分為陣發性AF組(PAF)84例和非陣發性AF組(nPAF)66例。納入標準:臨床相關病例資料完整以及根據我國AF最新指南對AF分類,PAF:持續時間≤7 d(?！?8 h),能自行終止;nPAF:發作之后持續時間超過7 d的AF,nPAF包括持續性AF、長期持續性AF和永久性AF。持續性AF:持續時間>7 d,非自限性;長期持續性AF:持續時間≥1年,病人有轉復愿望;永久性AF:持續時間>1年,不能終止或終止后又復發。排除標準:(1)罹患各種急性或慢性炎癥性感染性疾病(比如真菌、病毒、細菌等);(2)既往有較為嚴重的肝腎功能不全及腫瘤病人;(3)合并有各種影響炎癥的一些疾病如:心肌炎、甲狀腺疾病等疾病病人;(4)近期內有手術史、近3 d內服用抗炎類藥物;(5)自身免疫類疾病如:類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、痛風等疾病;(6)心血管類疾病及器質性心臟病:如冠心病、瓣膜性心臟病、先天性心臟病、擴張型心肌病、缺血型心肌病、雷諾綜合征等。本研究另外選擇同一時期至我院排除AF的健康體檢者120名作為對照組,并且均無心血管疾病。所有的研究對象均獲取知情同意,同時簽字確認且符合人體試驗倫理標準。研究前獲得我院倫理委員會準可。

1.2 實驗方法

采集并分析研究對象的臨床資料,包括性別、年齡、肝腎功能、血壓、白細胞、吸煙史與紅細胞及腦卒中病史、糖尿病病史等各種指標。在所有的AF病人在入院后、治療前和無AF的健康體檢者體檢時均在早晨7點空腹時抽取外周靜脈血10 mL,離心后(3 000 r/min,4 min,半徑16 cm)取上層血清裝入1.5 mL EP離心管中于-80 ℃超低溫冰箱中保存,借助ELISA法,測定NLRP3、IL-6R血清含量,所用試劑盒皆源于上海羽朵公司;借助全自動生化分析儀(西門子,Dimension○REXLTMwith LM)檢測生化指標,相關試劑盒源于上海羅氏。以上各項操作皆規范,參照試劑所附說明書開展。

1.3 統計學方法

采用χ2檢驗、方差分析、q檢驗、相關分析和logistic回歸分析。

2 結果

2.1 3組臨床基線資料比較

3組年齡差異有統計學意義(P<0.01);性別、高血壓、糖尿病、吸煙史及其他相關實驗室檢查差異均無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 3組一般資料比較[n;百分率(%)]

2.2 3組心臟彩超指標結果比較

對照組LAD較PAF組及nPAF組差異有統計學意義(P<0.05),且在nPAF組與PAF組之間差異亦有統計學意義(P<0.05);3組左室射血分數差異均無統計學意義(P>0.05);3組左室舒張末期內徑差異均無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 3組研究對象心臟彩超指標結果比較

2.3 3組血清中NLRP3、IL-6R水平比較

與對照組相比,PAF組、nPAF組的IL-6R水平均增高(P<0.05),且兩兩之間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比,PAF組、nPAF組的NLRP3水平均增高(P<0.05),且兩兩之間比較差異均有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 3組血清中NLRP3及IL-6R水平比較

2.4 NLRP3、IL-6R與LAD的相關性分析

觀察組中NLRP3水平與LAD呈正相關關系(r=0.771,P<0.05);IL-6R水平與LAD呈正相關關系(r=0.682,P<0.05);觀察組中NLRP3水平與IL-6R水平大小呈正相關關系(r=0.680,P<0.05),提示在AF中二者作用性質相同。

2.5 logistic多因素回歸分析

采用logistic多因素回歸分析,將是否為AF作為因變量,把年齡、NLRP3、IL-6R、LAD作為自變量,結果表明NLRP3及IL-6R血清學水平、LAD、年齡是AF的危險因素(P<0.05)(見表4)。

表4 二元logistic回歸分析結果

3 討論

當前臨床中AF此類心律失常的發生率最高,達0.4%～1.0%,此數據在年齡增長下呈不斷上漲趨勢。近年研究[11]發現對于AF的發生和發展,免疫炎性活動可能起到了重要的參與作用。炎癥小體是免疫細胞和其他細胞胞質中的高分子量蛋白質復合物,在固有免疫系統對細胞應激的反應中起著關鍵作用。炎癥小體同時也是一個多蛋白信號轉導平臺,通常涉及3種蛋白質:NODlike受體(NLR)、含有CARD(ASC)的銜接蛋白樣凋亡相關斑點蛋白和半胱氨酸蛋白酶,如caspase-1或caspase-5[12]。

迄今為止,最可能導致AF的炎癥細胞類型為“含蛋白3的NACHT、LRR和PYD結構域”(NLRP3)炎癥細胞[13],它可以介導caspase-1從前caspase-1的成熟(激活),導致細胞因子(如IL-1β、IL-6)的成熟和釋放,并介導炎癥性程序性細胞死亡,此種死亡稱為熱休克[14],為了進一步探討炎癥小體NLRP3對于AF的形成與發展是否具有促進作用,我們對AF病人與非AF病人的NLRP3血清表達量進行檢測,結果顯示就NLRP3水平而言,相較于對照組,PAF組與nPAF組水平均呈明顯偏高(P<0.05),另外nPAF組大于PAF組,說明NLRP3炎癥小體與AF的發生關系密切,可能提示AF持續時間越長炎癥反應就越劇烈。有研究[14]證實NLRP3炎性小體可以被缺血所誘導,從而在心肌損傷的過程中產生多種信號激活,死亡的心肌細胞釋放dsDNA、RNA和ATP,dsDNA和RNA可激活TLR-NFkB信號通路,促進NLRP3和pro-IL1β的啟動,ATP可以激活心肌細胞(CMs)中的P2X嘌呤受體7(P2X7R),增強K+流出,促進NLRP3炎癥復合物的組裝,從而促進caspase-1的自身催化及活化[14]。成熟的caspase-1通過兩種機制進一步維持心肌重塑[9],一方面,成熟的caspase-1可以通過將其前體蛋白切割成成熟的IL-1β和IL-18,IL-1β和IL-18的增加將擴散和放大局部炎癥并促進纖維化,這是導致心肌結構重塑的主要因素[15]。另一方面,成熟的caspase-1裂解了NLRP3炎癥小體的另一個關鍵成分GSDMD,導致GSDMD的N端蛋白水解片段的形成,該片段可促進炎癥細胞死亡,稱為“熱下垂”[16]。PAF及nPAF病人的CMs中NLRP3炎癥小體的活性增加[17],CMs中NLRP3炎癥小體的組成性激活可通過在小鼠中產生異位(觸發)活性和促進電重構的再進入而增加AF易感性[18]。

IL-6為細胞毒性T細胞(CTL)和成纖維細胞所產生的的一類具備多效性的細胞因子[18],可導致白細胞、中性粒細胞等浸潤從而引發全身炎癥的活化,而這些炎癥介質又可導致血管及內皮的損傷進而通過影響心肌細胞的功能從而誘發AF、心衰等心血管事件[19-22]。AULIN等[23]認為,在AF病人中IL-6高水平與血栓栓塞和大出血的高風險相關,是血栓栓塞事件的獨立危險因素。已有研究證實在人體內中IL-6水平與IL-6R水平呈明顯直線相關,而IL-6R主要在免疫細胞及干細胞中表達[24],絕大部分的sIL-6R是由選擇性剪接這條途徑生成的[25],IL-6R通過與IL-6結合,激活JAK/STAT等多條信號轉導通路,產生大量終末攻擊復合物,造成血管內皮受損從而導致各種心血管事件[26]。IL-6R中廣泛存在的(歐洲群體30%～40%)Rs2228145此非同義變體被視作因果變體,其顯著正相關于sIL-6R的循環水平[27-28],而血漿中的sIL6R作為誘餌受體,負調節IL6信號,但是在組織水平上,細胞膜蛋白復合物中IL-6R的表達可以促進IL-6信號傳導[29]。細胞中IL-6信號轉導經由IL-6/膜與自身受體(mIL-6R)結合,或結合自身可溶性受體(sIL-6R),此反應的啟動由2個糖蛋白130,即gp130負責[30],上述2類受體介導的為經典的IL-6信號途徑即為:IL-6、IL-6R、gp130組成復合物后通過激活絲裂原活化蛋白激酶途徑和Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子途徑誘導靶基因的表達,從而發揮出其生物學效應[31]。

此外,通過對logistic回歸分析發現LAD、年齡對于AF病人來說都是危險因素。LAD作為代表心臟左心房大小及結構形態的重要結構,已證實與AF的發生有關:LAD越大,AF持續的時間就會越長,經早期經射頻消融術,術后再次復發的概率就會越高,LAD增大與AF發生和發展可能有著密切聯系,可以將左房內徑增大作為AF發生的獨立危險因素[32-33],故在本研究中我們發現AF病人血清中NLRP3與IL-6R的水平與LAD呈正相關關系(r=0.776、r=0.682,P<0.05),同時結合3組LAD數值來看,我們會發現AF病人隨著AF持續時間的不同,LAD數值有差異,持續時間越長,病人的LAD越大。nPAF組LAD大于PAF組、PAF組LAD大于對照組(P<0.05)。LAD增大,說明AF持續時間增加,左心房結構重構加重,而炎癥是導致結構重構的重要原因,從而進一步證實了炎癥與AF存在密不可分的聯系。AF病人NLRP3、IL-6R水平分別與左房內徑成正相關,說明炎癥越重,左心房重構越明顯,就更容易誘發AF并且可能使得AF持續存在。對于年齡我們可以推測:隨著年齡的增加正常健康人的心臟功能會逐漸降低,同樣心房肌細胞的功能也會慢慢弱化,此時如果伴隨著如NLRP3、IL-6R等炎癥小體異常激活,心房肌細胞發生結構和/或電生理重構,AF發生的概率會大大增加。但是目前,NLRP3與其下游因子及IL-6R水平在年齡增長下的水平有所提高與否還未明確,尚需通過更為深入的研究來驗證。

根據本研究我們得出以下結論:(1)PAF組及nPAF組的病人血清中NLRP3、IL-6R水平的表達高于對照組,提示AF的發生與IL-6R、NLRP3炎癥小體緊密相關,其在AF的發生、進展方面可能發揮著關鍵性作用,在治療AF方面可能會給予更多有效可行的臨床思路。(2)進一步表示AF顯著相關于炎性活動。(3)AF病人的LAD和NLRP3、IL-6R表達同樣具有相關性,推測其可能是由于IL-6R與IL-6結合引起的炎性活動與炎癥小體NLRP3下游的相關炎性介質介導炎性活動的協同刺激下,由此使得心臟電重構與結構重塑使得LAD增大,導致AF的發生。

綜上所述,AF病人血清內炎癥小體NLRP3與其下游因子表達量增多及IL-6R上調皆顯著與AF相關,此成為AF治療靶點的概率很高。然而本研究樣本量有限,同時在其他因素影響下,包括對象選擇、各類數據測定方法、組間對比等,還有水平限制,故提供的數據存在不足,尚需通過多中心、大樣本研究來更為深入探討NLRP3、IL-6R同AF的關系。