達比加群抗凝機理的光譜研究

龔夢潔, 海 瀅, 呂凱文, 顧洪斌, 祖莉莉*

1. 北京師范大學化學學院, 北京 100875

2. 戰略支援部隊特色醫學中心血管外科, 北京 100101

引 言

抗凝藥物在治療及預防血栓相關的疾病以及心臟和血管支架植入術后治療中有著十分廣泛的應用[1-5]。 傳統抗凝藥物非特異性靶向于凝血級聯的多個凝血因子, 主要包括肝素、 維生素K拮抗劑等。 這類抗凝藥在使用中需要頻繁監測凝血情況并實時調整用藥劑量, 以防止藥物導致的出血風險[1-2]。 近年來, 直接作用于特定凝血因子、 不需要常規凝血監測的口服抗凝血藥物的研究和應用受到了廣泛關注[2-4]。 其中, 達比加群酯(Dabigatran etexilate, DE)是目前新型口服抗凝藥中唯一一個直接特異性靶向于凝血級聯最后一環凝血酶(Thrombin, Thr)的藥物[1, 5]。 達比加群酯本身沒有藥理活性, 口服后可被迅速吸收, 在血漿和肝臟被羧酸酯酶催化水解為活性成分達比加群[5-6]。 達比加群藥物的口服抗凝效果得到了廣泛印證, 近年來被多個國家批準臨床使用[7]。 隨著藥物的使用, 研究達比加群與凝血酶在生理條件下的反應動力學是尋找達比加群特定逆轉劑以應對緊急手術或消化道出血等情況的迫切需要[1-2, 7]。

達比加群(Dabigatran, DAB)是一個三取代的苯并咪唑化合物, 分子包含苯甲脒和羧基兩個極性基團[圖1(a)]。 藥理研究顯示DAB可直接與凝血酶結合, 阻止其催化纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的活性, 從而達到抗凝血效果[1, 8]。 為了改善DAB的口服藥效, 將其極性基團酯化, 成為其前藥達比加群酯DE[5]。

圖1 (a) 達比加群, (b) 達比加群酯

然而, 極性基團在DAB抗凝過程中的作用機制仍存在很大爭議。 Hauel等研究了DAB與凝血酶復合物的X射線晶體結構[5], 在DAB的苯甲脒和凝血酶的Asp189之間觀察到一個鹽橋, 而DAB的羧基與凝血酶沒有氫鍵相互作用, 提出DAB與凝血酶的結合主要是通過疏水相互作用; 另一方面, 藥物試驗的結果顯示, 在DAB的苯并咪唑模板中引入羧基顯著提高了藥物在體內的活性和抗凝效果。 Naik等研究了DAB與人血清白蛋白、 核糖二氫煙酰胺脫氫酶等人體中其他蛋白及酶的相互作用[9-10], 提出極性基團提高DAB抗凝血能力的原因可能與增強了DAB與凝血酶結合的特異性有關。 Remko等的理論研究發現, 水對DAB和DE的幾何結構有很大影響[11-12]。 已有的研究結果表明： DAB和凝血酶在生理條件下相互作用的直接研究是探索疏水作用和極性作用在DAB與凝血酶結合過程中的動力學機理的迫切需要。

本工作中, 我們運用穩態和瞬態熒光光譜研究了DAB和凝血酶在模擬生理條件下(pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液中)的相互作用, 通過對DAB分子極性基團的酯化探究影響DAB抗凝效率的動力學因素; 基于凝血酶與DAB極性基團酯化前后的分子對接模擬, 分析兩者相互作用時分子構象變化對結合能的影響, 闡述DAB的抗凝機理; 通過DAB與牛血清白蛋白相互作用的對比實驗驗證DAB與凝血酶結合的特異性。

1 實驗部分

達比加群(≥98%)、 達比加群酯(>99%)、 達比加群乙酯(≥99%)購自上海麥克林生化科技有限公司。 凝血酶(1 000 U, 比活性>2 000 U·mg-1蛋白質)購自大連美倫生物科技有限公司。 牛血清白蛋白(>96%)購自上海生工生物科技有限公司。 本研究中使用的其他化學品購自北京化學試劑有限公司。 所有光譜研究均在10 mmol·L-1pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中進行, 實驗使用(Millipore, 18.2 MΩ·cm)超純水。

穩態光譜實驗在UV-2450光譜儀(Shimadzu Corporation)和FS5熒光光譜儀(Edinburgh Instruments)上進行。 瞬態熒光(時間分辨熒光)光譜實驗在Tempro-01光譜儀(Horiba Jobin Yvon)上完成, 使用NanoLED為激發光源及時間相關單光子計數檢測技術。 熒光壽命的擬合使用瞬態熒光光譜儀Tempro-01配套的數據擬合軟件DAS6, 采用的是重卷積分(reconvolution)處理模式, 衰減函數i(t)用燈譜函數P(t)去卷積分處理, 然后與實際測得的衰減曲線F(t)比較給出擬合系數χ2。 經過對F′(t)不斷地重復計算直至找到最佳的擬合情況及最小的擬合系數為止, 通過擬合系數χ2值和加權殘差的隨機性來判斷擬合質量。 在單指數模型不足以描述測量的衰變的情況下, 使用多指數模型來擬合衰變, 所用公式為

(1)

式(1)中,F是熒光強度,Ai是描述激發物種比率的每個分量的相對振幅,τi表示它們的壽命。

研究中, 采用分子對接模擬(molecular docking simulation)方法[13-14]通過空間匹配和能量匹配模擬凝血酶和DAB的相互識別和結合過程, 分析并解釋光譜實驗結果。 模擬時, 凝血酶(PDB ID： 1KTS)的結構來源于RCSB Protein Data Bank[15]。 DAB及其衍生物首先在Gaussian16軟件[16]中采用密度泛函理論B3LYP/6-31G*方法進行結構優化, 然后將分子的穩定結構導入AutoDock Tools 1.5.6中進行分子的電荷分布計算、 設置分子可旋轉的化學鍵等預處理[17]; 使用AutoDock Vina程序[18]預測凝血酶和DAB的結合構象和結合親和力; 最終, 采用BIOVIA Discovery Studio Visualizer軟件進行可視化分析。

2 結果與討論

2.1 達比加群DAB對凝血酶的熒光猝滅

DAB為極性分子, 其pKa1=4.24, pKa2=11.51[12], 在pH 7.4磷酸緩沖溶液中以兩性離子形式存在。 DAB吸收峰位于300 nm處[圖2(a)], 在390 nm有微弱的熒光發射。 當DAB的極性基團在DE中轉化為酯時, DE的吸收光譜為290～320 nm的寬峰, 熒光強度略有增強并紅移至410 nm[圖2(b)]。 相比之下, 凝血酶在280 nm激發時, 在330 nm處具有很強的熒光。

圖2 凝血酶、 達比加群、 達比加群酯在pH 7.4磷酸緩沖溶液中的(a)吸收光譜和(b)熒光光譜

當DAB與凝血酶相互作用時, 凝血酶330 nm的熒光強度減弱, 并且隨著DAB的濃度增加, 凝血酶的熒光猝滅更多, 直至DAB濃度達到3 μmol·L-1時趨近飽和[圖3(a)]。 此時, 穩態熒光呈現明顯的雙峰, 峰值分別在330和375 nm。 凝血酶+DAB混合樣品的時間分辨熒光光譜顯示, 隨著DAB濃度的增加, 330 nm熒光的壽命逐漸變短, 當DAB濃度達到3 μmol·L-1后不再繼續改變[圖3(b)]。 指數衰減分析表明(表1), 凝血酶本身在330 nm處的熒光由兩個壽命成分組成τ1=5.55 ns和τ2=2.26 ns。 當DAB與凝血酶相互作用時, 出現了第三個短壽命組分(τ3～700 ps), 并且τ3組分的占比隨著DAB濃度的增加而增加。 由于游離的DAB熒光微弱并且熒光壽命短于儀器的檢測極限(～50 ps), 可以推測混合物中的τ3組分來自一個新物質, 即凝血酶-DAB復合物。

表1 凝血酶(100 U·mL-1)以及凝血酶+DAB混合樣品在330 nm的熒光壽命(激發波長為280 nm)

圖3 凝血酶與不同濃度達比加群混合樣品的穩態和瞬態熒光光譜(λex=280 nm, 瞬態熒光檢測波長λem=330 nm)

不同濃度DAB和凝血酶混合樣品的Stern-Volmer圖顯示(圖4), 在DAB低濃度范圍內(0.5～3 μmol·L-1), 凝血酶的熒光被快速猝滅并且熒光強度和熒光壽命的變化相同, 表現出動態猝滅的特征。 當DAB的濃度達到3 μmol·L-1以上時, 混合樣品在330 nm的熒光壽命不會進一步改變, 但是仍然可以觀察到一個較慢的熒光強度猝滅, 此時DAB對凝血酶的熒光猝滅為靜態猝滅。 實驗現象表明, DAB與凝血酶能夠在低濃度時快速結合, 有效形成凝血酶-DAB復合物。 由于凝血酶分子在溶液中高度極化[12, 19-21], 其機制很可能是由于兩者之間的靜電相互作用。

圖4 達比加群和達比加群酯對凝血酶熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

2.2 達比加群酯DE對凝血酶熒光光譜的影響

當DE與凝血酶相互作用時, 凝血酶330nm的熒光強度隨著DE濃度的增大緩慢下降[圖5(a)]; 同時, 在400 nm處出現一個新的熒光發射峰。 當在310 nm激發凝血酶+DE的混合樣品時, 400 nm熒光峰強度更高(圖6)。 另一方面, 單獨的凝血酶在310 nm處不能被激發, 游離的DE在310 nm激發時的熒光強度遠遠低于混合樣品(圖6)。 因此, 混合樣品中400 nm的熒光必然來自一種新的成分, 即凝血酶和DE之間形成的復合物。 以310 nm激發凝血酶-DE復合物, 測定其在400 nm處熒光為單一短壽命～440 ps。

圖5 凝血酶與不同濃度達比加群酯作用時的穩態(a)和瞬態(b)熒光光譜(λex=280 nm, 瞬態熒光檢測波長λem=330 nm)

圖6 分別在280和310 nm激發凝血酶、 達比加群酯、 凝血酶+達比加群酯混合樣品的熒光光譜

凝血酶+DE混合樣品在330 nm處的時間分辨熒光光譜[圖5(b)]顯示, 盡管凝血酶的熒光強度隨著DE濃度的增加而降低, 但熒光壽命沒有改變, 可見DE對凝血酶的猝滅是單純的靜態猝滅。 凝血酶+DE的Stern-Volmer圖(圖4)表明凝血酶+DE混合樣品的熒光壽命保持恒定、 而熒光強度和DE濃度之間呈線性關系, 證實了DE對凝血酶的熒光猝滅是一種靜態猝滅。

DE是DAB極性基團酯化后的產物, 兩者的主要區別是電負性不同。 在pH 7.4緩沖溶液中, DAB為兩性離子, 其苯甲脒基帶正電荷、 羧基帶負電荷; DE是一個微弱堿性物質, 在pH 7.4緩沖溶液中主要以中性形式存在。 DAB和DE對凝血酶熒光不同猝滅現象的實驗結果支持我們關于DAB與凝血酶相互作用機理的推測, 即： DAB極性基團與溶液中高度極化的凝血酶分子之間的靜電相互作用是DAB和凝血酶快速有效結合的關鍵動力學因素。

2.3 羧酸酯化后達比加群苯甲脒基的作用研究

如果只將DAB的羧酸基團酯化可得到達比加群乙酯(Dabigatran ethyl ester, DAE)。 穩態和瞬態熒光光譜的研究發現, DAE與DAB對凝血酶熒光的猝滅現象非常接近, 即： 在低濃度時, DAE對凝血酶熒光表現快速的動態猝滅; 濃度大于3 μmol·L-1時, 熒光壽命不再改變, 只有靜態猝滅(圖7)。 這一實驗現象說明： DAB的苯甲脒基團是主導藥物與凝血酶有效結合的動力學因素, 羧酸基團的影響很小。 在pH 7.4條件下, DAE的苯甲脒基帶正電荷, 凝血酶帶負電荷[21], DAE對凝血酶的光譜研究進一步證實溶液中DAB與凝血酶分子間的靜電引力是兩者有效結合的動力學驅動。

圖7 達比加群乙酯與達比加群對凝血酶穩態(a)和瞬態(b)熒光光譜影響的比較(λex=280 nm, 瞬態熒光檢測波長λem=330 nm)

由于未能獲得達比加群苯甲脒基團單一酯化的產物達比加群己酯(Dabigatran hexyl ester, DAH), 我們通過分子對接模擬方法對上述實驗結論進一步驗證。

2.4 達比加群及其衍生物與凝血酶結合的分子對接模擬

凝血酶屬于血漿絲氨酸蛋白酶, 通過利用表面特征的活性位點裂縫和纖維蛋白原識別位點實現多重功能[21-23]。 活性位點區域包括三個不同的口袋[22]： 特異性口袋S1, 近端疏水口袋S2, 和遠端疏水口袋S3。 特異性口袋S1的底部有酸性氨基酸天冬氨酸殘基Asp189, 使得凝血酶活性口袋在溶液中富含負電性, 偏好具有堿性殘基的底物[21-23]。 活性位點狹縫被Tyr60A-Pro60B-Pro60C-Trp60D環(60插入環)封閉, 該序列為凝血酶特有且呈現相對剛性。 該環在活性位點處形成了一個疏水性的“蓋子”, 限制分子進入, 增強了凝血酶的底物特異性[23]。 DAB通過阻斷活性部位的通路實現對凝血酶的抑制作用。 在分子對接模擬過程中, DAB能夠自發對接到凝血酶的活性口袋, 表明DAB的結構具有非常強的凝血酶底物適配性。 如圖8所示, 達比加群的中心骨架1,2,5-三取代的苯并咪唑環恰好能夠“平躺”進入主要由Leu99、 His57、 Tyr60A、 Trp60D殘基側鏈構成的S2口袋中; 苯并咪唑上的取代基向兩側“舒展”, 苯甲脒基團伸入S1特異性口袋, 與S1口袋底部的天冬氨酸Asp189形成氫鍵; 吡啶環伸入疏水口袋S3, 羧酸基團與凝血酶分子沒有明確的相互作用。

圖8 達比加群與凝血酶的分子對接

當僅有羧基酯化時, DAE[圖9(c)]與DAB[圖9(a)]的構象在結構中心苯并咪唑環、 苯甲脒部分、 吡啶環部分基本一致; 但乙酯連接在手性N原子上的支鏈發生扭轉, 從而導致乙酯鏈向凝血酶外延伸。 這說明缺乏羧基極性不會從根本上影響達比加群與凝血酶的特異性結合。 但比較DAE(-9.1 kcal·mol-1)和DAB(-9.8 kcal·mol-1)與凝血酶結合的Gibbs自由能變化(表2), DAB與凝血酶的結合更穩定。

表2 達比加群及其酯化衍生物與凝血酶的結合能

圖9 達比加群DAB及其極性基團酯化后的衍生物與凝血酶的分子對接構象

當脒基酯化時, DAH[圖9(b)]與凝血酶的對接構象和DAB相比發生很大改變, 兩者的結合自由能也相差較大。 沒有苯甲脒基與凝血酶Asp189殘基之間的氫鍵作用, 更大體積的苯甲脒己酯導致分子不能很好的嵌入凝血酶的活性位點, DAH的苯并咪唑環在凝血酶活性位點的構象左右翻轉, 苯甲脒己酯朝向凝血酶外側。 這說明脒基的酯化直接影響藥物分子與凝血酶的特異性結合, 分子對接的結果驗證了光譜實驗的結論。

當DAB的兩個極性基團都被酯化時, 與DAH類似, DE分子的中心結構苯并咪唑環沒有能夠恰好“卡”進凝血酶活性位點處的S2口袋內[圖9(d)], 體積更大的苯甲脒己酯朝向凝血酶外側。 分子對接的結果表明, 中心結構苯并咪唑與凝血酶間的疏水作用雖然能將DE定位到凝血酶的活性部位, 但由于沒有苯甲脒基與S1口袋中酸性氨基酸殘基的靜電引導作用, 有效結合能力大大減弱。 DE與凝血酶結合的ΔG僅為-6.9 kcal·mol-1, 與DAB的-9.8 kcal·mol-1相差較大。

表2列出了DAB及其極性基團被酯化的三種衍生物DAE、 DAH、 DE與凝血酶分子對接的結合能, 對比它們與凝血酶結合時的分子構象, 結合熒光光譜的實驗結果分析, 可以得出： 苯甲脒基在DAB與凝血酶特異性結合過程中起到引導藥物分子以正確構象進入凝血酶活性口袋的作用; 疏水作用的結合是非特異性結合。

2.5 達比加群和達比加群酯對牛血清白蛋白熒光光譜的影響

在DAB和DE與牛血清白蛋白BSA相互作用的對比實驗中(圖10), 觀察到了DAB對BSA熒光強度的微弱靜態猝滅, 但沒有觀察到熒光壽命的變化, 即不存在動態猝滅現象; DAB極性基團酯化后的DE對BSA的熒光猝滅也是單一的靜態猝滅作用。 熒光光譜的實驗結果顯示DAB和DE與BSA之間的結合是非特異性結合。 在研究過程中, 我們也對比了DAB和DE對人血清白蛋白(HSA)熒光光譜的影響, 得到了和BSA基本一致的結果。 Simone等在DAB與HSA相互作用的研究中也觀察到了與本實驗結果相符的現象[9, 24]。

圖10 達比加群和達比加群酯對牛血清白蛋白熒光光譜的影響

此外, 在與BSA作用的熒光光譜實驗中, DAB對BSA熒光強度的猝滅弱于DE, 即DAB和BSA的結合能力比其極性基團酯化后的DE更弱[圖10(a, c)]。 Naik等[10]在DAB與HSA相互作用的研究中曾推測： 羧基可以增加DAB的親水性, 從而減少DAB與血漿中其他蛋白的疏水性非特異結合。 這一推測與我們在DAB和DE與BSA相互作用的熒光實驗中觀察到的現象一致。 然而, DAB和DAE與凝血酶相互作用的熒光光譜研究結果(圖7)也顯示, 在pH 7.4的磷酸緩沖溶液中, 羧基的引入在一定程度上減弱了DAB與凝血酶的結合。 如何修飾或改變羧酸基團以提高達比加群與凝血酶的結合能力以及藥物的生理活性還有待進一步探索。

3 結 論

利用穩態和瞬態熒光光譜方法研究了DAB與凝血酶在溶液中的相互作用, 研究發現： DAB對凝血酶的熒光既有動態猝滅也有靜態猝滅, 而DAB的極性基團酯化后對凝血酶的熒光只有靜態猝滅。 通過分析DAB及其酯化產物在凝血酶活性位點的構象和結合能, 提出DAB抑制凝血酶活性的機理為： DAB的苯甲脒基團與凝血酶之間的靜電導向作用是兩者形成有效復合物的關鍵驅動, 疏水作用和苯并咪唑的分子骨架與凝血酶活性位點的空間適配度是兩者穩定結合的基礎, 羧酸基團的取向對于兩者結合的穩定性有重要的輔助作用。 研究結果為口服抗凝藥達比加群的臨床應用和逆轉劑的研究提供了理論和實驗基礎。