EBV下調miR-34c促進鼻咽癌細胞增殖、遷移的作用及機制研究

張 萃,吳應玲,丁景菊,王 勝,谷 雨,何 磊,蔣正舉

(1.貴州省六盤水市人民醫院 耳鼻喉科,553001;2.遵義醫科大學附屬醫院 耳鼻咽喉頭頸外科,貴州 遵義 563001)

鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma,NPC) 是一種源自鼻咽隱窩上皮的人類惡性腫瘤,在東南亞的發病率高,并且與遺傳及愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染有關[1]。EBV被認為是NPC的病因,是第一個鑒定的編碼miRNA的人類致癌病毒[2]。研究[3-5]顯示EBV-miRNA有助于癌癥存活率和腫瘤細胞遷移。目前,放療是NPC的首選治療方法,已被證明可以提高病人生存率。盡管NPC的5年局部控制率已達到80%～90%,但仍有15%～30%的病人發生遠處轉移[6]。因此,闡明NPC轉移的機制對于改善預后和治療結果具有重要意義。

miR-34c是位于人類11號染色體上的77 bp非編碼RNA,屬于miR-34家族,可通過與靶基因序列片段結合調控細胞進程[7]。miR-34c通過與Bcl2基因的3′非翻譯區配對抑制Bcl2,從而下調喉癌細胞的活力并誘導其凋亡[7]。miR-34c可調節非小細胞肺癌的發展和維持內質網穩態[8]。研究[9]顯示,低水平的miR-34c是NPC病人的危險因素,miR-34c在NPC組織中下調,其下調顯示可抑制細胞凋亡。相關研究[2]表明,EBV感染和EBV編碼的miRNA也與鼻咽癌的發展有關。到目前為止,EBV下調miR-34c在NPC進展中的作用仍然未知。本研究旨在探討EBV下調miR-34c對促進NPC細胞增殖和遷移的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人EBV陰性NPC細胞系(SUNE1、CNE2和HK1)和EBV陽性C666-1細胞系購自中國典型培養物保藏中心。所有NPC細胞均在含有10%胎牛血清RPMI-1640培養基中于5% CO2、37 ℃孵箱培養。

1.2 試劑和耗材

胎牛血清(Gibco),RPMI-1640培養基(HyClone),Lipofectamine 2000轉染試劑盒、PrimeScript RT Master Mix試劑盒(Invitrogen),引物[生工生物工程(上海)股份有限公司],磷酸酶抑制劑混合物(Sigma Chemical),RIPA裂解緩沖液(Beyotime Biotech),GAPDH、Vimentin、Snail、MMP2、MMP3和Erk1、Erk12抗體(Abcam),CCK-8(Solarbio)。

1.3 細胞轉染

細胞轉染前,將培養基更換為不含胎牛血清的培養基,轉染當天將細胞以1×105個/孔接種于6孔板中。miR-34c模擬物和NC siRNA均購自上海生工生物科技有限公司,分為miR-34c轉染EBV陽性NPC細胞組(miR-34c組)和EBV陽性NPC細胞組(EBV組)。細胞轉染嚴格按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行,轉染8 h后,將培養基更換新鮮培養基。

1.4 實時定量熒光PCR(qPCR)

使用RNAiso Plus試劑提取細胞中的總RNA,通過PrimeScript RT Master Mix試劑盒反轉錄為cDNA,GAPDH作為內參,每個樣本3個復孔。miR-34c引物,F:5′-AAG AAC CTG CTA GAC CCC TGG AG-3′;R:5′-TGC TTC CTC AGT CTT CTC ACT CAG-3′,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據制造商的說明,使用ABI PRISM 7000儀器對樣品進行分析,采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.5 Western blotting

使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中裂解細胞。將細胞以1.6×104g離心15 min取上清,SDS/PAGE電泳分離蛋白,轉移至硝酸纖維素(NC)膜。將膜在室溫下以5%脫脂牛奶-PBS溶液封閉1 h。隨后,待測蛋白與一抗4 ℃靜置過夜,NC膜用PBS溶液洗滌3次,加入山羊抗兔IgG(HRP偶聯物),室溫孵育1 h。最后,用PBS溶液洗滌NC膜,并通過電化學發光試劑顯色。并通過ImageJ 軟件(Image J 1.8.0,National Institute of Health)可視化目標條帶,以GAPDH為內參蛋白。

1.6 細胞活力測定

通過 CCK-8 測量細胞活力。NPC細胞(1×103個/孔)在96孔板中培養8、12、24和48 h,加入10 μL CCK-8溶液,繼續培養4 h。最后,通過酶標儀(SpectraMax iD5,Molecular Devices,USA)在450 nm處測定吸光度(OD)。

1.7 劃痕愈合試驗

將細胞接種到6孔板中,并在血清饑餓24 h后使用無菌200 μL槍頭創建人工傷口。然后用無血清培養基洗滌細胞以去除碎片和漂浮細胞。24 h后在倒置顯微鏡下拍照。使用Image J軟件打開圖片后,隨機劃取6至8條水平線,計算細胞劃痕面積均值。傷口愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積。

1.8 Transwell細胞侵襲試驗

對轉染細胞經胰蛋白酶酶解制備成細胞懸液,將2×104個細胞接種在200 μL含有1%胎牛血清DMEM溶液的鋪有8%基質凝膠的Transwell小室上室,下室加入500 μL含有10%胎牛血清的DMEM。細胞培養2 h后,除去上室中的液體,擦去上室壁上的細胞。Transwell小室另一側的細胞固定20 min,Transwell小室用結晶紫染色15 min,然后用PBS溶液沖洗。在200倍顯微鏡下拍照。對隨機選取的3個視野中的細胞進行計數,取平均值作為穿透膜的細胞數。實驗重復3次。

1.9 統計學方法

采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 EBV下調miR-34c在NPC細胞中的表達

EBV陰性NPC細胞系(SUNE1、CNE2和HK1)和EBV陽性NPC細胞系(C666-1)中miR-34c水平檢測顯示,miR-34c在C666-1細胞中低表達(P<0.05)(見表1)。 miR-34c模擬物表達載體轉染C666-1細胞后,采用qPCR測定轉染細胞中miR-34c的水平,結果顯示,miR-34c明顯上調(P<0.01)(見表2)。

表1 EBV陰性NPC細胞系和陽性NPC細胞系中miR-34c水平比較

表2 C666-1細胞中miR-34c的水平比較

2.2 EBV下調miR-34c促進C666-1細胞增殖、遷移和侵襲

CCK-8結果顯示,miR-34c組C666-1細胞在16、24、48 h的活力均明顯低于EBV組(P<0.01)(見表3)。劃痕試驗和Transwell試驗結果顯示,與miR-34c組比較,EBV組C666-1細胞遷移和侵襲能力均明顯增強(P<0.01)(見圖1、表3)。

表3 EBV下調miR-34c促進C666-1細胞增殖、遷移和侵襲能力

2.3 EBV下調miR-34c對C666-1細胞遷移相關蛋白水平的影響

Western blotting結果顯示,與miR-34c組比較,EBV組C666-1細胞遷移和侵襲相關蛋白Vimentin、Snail、MMP-2和MMP-3表達均明顯升高(P<0.01)(見圖2、表4)。

表4 EBV下調miR-34c促進C666-1細胞遷移和侵襲相關蛋白的表達

2.4 EBV下調miR-34c通過激活Erk1/2通路對C666-1細胞遷移作用

與miR-34c組比較,EBV組C666-1細胞Erk1、Erk2蛋白表達均明顯升高(P<0.01)(見圖3、表5)。

表5 Western blotting檢測Erk1、Erk2蛋白表達

3 討論

NPC是一種具有高度侵襲性和轉移性的惡性腫瘤[10]。增殖、轉移是惡性腫瘤的主要標志,是大多數癌癥相關死亡的原因,放療是NPC治療的主要手段[11],NPC局部控制的多模式治療取得長足進步和改善[12]。因此,更好地了解NPC增殖、轉移的分子模式對于開發NPC新治療策略至關重要[13]。在NPC病例中,觀察到miRNA表達失調,發現特定miRNA的異常表達與NPC細胞的增殖、轉移和侵襲有關[14]。EBV感染已被證明與多種淋巴和上皮惡性腫瘤密切相關,尤其是NPC[15]。研究[9]顯示,NPC組織標本檢測發現標本中miR-34c下調,miR-34c可能與NPC的發展有關[9]。本研究結果顯示,EBV下調miR-34c促進NPC增殖、遷移及侵襲,miR-34c可能是治療轉移性NPC的潛在治療靶點。

為了確認EBV下調miR-34c對促進NPC增殖轉移的作用及機制研究,研究了其對C666-1細胞的細胞活力、遷移和侵襲的影響。結果顯示,EBV下調miR-34c與NPC轉移的關系,表明EBV下調miR-34c通過促進NPC細胞的轉移促進了NPC的發展。異常增殖在癌變中起重要作用,NPC的主要生物學特征是局部侵襲和遠處轉移[16]。遷移通常是指體內任何定向的細胞運動,癌的侵襲意味著細胞穿透組織屏障[17]。癌細胞的遷移和侵襲允許從原發腫瘤部位脫離和癌癥在組織內擴散[18]。在本研究中,發現在C666-1細胞中miR-34c的過表達抑制了其活力、遷移和侵襲,也降低了細胞遷移和侵襲相關蛋白的表達水平。而EBV下調miR-34c促進了細胞的活力和遷移和侵襲,但也促進了細胞遷移和侵襲相關蛋白的表達水平。

Vimentin是腫瘤細胞遷移和侵襲過程中的一種細胞黏附分子,促進NPC細胞遷移和侵襲[19]。研究[20-21]顯示,Snail的高表達表明NPC具有高轉移潛力,MMP2的抑制與NPC細胞轉移的抑制有關。NPC腫瘤細胞中MMP3的分泌可刺激腫瘤細胞遷移[22]。本研究顯示,EBV下調miR-34c促進了Vimentin、Snail、MMP2和MMP3的表達,促進細胞遷移和侵襲,表明EBV下調miR-34c對NPC細胞遷移和侵襲的影響可能與遷移相關因子(Vimentin和Snail)和侵襲相關因子(MMP2和MMP3)有關,EBV下調miR-34c在調節NPC細胞的遷移和侵襲中起關鍵作用。

有證據[23]表明,Erk1/2信號通路對細胞轉移以及MMP的上調至關重要。研究[24]顯示,Erk1/2信號通路參與了EBV-miR-BART8-3p誘導的NPC轉移過程,EBV-miR-BART8-3p 的上調通過激活Erk1/2信號通路誘導 NPC轉移,而 EBV-miR-BART8-3p的下調具有相反的效果。此外,也有研究[25]表明EBV-miR-BART1激活MAPK-ERK1/2通路,激活β-catenin/Snail信號,促進NPC轉移。本研究結果顯示,Erk1/2信號通路與NPC細胞的遷移密切相關,Erk1/2信號通路傳導有助于EBV下調miR-34c誘導的NPC遷移。

綜上所述,miR-34c在EBV陽性 NPC細胞標本中下調,EBV下調miR-34c可增強NPC細胞增殖、侵襲和遷移能力及激活Erk1/2信號通路。