芥子堿硫氰酸鹽提高卵巢癌SKOV3細胞對吉西他濱敏感性的研究*

牛慶玲,王雅莉,王 卓

(鄭州市中心醫院婦產科, 河南 鄭州 450007)

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一,由于早期無明顯臨床癥狀,發現時多已進展為晚期[1]。初始治療后患者3年累積復發率仍高達70%,5年總生存率不足50%,化療耐藥是該病高復發率和高病死率的根本原因[2]。吉西他濱(gemcitabine,GEM)是阿糖胞苷類似物,臨床不良反應少,可延長卵巢癌復發患者的無進展生存期,改善預后[3]。芥子堿硫氰酸鹽是提取自萊菔子的生物堿,具有抗炎、抗氧化和抗血管生成作用[4]。近年來有實驗[5]表明,其可抑制膠質瘤T98細胞增殖、遷移及侵襲,同時誘導細胞凋亡,表現出良好的抗腫瘤功效。但目前關于其對腫瘤細胞化療增敏的影響鮮有報道,且缺乏相應機制研究。本研究通過體外培養卵巢癌SKOV3吉西他濱耐藥細胞(SKOV3/GEM細胞),觀察芥子堿硫氰酸鹽對SKOV3細胞GEM敏感性的影響,探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人卵巢癌SKOV3細胞株,購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑與儀器

芥子堿硫氰酸鹽,純度98%,北京索萊寶科技有限公司產品,批號SS9190;表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)/磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)激動劑NSC 228155,上海滬崢生物科技有限公司產品,批號113104-25-9;GEM,仁合熙德隆藥業有限公司產品,批號022306302;兔抗人血管內皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、Eph受體酪氨酸激酶A2(Ephreceptor tyrosine kinase A2,EphA2)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、磷酸化EGFR(phosphorylated EGFR,p-EGFR)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt (phospho-Akt,p-Akt)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化mTOR (phospho-mTOR,p-mTOR)一抗,均為美國艾博抗公司產品,批號依次為ab205336、ab212069、ab52894、ab32086、ab38449、ab8805、ab134903、ab278621。Epoch酶標儀,美國伯騰儀器有限公司產品;Cyto FLEX2流式細胞儀,美國貝克曼庫爾特有限公司產品;BX53光學顯微鏡,日本奧林巴斯公司產品。

1.3 SKOV3/GEM細胞的培養與分組

按照參考文獻[6-7]進行。取人卵巢癌SKOV3細胞株,溫水浴解凍,置于RPMI-1640培養基(100 mL/L 胎牛血清,青霉素和鏈霉素各100 U/mL),在37 ℃、50 mL/L CO2條件下培育,待細胞融合至80%,胰酶消化、傳代;取對數期細胞培育耐藥細胞株。采用濃度遞增法建立SKOV3細胞吉西他濱耐藥株SKOV3/GEM,培養液內加入質量分數5 mg/L的GEM,培養48 h;棄培養基,更換為完全培養基使細胞恢復生長,再次加入質量分數10 mg/L的GEM;反復提高藥物質量分數(5、10、20、40 mg/L)換液傳代,直至細胞可穩定生長于RPMI-1640培養液中(GEM最終質量分數40 mg/L),后續實驗開始前一周更換為完全培養基正常培養。

取對數期SKOV3/GEM細胞,清洗,重懸,以1×105個/mL接種于96孔板,待細胞融合至80%,隨機分為耐藥組、干預組、激動劑組、聯合組。耐藥組以完全培養基常規培養,干預組培養基加入芥子堿硫氰酸鹽(終濃度100 μmol/L),激動劑組培養基加入NSC228155(終濃度100 μmol/L),聯合組培養基加入芥子堿硫氰酸鹽(100 μmol/L)和NSC 228155(100 μmol/L)。各組均干預48 h用于后續實驗。

1.4 檢測指標

1.4.1 SKOV3、SKOV3/GEM細胞的GEM敏感性

采用CCK-8法檢測不同質量分數GEM下SKOV3、SKOV3/GEM細胞增殖抑制率。分別取對數期SKOV3、SKOV3/GEM細胞,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)清洗,胰酶消化,重懸,以1×105個/mL接種于96孔板,待細胞融合至80%,每孔加入含GEM(質量分數分別是10、50、100、200、400 mg/L)RPMI-1640培養液,48 h后加入10 μL CCK-8溶液,4 h后吸棄上清,加入二甲基亞砜振蕩5 min,采用酶標儀檢測450 nm處吸光度值,計算增殖抑制率和半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。增殖抑制率(%)=(1-各質量分數GEM孔吸光度值/空白孔吸光度值)×100%

1.4.2 各組SKOV3/GEM細胞增殖抑制率

按1.3項下分組。采用CCK-8法檢測。取干預后的各組細胞,洗滌,重懸,接種,加入終濃度為400 mg/L的GEM,培養48 h后,加入CCK-8試劑繼續孵育4 h,經酶標儀檢測450 nm處吸光度值,計算各組細胞增殖抑制率。

1.4.3 SKOV3/GEM細胞凋亡率

取干預后的各組SKOV3/GEM細胞,清洗,重懸后,以1×105個/mL接種于6孔板,加入終濃度400 mg/L的GEM,常規培養48 h,PBS清洗,低溫離心機離心(半徑10 cm,2 500 r/min)8 min,棄上清,結合緩沖液重懸細胞,再加入異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V、碘化丙啶各5 μL,經流式細胞儀分析細胞凋亡情況,計算各組細胞凋亡率。

1.4.4 細胞血管生成能力

通過血管生成擬態實驗檢測。取Matrigel 膠,4 ℃過夜解凍,與RPMI-1640培養液融合后鋪于96孔板,取干預后的各組SKOV3/GEM細胞,胰酶消化、重懸,以1×104個/mL接種至該孔板,培養箱標準條件培養24 h,光鏡下選取5個不相鄰視野拍照,觀察各組細胞血管生成情況。

1.4.5 VE-cadherin、EphA2蛋白表達量

取干預后的各組SKOV3/GEM細胞,PBS清洗后移至離心管,加入RIPA裂解液,以10 cm離心半徑、10 000 r/min轉速低溫離心15 min,經BCA試劑盒測量總蛋白并定量。取40 μg待測蛋白,混合4倍體積上樣緩沖液,沸水浴變性蛋白,離心取上清,加載至聚丙烯酰胺凝膠,恒壓下電泳分離并轉至PVDF膜,50 mL /L脫脂牛奶封閉2 h,加入兔抗人VE-cadherin、EphA2一抗(1∶500),4 ℃冷藏過夜,TBST緩沖液清洗,加入二抗(1∶2 000),搖床孵育2 h,TBST緩沖液清洗,增強型化學發光試劑發光,暗室顯影,采用成像分析儀分析蛋白條帶灰度值。以VE-cadherin、EphA2蛋白灰度值與內參GAPDH的灰度值的比值代表該蛋白相對表達量。

1.4.6 EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達量

取干預后的各組SKOV3/GEM細胞,清洗,裂解,定量,變性,電泳分離,轉膜,封閉,方法同1.4.5;加入兔抗人EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR一抗(1∶500),4 ℃冷藏過夜,TBST緩沖液清洗,加入二抗(1∶2 000),搖床孵育2 h,TBST緩沖液清洗,電化學發光液發光,暗室顯影,經成像分析儀分析蛋白條帶灰度值,以EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白灰度值與內參GAPDH的灰度值的比值代表該蛋白相對表達量。計算p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 不同質量分數GEM下SKOV3、SKOV3/GEM細胞增殖抑制率對比

不同質量分數GEM下,SKOV3、SKOV3/GEM細胞增殖抑制率對比,差異均有統計學意義(P<0.01),且SKOV3/GEM細胞增殖抑制率低于SKOV3細胞(P<0.01)。見表1。SKOV3/GEM細胞IC50為(210.59±15.24)mg/L,高于SKOV3細胞(78.57±9.15)mg/L,表明耐藥株SKOV3/GEM建立成功。

表1 不同質量分數GEM下SKOV3、SKOV3GEM細胞增殖抑制率對比

2.2 各組SKOV3/GEM細胞增殖抑制率對比

與耐藥組對比,干預組KOV3/GEM細胞增殖抑制率升高(P<0.01),激動劑組KOV3/GEM增殖抑制率降低(P<0.01);與干預組對比,聯合組增殖抑制率降低(P<0.01);與激動劑組對比,聯合組增殖抑制率升高(P<0.01)。結果表明芥子堿硫氰酸鹽可抑制SKOV3/GEM細胞增殖。見表2。

表2 各組KOV3/GEM細胞增殖抑制率對比

2.3 各組SKOV3/GEM細胞凋亡率對比

與耐藥組對比,干預組SKOV3/GEM細胞凋亡率升高(P<0.01),激動劑組凋亡率降低(P<0.01);與干預組對比,聯合組凋亡率降低(P<0.01);與激動劑組對比,聯合組凋亡率升高(P<0.01)。結果表明芥子堿硫氰酸鹽可促進SKOV3/GEM細胞凋亡。見表3。

表3 各組SKOV3/GEM細胞凋亡率對比

2.4 各組細胞血管生成能力對比

與耐藥組對比,干預組管狀結構數量/視野減少(P<0.01),激動劑組管狀結構數量/視野增加(P<0.01);與干預組對比,聯合組管狀結構數量/視野增加(P<0.01);與激動劑組對比,聯合組管狀結構數量/視野減少(P<0.01)。見表4、圖1。結果表明芥子堿硫氰酸鹽可降低細胞血管生成能力。

圖1 血管生成擬態實驗檢測細胞新生管狀結構數量(×200,標尺50 μm)

表4 各組細胞血管生成能力對比 個,

2.5 各組SKOV3/GEM細胞VE-cadherin、EphA2蛋白表達對比

與耐藥組對比,干預組VE-cadherin、EphA2蛋白表達降低(P<0.01),激動劑組VE-cadherin、EphA2蛋白表達升高(P<0.01);與干預組對比,聯合組VE-cadherin、EphA2蛋白表達升高(P<0.01);與激動劑組對比,聯合組VE-cadherin、EphA2蛋白表達降低(P<0.01)。結果表明芥子堿硫氰酸鹽通過抑制EGFR/PI3K通路抑制細胞血管生成。見表5、圖2。

圖2 細胞VE-cadherin、EphA2蛋白表達量

表5 各組SKOV3/GEM細胞VE-cadherin、EphA2蛋白表達對比

2.6 各組KOV3/GEM細胞p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR對比

與耐藥組對比,干預組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P<0.01),激動劑組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.01);與干預組對比,聯合組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR升高(P<0.01);與激動劑組對比,聯合組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低(P<0.01)。結果表明芥子堿硫氰酸鹽對細胞的影響通過抑制EGFR/PI3K通路實現。見表6、圖3。

圖3 細胞p-EGFR、EGFR、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表達量

表6 各組KOV3/GEM細胞p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR對比

3 討 論

卵巢癌多發于卵巢上皮組織,可直接浸潤至鄰近組織器官,累及輸卵管、膀胱、子宮及直腸,晚期則可通過血液轉移至全身各處[8]。因當前缺乏準確篩查早期卵巢癌的有效工具,加之其無癥狀發展的特點,多數患者確診時已進展至晚期,治療后復發現象嚴重,探索提升復發患者化療效果的新輔助藥物勢在必行。GEM是一種周期特異性抗癌藥物,進入細胞后可生成競爭性底物摻入DNA,從而抑制DNA復制,誘導細胞死亡[9]。其耐藥機制尚未完全闡明,多認為與糖酵解活化、凋亡抑制蛋白升高、DNA損傷修復、信號通路改變及血管新生加劇有關,其中腫瘤血管生成被認為是其重要機制之一,可激活休眠腫瘤細胞,促進腫瘤微環境建立,提升惡化潛能,從而降低藥物敏感性[10]。因此,尋找高效抑制血管新生的藥物是降低卵巢癌化療耐藥、提升治療效果的關鍵。

VE-cadherin、EphA2是血管新生相關蛋白,其含量與血管生成擬態形成呈正相關,可代表腫瘤細胞血管生成能力[11]。卵巢癌屬中醫學“積聚”等范疇,主要病機為脾腎虧虛導致瘀阻于內,氣滯血瘀,治療可從活血化瘀、健脾通絡方面著手[12]。萊菔子性平,味辛、甘,歸脾、胃經,可健脾理氣,導滯通絡,具有抗菌、抗腫瘤、促進胃腸行氣等作用[13]。萊菔子提取物芥子堿硫氰酸鹽可抑制凝血并平衡纖維蛋白溶解,抑制纖維蛋白生成與沉積,從而抑制血管新生[14]。孫遠梅等[15]研究認為,芥子堿硫氰酸鹽可抑制人肝癌HepG2細胞化療藥物外排并降低多耐藥蛋白表達,從而逆轉化療耐藥,提示其或可成為腫瘤細胞潛在增敏藥物。本研究結果顯示,與耐藥組對比,干預組增殖抑制率、凋亡率升高,血管生成能力、VE-cadherin、EphA2蛋白表達降低,提示芥子堿硫氰酸鹽可逆轉卵巢癌細胞GEM耐藥,抑制血管生成,促進細胞凋亡。

EGFR是受體酪氨酸激酶家族成員,是一種細胞生理信號受體蛋白,與配體結合后發生二聚化反應磷酸化,與下游蛋白PI3K調節亞基p85結合,使其釋放出催化亞基p110,與其他因子共同作用招募效應蛋白Akt至細胞內膜,Akt位點磷酸化后激活蛋白激酶mTOR,p-mTOR直接作用于底物蛋白,發揮促增殖、促侵襲、抗凋亡及促血管生成的作用[16]。Fu等[17]研究認為,抑制EGFR/PI3K/Akt/mTOR信號通路可促進食管癌吉非替尼耐藥細胞凋亡、抑制其增殖,提高食管癌細胞對吉非替尼的敏感性,提示該通路或可成為抑制腫瘤細胞耐藥新靶點。NSC228155是EGFR激活劑,可誘導EGFR的磷酸化,進而影響下游信號分子表達。本研究結果顯示,與耐藥組對比,干預組p-EGFR/EGFR、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR降低,在芥子堿硫氰酸鹽基礎上增用EGFR激活劑NSC 228155可減弱芥子堿硫氰酸鹽對卵巢癌的GEM增敏作用,提示芥子堿硫氰酸鹽可能通過介導該通路抑制卵巢癌細胞血管生成并降低其GEM耐藥性。

綜上所述,芥子堿硫氰酸鹽可抑制卵巢癌細胞血管生成并提升GEM化療敏感性,抑制EGFR/PI3K信號通路可能是其作用機制之一。