多光譜法和分子對接模擬法研究茶堿和胃蛋白酶的相互作用

王曉霞, 馬力通, 孫吉盛, 聶智華, 賽華征, 成建國, 段建國

1. 內蒙古科技大學化學與化工學院, 內蒙古 包頭 014010

2. 生物煤化工綜合利用內蒙古內蒙古自治區工程研究中心, 內蒙古 包頭 014010

3. 清華大學生命科學學院, 北京 100084

引 言

茶堿(Theophyline, TPL)是黃嘌呤類衍生的化合物, 具有利尿、 強心和松弛支氣管平滑肌等功效。 胃蛋白酶(Pepsin, PEP)是一種促進食物中蛋白質消化的酶類, 將蛋白質分解為小的肽片段, 方便食物消化, 是人體內重要的消化類蛋白酶[1]。 研究藥物與蛋白質的相互作用機制及結合模式, 對于闡明藥物的代謝與運輸方式、 了解蛋白質的基本結構和作用都有著重要意義。 藥物被攝入人體后, 極大可能會與PEP發生反應, 因此探究藥物中的化學分子與PEP的作用機制, 對于藥物的發現、 藥物的設計、 提升藥物療效以及降低藥物副作用奠定了一定的理論基礎, 讓藥物設計更加高效、 可控。 為了更全面了解蛋白質轉運藥物的形式與代謝過程以及藥物與蛋白質相互作用的化學性質, 通過多光譜法和分子對接模擬技術探究TPL與PEP的相互作用機理。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計(L6S, 上海儀電分析儀器有限公司); 傅里葉變換紅外光譜儀(SPECTRUM 3, 鉑金埃爾默企業管理有限公司); 熒光分光光度計(F-7100, 日本日立); 圓二色光譜儀(Chirascan plus, 英國應用光物理公司)。

茶堿(TPL, 質量分數≥99%, 內蒙古佳合藥業有限公司); 胃蛋白酶(PEP, 純度≥99%, 合肥千盛生物有限公司); 檸檬酸(質量分數≥99%, 天津市恒興化學試劑制造有限公司); 檸檬酸鈉(質量分數≥99%, 天津市恒興化學試劑制造有限公司); 氯化鈉(NaCl, 質量分數≥99.4%, 天津化學試劑三廠)。

配制pH為2.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液, 1×10-4mol·L-1的TPL溶液和含有0.5 mol·L-1NaCl且pH 2.0的5×10-4mol·L-1的PEP溶液。

實驗室所有用到的試劑全部為分析純, 實驗所用的水均為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜的測定

取9支10 mL比色管, 分別加入1 mL濃度為5×10-4mol·L-1的PEP溶液, 再分別加入0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5和4.0 mL濃度為1×10-4mol·L-1的TPL溶液, 用蒸餾水定容至刻度線, 搖勻、 靜置20 min。 恒溫水浴鍋水浴20 min, 分別在298、 303和308 K用熒光光度計測定熒光光譜。 在熒光激發波長為280 nm, 發射波長在290～550 nm, 狹縫寬度均為5 nm, 掃描速度為1 200 nm·min-1條件下, 測量三個溫度下PEP的熒光光譜。

1.2.2 同步熒光光譜的測定

取9支10 mL比色管, 分別加入1 mL濃度為5×10-4mol·L-1的PEP溶液, 向其分別加入0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5和4.0 mL濃度為1×10-4mol·L-1的TPL溶液, 用蒸餾水定容至刻度線, 搖勻、 靜置20 min放入298 K下的恒溫水浴鍋水浴20 min, 待測。 參數設置Δλ=15 nm和Δλ=60 nm, 激發波長λex掃描范圍250～550 nm, 狹縫設置為5, 掃描速度1 200 nm·min-1, 測量并記錄PEP的熒光光譜。

1.2.3 三維熒光光譜的測定

取2支10 mL比色管, 一支加入1 mL濃度為5×10-4mol·L-1的PEP溶液, 用蒸餾水定容至刻度線; 另一支比色管加入1.0 mL濃度為5×10-4mol·L-1的PEP溶液, 2.0 mL濃度為1×10-4mol·L-1的TPL溶液, 蒸餾水定容至刻度線, 搖勻、 靜置20 min。 放入298 K下的恒溫振蕩器下加熱20 min, 待測。 參數設置為激發波長λex范圍200～500 nm, 發射波長λem范圍200～500 nm, 狹縫設置為5, 掃描速度2 400 nm·min-1, 測量三維熒光光譜。

1.2.4 紫外光譜的測定

取9支10 mL比色管, 分別加入2 mL濃度為1×10-3mol·L-1的PEP溶液, 在分別加入0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5和4.0 mL濃度為1×10-4mol·L-1的TPL溶液, 用蒸餾水定容至刻度線, 搖勻、 靜置20 min后。 放入298 K下的恒溫振蕩器下加熱20 min, 待測。 設置紫外光譜儀參數, 掃描范圍200～400 nm, 使用石英比色皿, 在298 K時進行紫外光譜測量。

1.2.5 結合距離的測定

在三支比色管, 分別配制成PEP溶液、 TPL溶液與PEP-TPL混合溶液, 濃度全部為1.0×10-5mol·L-1, 第三個混合體系中TPL與PEP濃度比1∶1。 298 K恒溫水浴鍋靜置20 min。 對TPL溶液進行紫外測定, PEP溶液與PEP-TPL溶液進行熒光測定。 熒光光度計參數設置為激發波長λex=280 nm, 發射波長λem范圍290～550 nm, 狹縫設置為5, 掃描速度1 200 nm·min-1。 紫外可見分光光度計參數設置為掃描200～500 nm波長范圍。

1.2.6 紅外光譜的測定

稱取一定質量的PEP及TPL固體干燥粉末, 按照PEP與TPL的質量比為1∶0及2∶1混合, 放入研缽中充分混合并研磨5 min, 準確稱量0.100 0 g KBr后加入研缽充分研磨, 壓片處理, 設定掃描范圍4 500～500 cm-1, 進行紅外光譜掃描。

1.2.7 圓二色光譜的測定

取兩支比色管, 一支取一定濃度的PEP溶液; 另一支取同樣濃度的PEP與一定濃度的TPL混合液, 得到PEP與TPL濃度比為1∶3的溶液待測。 設置圓二色譜儀器參數, 設定帶寬Bandwidth為1.0 nm, 設定光譜掃描范圍180～260 nm, 設置單個數據點的采樣時間Time-per-point為0.5 s, 以配制好的pH 2.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液為參比液, 分別記錄PEP與TPL-PEP體系的圓二色光譜數據。

1.2.8 分子對接模擬技術

運用ChemDraw 18.0軟件作TPL結構圖, 在蛋白質數據庫中RCSB Protein Data Bank中找到PEP的晶體結構, 利用網頁程序Z-Dock(http：//zdock.umassmed.edu)進行結合位點的選擇和綁定點殘留的選擇, 利用分子對接軟件Accelrys Discovery Studio3.5采用CDOCKER模塊進行分子對接模擬。

2 結果與討論

2.1 TPL與PEP的熒光猝滅光譜

PEP中具有三種可以發射熒光的芳香氨基酸, 分別是色氨酸、 苯丙氨酸與酪氨酸。 其產生的熒光強度可以用于檢測PEP與藥物作用的相關研究[2]。 圖1(a—c)分別是298、 303和308 K溫度時, 相同濃度的PEP隨著TPL濃度增大熒光強度的變化情況。 由圖1(a)可知, 在激發波長為280 nm, 發射波長為342 nm時PEP產生了熒光發射峰。 從圖1可以看出, 隨著TPL濃度逐漸增大, PEP的熒光強度呈規律性下降趨勢, 其發射峰位置沒有明顯變化, 由此可見, 兩者發生了反應, TPL對PEP的熒光產生猝滅作用。

圖1 三個溫度下TPL-PEP體系熒光光譜

本實驗采用Stern-Volmer方程[3]判斷TPL對PEP的猝滅作用類型, 方程如式(1)

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式(1)中,F0為未加入猝滅劑(TPL)時PEP的熒光強度,F為加入猝滅劑(TPL)后TPL-PEP體系的熒光強度,Ksv為Stern-Volmer動態猝滅常數, [Q]是猝滅劑(TPL)的實際濃度,Kq是動態熒光猝滅速率常數, 各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態熒光猝滅速率常數約為2.0×1010L·(mol·s)-1,τ0為沒有猝滅劑下生物大分子的平均壽命為10-8s。

對所研究TPL在298、 303和308 K溫度下對PEP熒光強度的影響, 以F0/F值為縱坐標, [Q]為橫坐標作圖, 得到Stern-Volmer曲線, 見圖2。 由圖2得到動態猝滅常數Ksv與動態熒光猝滅速率常數Kq于表1。 由表1得知Stern-Volmer動態熒光猝滅速率常數Kq遠大于最大動態熒光猝滅速率常數2.0×1010L·(mol·s)-1, 證明TPL通過靜態猝滅的方式猝滅PEP的熒光。 通過表1可知不同溫度下的猝滅常數Ksv(L·mol-1)： 2.221×104(298 K), 2.057×104(303 K), 2.018×104(308 K)。 隨著溫度升高, TPL-PEP體系中熒光猝滅常數Ksv數值減小, 進一步證明TPL是通過靜態猝滅方式減弱PEP的熒光強度[4]。

表1 Stern-Volmer線性方程和相關系數

圖2 三個溫度下TPL-PEP的熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

2.2 TPL與PEP的結合常數與結合位點數

由于TPL是通過靜態猝滅的形式猝滅PEP的熒光, 可通過運算靜態猝滅雙對數公式[5]得到TPL與PEP的結合位點數與結合常數。

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式(2)中,KA是TPL與PEP的結合常數,n是TPL與PEP的結合位點數。 以lg[(F0-F)/F]為縱坐標, lg[Q]為橫坐標作圖(見圖3), 對所得直線進行擬合, 得到的斜率與截距分別為TPL與PEP的結合常數與結合位點數, 見表1。 由表1可知, 在298 K時TPL-PEP體系的結合常數KA=3.627×104L·mol-1; 結合位點數n=1.051。 在303 K時,KA=2.220×104L·mol-1;n=1.044。 在308 K時,KA=1.321×104L·mol-1;n=1.300, 結合常數的數量級都在104, 說明TPL與PEP形成的復合物較穩定; 結合位點數都接近1, 說明結合產生的復合物為1∶1型。KA(298 K)>KA(303 K)>KA(308K), TPL-PEP體系結合常數KA與溫度負相關, 與猝滅常數Ksv的規律一致, 進一步證明TPL通過靜態猝滅方式減弱PEP的熒光強度。

圖3 三個溫度下lg[(F0-F)/F]-lg[Q]圖

2.3 TPL與PEP的結合距離

根據F?rster’s偶極-偶極非輻射能量轉移理論, 能量供體PEP與能量受體TPL之間的最大結合距離小于7 nm, 并且PEP的熒光發射光譜與TPL的紫外吸收光譜有重疊部分時, PEP分子與TPL分子必然會產生非輻射能量轉移, 從而使TPL猝滅了PEP的熒光。

(3)

(4)

(5)

式(3)—式(5)中,r為PEP與TPL的結合距離;R0為能量轉移效率E為50%時的臨界距離;k2為空間取向因子, 取供能體與受能體各項隨機分布的平均值2/3;φ為PEP的熒光量子產率一般取蛋白質中色氨酸量子產率的0.15[6];n為介質折射指數, 通常取有機物和水的平均值1.36;J為PEP的熒光光譜和TPL的紫外光譜的重疊積分;FD(λ)為PEP在把波長為λ時的熒光強度;εA(λ)為TPL在波長為λ時的摩爾吸收系數。

圖4為PEP和TPL在濃度比為1∶1時298 K下PEP的熒光曲線與TPL的紫外吸收曲線重疊圖, 由式(3)—式(5)求得PEP與YPL重疊積分J=2.144×10-13cm3·(mol·L-1)-1,E=45.54%,R0=4.203 nm,r=4.330 nm。 0.5R0

圖4 PEP的熒光光譜(a)與TPL的紫外吸收光譜(b)重疊圖

2.4 TPL與PEP相互作用的熱力學參數和主要作用力

TPL與PEP結合反應的作用力可以通過Ross理論[7]判斷： 當ΔH>0, ΔS>0時, 作用力為疏水作用力; ΔH<0, ΔS<0時作用力為氫鍵與范德華力; ΔH<0, ΔS>0時, 作用力為靜電作用力。

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(6)

lnK=-ΔH/RT+ΔS/R

(7)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKA

(8)

式(6)—式(8)中,K為TPL與PEP的結合常數; ΔH為TPL與PEP的焓變; ΔS為TPL與PEP的熵變; ΔG為TPL與PEP的吉布斯自由能;T為TPL與PEP反應溫度;R為氣體常數, 取8.314 J·(mol·K)-1。 根據Van’t Hoff公式, 可以計算出298、 303和308 K下的熱力學參數。 焓變ΔH=-81.59 kJ·mol-1, 熵變ΔS=-186 J·(mol·K)-1, 吉布斯自由能ΔG=-26.17 kJ·mol-1(298 K)、 ΔG=-25.24 kJ·mol-1(303 K)、 ΔG=-24.31 kJ·mol-1(308 K)。 可知ΔH<0, ΔS<0, 可推測TPL和PEP主要的作用力為氫鍵和范德華力, ΔG<0說明TPL和PEP的靜態猝滅為自發、 放熱(ΔH<0)的過程。

2.5 TPL與PEP的分子對接模擬

分子對接技術可使蛋白質受體與藥物配體間快速對接并研究兩者之間的相互作用力。 采用分子對接模擬技術探究TPL配體與PEP受體的作用力類型、 作用距離以及對接模式, 通過網頁程序Z-DOCK3.0.2模擬出TPL與PEP的分子對接模擬圖, 在運用Discovery Studio 2016 Client軟件分析出兩者結合的相關數據。 見圖5(a)、 (b)和(c)。

圖5 TPL和PEP結合的分子對接結構模型圖

由圖5(a)、 (b)可知, PEP的三維結構呈心形, TPL分子位于PEP的表面活性口袋中, 為了更加簡單、 清晰地觀察到TPL與PEP的結合部位所處的微環境, 作出TPL周圍氨基酸殘基2D/3D示意圖, 見圖5(c)。 由圖5(c)可知TPL周圍氨基酸殘基有GLU13、 VAL30、 TRP39、 TYR75、 GLY76、 THR77、 GLY78、 PHE111、 LEU112、 PHE117、 ILE120、 GLY217。 TPL與其中的氨基酸殘基THR77、 GLY217形成氫鍵(Conventional hydrogen bond), 鍵長為4.58和4.51 ?, 與氨基酸殘基GLY217形成碳氫鍵(Carbon hydrogen bond); 與氨基酸殘基GLU13、 VAL30、 TRP39、 GLY76、 GLY78、 PHE117之間的作用力為范德華力(Van der Waals); 與氨基酸殘基TYR75、 LEU112、 ILE120、 PHE111之間存在疏水作用力, 鍵長為3.85、 5.98、 5.63和6.22 ?, 以Pi-Alkyl、 Pi-Sigma、 Pi-Pi T-shaped形式存在[8]。 表明TPL與PEP間結合作用力較多且結合穩定, 兩者之間的作用力主要是氫鍵與范德華力, 進一步證明TPL使PEP的二級結構發生改變。

2.6 TPL對PEP的二級結構的影響

2.6.1 TPL與PEP作用的紫外光譜分析

紫外吸收測量是探索結構變化和理解復合物的形成的一種容易操作而可觀的表征, 可以探究藥物小分子對蛋白質大分子的二級結構的影響。 本實驗做了TPL-PEP混合體系的紫外光譜, 見圖6。 由圖6可知, PEP在274 nm附近有最大吸收峰, 隨著TPL加入且濃度逐漸的增大, PEP吸收峰的峰值明顯增大, 最大吸收波長從274 nm移動至272 nm, 發生藍移, 藍移了2 nm。 表明兩者之間能量躍遷方式為n—π*躍遷, 證明TPL與PEP之間發生了反應, TPL影響了PEP的二級結構。 假設TPL通過動態猝滅的機制來猝滅PEP的熒光強度, 那么TPL不會改變PEP的吸收光譜, 但是圖6中PEP峰值變化明顯, 進一步證明TPL對PEP猝滅機制不是動態猝滅, 而是靜態猝滅[9]。

圖6 TPL與PEP相互作用的紫外光譜圖

2.6.2 TPL與PEP體系同步熒光圖譜分析

同步熒光可以提供蛋白質與藥物結合后發色團附近微環境的變化情況, 最大發射波長的所有變化都對應著發色團附近極性的改變。 通常情況下, Δλ=15 nm和Δλ=60 nm同步熒光光譜能夠分別呈現蛋白質中酪氨酸殘基和色氨酸殘基特征熒光, 可用于研究藥物分子對PEP微環境和構象的影響。 TPL-PEP體系的同步熒光光譜見圖7(a)、 (b), 由圖7可知, 隨著TPL濃度的升高, PEP的同步熒光峰值有下降趨勢。 圖7(a)中的發射峰位置基本不變, 發射峰的峰型基本不變, 并且TPL對PEP中酪氨酸的熒光猝滅程度小; 圖7(b)中發射峰峰型呈現規律性變化, TPL對PEP中色氨酸的熒光猝滅程度大, 發射峰峰位從279.6 nm移動到284.8 nm, 紅移了5.2 nm, 猝滅程度大。 表明TPL與PEP間形成了復合物, PEP構象產生改變, 使酪氨酸殘基與色氨酸殘基附近微環境改變, 極性增大, 親水性增強, 疏水性減弱; 色氨酸殘基的熒光猝滅程度強于酪氨酸殘基, 表明TPL與PEP結合時主要集中在色氨酸的殘基上。

圖7 TPL-PEP溶液同步熒光光譜圖

2.6.3 TPL與PEP構象變化影響的三維熒光光圖譜分析

三維熒光光譜立體圖可以詳細展現出被測藥品多肽骨架結構的變化情況, 為研究蛋白質結構與組分分布變化提供了依據。 通過三維熒光光譜法運用光譜儀對PEP加入TPL前后的數據, 以處理出的熒光強度數據F為Z軸; 激發波長λex為X軸; 發射波長λem為Y軸, 作PEP、 TPL-PEP混合體系的三維熒光光譜圖及等高線圖, 見圖8(a)、 (b)。 三維熒光光譜圖有兩類峰, 一種是“駝峰”狀的熒光峰(如PEAK 1、 PEAK 2), 峰1代表了色氨酸殘基與酪氨酸殘基的熒光光譜特征, 峰2代表了肽鏈骨架結構, 峰值強度與蛋白質的二級結構聯系緊密; 另一種是“山脊”狀的瑞利散射峰： PEAK a(λex=λem)、 PEAK b(2λex=λem)。

圖8 PEP、 TPL-PEP溶液的三維熒光光譜圖及等高線圖

加入TPL后, PEP熒光峰與瑞利散射峰的位置與峰形基本沒有變化。 由表2可知, 加入TPL前后, PEP的瑞利散射峰PEAK a、 PEAK b的熒光強度減弱趨勢較明顯。 PEAK 1的熒光強度峰值(λex/λem,F)從(280/341, 408.4)改變到(280/343, 296.4), PEAK 2的熒光強度峰值(λex/λem,F)從(225/340, 396.3)改變到(225/343, 329.7), PEAK 1的最大發射波長從341 nm移動至343nm, 峰位紅移了2 nm, 說明TPL使PEP中的色氨酸殘基與酪氨酸殘基周圍微環境發生改變, 極性增大, 親水性增強, 疏水性減弱; PEAK 2的最大發射波長從340 nm移動至343 nm, 峰位紅移了3 nm, 說明TPL改變了PEP的肽鏈骨架結構。 通過以上數據及分析結果可知, TPL與PEP表面結合后產生解聚反應, 使蛋白酶的分布更加分散, 蛋白質粒徑變小, 從而使PEP熒光強度降低, 進一步說明TPL對PEP的二級結構產生了影響。

表2 三維熒光光譜特征參數

2.6.4 TPL與PEP作用的圓二色譜圖分析

通過掃描PEP與TPL-PEP混合體系的圓二色譜可以更加深入地研究TPL對PEP二級結構的影響[10-11], 見圖9, 通過圖9可知, PEP在190 nm附近有一個負峰, 這是β-折疊(β-sheet)的特征吸收峰, 這個負峰強度的變化可以反映PEP中β-折疊數量的變化, 將所測的圓二色譜數據導入CDNN軟件可得到PEP與TPL-PEP的二級結構含量數據, 由數據可知PEP的二級結構主要為β-折疊, 隨著TPL的加入且當PEP與TPL的濃度比為1∶3時, PEP中β-折疊的占比從50.2%下降至48.8%; α-螺旋(α-Helix)結構的占比從8.1%上升到8.4%; β-轉角(β-turn)的占比從18.3%上升到18.7%; 無規則結構的占比從29.1%上升到29.2%。 上述數據表明TPL在與PEP反應的過程中改變了PEP周圍的環境造成了PEP二級結構改變。

圖9 TPL與PEP作用的圓二色譜圖

3.6.5 TPL與PEP作用的傅里葉紅外光譜分析

圖10 TPL與PEP的紅外光譜圖

3 結 論

在模擬生理條件時, 298、 303和308 K三種溫度下TPL對PEP具有熒光猝滅作用, 形式為靜態猝滅。 根據F?rster’s偶極-偶極非輻射能量轉移理論得知結合距離r=4.330 nm<7 nm, 表明PEP與TPL間會發生非輻射能量轉移。 分子對接模擬表明TPL分子位于PEP的表面活性口袋中, 兩者之間結合作用力較多且結合穩定, 作用力主要是氫鍵與范德華力, 進一步證明TPL使PEP的二級結構發生改變。 三維熒光光譜、 同步熒光圖譜、 紫外吸收光譜、 圓二色譜、 紅外光譜表明TPL使PEP中的色氨酸殘基周圍微環境發生改變, 極性增大, 親水性增強, 疏水性減弱, 說明TPL對PEP的二級結構產生了影響。