獻血者使用HIV 抗病毒治療藥物對血液安全的影響

王立林 趙方 楊崢嶸 朱蕊 劉宜仲 鄔林楓 李彤 陳婷婷 曾勁峰

(1.深圳市血液中心，廣東 深圳 518035；2.深圳市第三人民醫院；3.深圳市疾病預防控制中心；4.深圳市寶安區中心血站)

艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)是1 種嚴重威脅人民健康，社會影響重大的性傳播病毒。 國家疾控中心發布，截至2022 年9月底，我國報告121.5 萬人感染HIV，累計死亡40.8萬人。 2010—2017 年中國無償獻血者HIV 感染率Meta 分析結果顯示，獻血人群中HIV 陽性率約為21.02/10 萬人[1]。 另有研究對中國5 個不同地區HIV 流行率進行統計，首次獻血者的HIV 陽性率約為37.93/10 萬人，重復獻血者為20.55/10 萬人[2]。近年，歐美等發達國家在獻血人群中發現有正在接受HIV 抗病毒治療(antiretrovital therapy， ART)和正在進行暴露前預防措施(pre-exposure pro，PrEP)的情況[3-4]。 多項臨床試驗結果顯示，獻血者中ART 現象涉及面比之前想象的更廣泛[5-9]。ART 和PrEP 等HIV 治療藥物應用增加了獻血者HIV 篩查的不確定性和風險性，給血液安全帶來潛在風險。 ART 治療后HIV 感染者血漿病毒載量、抗原水平可降至檢出限以下，第二代、第三代和第四代酶聯免疫吸附試驗(ELISA)篩查以及免疫印跡分析(WB)觀察到HIV 特異性抗體血清學轉化失敗和血清學逆轉——之前血漿中檢測到的HIV抗體消失[10-11]。 使用ART 藥物的獻血人群，可能會由于HIV 病毒、抗原、抗體均檢測不到而導致漏檢；使用PrEP 藥物預防HIV 感染的人群，也有可能在不知不覺中感染HIV(也稱為“PrEP 突破感染”)，用藥時體內病毒核酸、抗體難以檢測，這些都給HIV 血液篩查及確證帶來新的挑戰。 本研究應用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)方法，檢測2019—2023 年約從44 萬獻血者中收集的血漿標本，首次監測我國獻血人群中正在接受ART和正在進行PrEP 預防HIV 的實際情況，評估HIV抗病毒藥物使用對血液安全影響，為應對HIV 診療新趨勢帶來的輸血安全威脅提供基礎數據，為獻血招募工作識別高危人群提供需要關注的征詢內容。

1 材料與方法

1.1 標本分組

1.1.1 陰性對照組

為探明陰性對照組ART 藥物血漿基線濃度，隨機選取2019—2023 年86 名定期獻血者作為陰性對照組。

1.1.2 HIV 實驗組

2019—2023 年，從深圳市血液中心44 萬獻血者中篩查出98 名抗-HIV 陽性者，其標本送檢深圳市疾病預防控制中心進行確證實驗，后續共同進行血液安全相關研究。

1.1.3 標本保存和知情同意

EDTA-2K 管采集全血， 血漿分裝凍存于-80℃。 研究對象均于獻血前簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 血液篩查

第四代Genscreen ULTRA-HIV Ag-Ab 試劑(Genscreen ULTRA，美國伯樂):抗-HIV-A，批號:8F0436，9E0465，0G0499；第三代抗-HIV 試劑(北京萬泰):抗-HIV-B，批號:I20200103。 人類免疫缺陷病毒(HIV 1＋2 型)抗體檢測免疫印跡法(Western blotting，WB)試劑HIV BLOT 2.2(MP 生物醫學亞太私人有限公司，新加坡)。 進口試劑(DiaSorin S.p.A.UK Branch): 抗-TP-A， 批號: D972010，D798110；國產抗-TP 試劑(珠海麗珠):抗-TP-B，批號:2019112308，2020061008。 人類免疫缺陷病毒(HIV 1＋2 型)抗體檢測免疫印跡法試劑盒(Western blotting，WB)HIV BLOT 2.2(MP 生物醫學亞太私人有限公司，新加坡)。 HIV-1 病毒RNA 定量檢測試劑盒(Roche COBAS AmpliPrep/COBAS Taq-Man HIV-1，美國羅氏)。 Procleix Panther System 全自動核酸檢檢測系統(Grifols，西班牙)，使用配套Procleix Ultrio Elite 聯檢試劑， Procleix HIV-1、HCV、HBV Discriminatory Assay 鑒別試劑(Grifols，西班牙)。 AutoBlot System 20 全自動免疫蛋白印跡儀(美國伯樂)；FACS Calibur 標準流式細胞儀測(BD Biosciences，San Jose，CA，美國)。 高速臺式離心機(德國Eppendorf)。

1.2.2 HPLC-MS/MS 檢測

Calquant-S LC/MS/MS 系統，多管渦旋混合儀(IKA)，醫用高速冷凍離心機，甲酸、甲醇、乙腈(Sigma-Aldrich)，抗-HIV 藥物標準品(上海藍木化工有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 酶聯免疫吸附測定判定規則

根據試劑說明書操作和判定結果。 所有標本應用3 遍ELISA，若2 遍及以上反應性判定為陽性，否則結果為陰性。

1.3.2 HIV RNA 核酸單標本檢測

標本定性檢測獻血者血漿中的HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA。

1.3.3 HIV WB 實驗判定規則

HIV 陽性獻血者，進一步做HIV WB 實驗，根據試劑說明書判定標準，沒有病毒特異帶或者只有p17 帶判為陰性；檢出2 條ENV 帶(gpl60/gp41 和gpl20)及核心蛋白(GAG，包括p17、p24、p55)或酶蛋白(POL，包括p31、p51、p66)判為HIV-1 陽性；出現任何特異條帶，但不足以被判斷為陽性判為不確定。

1.3.4 HPLC-MS/MS 檢測ART 藥物

1.3.4.1 標本前處理

在血漿標本中加入含有同位素內標的蛋白沉淀劑，充分渦旋混勻后離心，去上清液稀釋后上機檢測。

1.3.4.2 標本檢測

采用CalQuant-S LC/MS/MS 系統對各組血漿標本中8 項ART 藥物(阿巴卡韋、依非韋倫、拉米夫定、洛匹那韋、奈維拉平、利托那韋、替諾福韋、齊多夫定)進行檢測，應用Analyst1.6.2 軟件進行數據采集，Multiquant 軟件進行定量分析。 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，方式多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM) 掃描模式。 離子對信息詳情:-1 位定量離子對，-2 位定性離子對。 流動相A:0.2%甲酸水；流動相B:0.2%甲酸，甲醇；梯度洗脫6 min。

1.3.5 獻血者中抗-HIV 陽性人群中使用ART 流行率的計算

HPLC-MS/MS 檢測抗-HIV 陽性組ART 藥物陽性例數占比抗-HIV 陽性組總人數即為使用ART流行率。

2 結果

2.1 各組一般情況及檢測結果見表1。

表1 各組一般情況及檢測結果(n，%)Table 1 Comparison of the general characteristics and test results within each group(n，%)

2.2 HPLC-MS/MS 檢測ART 藥物標準品血漿濃度的線性區間

在同一HPLC-MS/MS 檢測體系下，8 種ART藥物標準品血漿濃度線性區間范圍相差較大，替諾福韋標準品可檢測濃度最低，為4.0 ng/mL；洛匹那韋標準品可檢測濃度最高，為30 000.0 ng/mL。 8種藥物檢出線性范圍見圖1。

2.3 陰性對照組獻血者使用ART 藥物情況

86 例陰性對照組以1 ∶2人份混樣，所有標本未檢測到基線濃度ART 藥物。

2.4 抗-HIV 陽性者使用ART 藥物情況

2019—2023 年，深圳市44 萬獻血者中，98 例抗-HIV 陽性者血漿標本1 ∶2人份混樣，發現4 例混樣標本ART 藥物陽性，拆分檢測后確證4 例(編號為I1，I2，I3，I4)ART 藥物陽性者，其中，2 例檢出ART 藥物替諾福韋、拉米夫定、依非韋倫，1 例檢出拉米夫定、依非韋倫，1 例檢出拉米夫定、洛匹那韋、利托那韋、齊多夫定4 種藥物，4 人血漿8 種藥物濃度見表2。 抗-HIV 陽性者使用ART 藥物陽性率為4.08%。

表2 4 例抗-HIV 陽性者血漿中檢出ART 藥物種類及濃度(ng/mL)Table 2 ART drug categories and concentrations in 4 anti-HIV positive individuals(ng/mL)

2.5 4 例抗-HIV 陽性者ART 藥物檢出陽性的背景信息

4 例ART 藥物、抗-HIV 陽性者，抗-HIV-A 和抗-HIV-B，WB 結果均為陽性；編號I2 標本抗-TP-A和抗-TP-A 及TPPA 同時陽性，其余I1，I3，I4 均為陰性；I1 標本鑒別試劑HIV RNA 陰性，其余3 例均為陽性(表3)。

表3 4 例檢出ART 藥物、抗-HIV 陽性者背景信息Table 3 The background information of 4 ART drugs positive/anti-HIV positive individuals

2.6 抗-HIV 陽性者確證結果與是否服用ART 藥物關聯性分析

5 例確證結果陰性，18 例確證結果不確定的抗-HIV 陽性血漿標本中均未檢出ART 藥物，本研究中使用ART 藥物病例WB 確證試驗結果均為陽性(表4)。 其中，1 例WB 確證試驗結果陰性、HIV RNA 陽性標本為HIV 窗口期標本；1 例WB 確證試驗結果陽性、HIV RNA 陰性標本為服用ART 藥物獻血者血漿標本；4 例確證結果不確定的抗-HIV 陽性標本HIV RNA 均陽性，其中I8 為HIV 窗口期標本，I7 為HIV、TP 共感染標本，一般信息見表5。

表4 抗-HIV 陽性者確證結果與服用ART 藥物情況分析Table 4 The relationship between HIV antibody confirmatory testing results and ART drug taking in anti-HIV positive blood donors

表5 確證結果不確定的抗-HIV 陽性者一般信息Table 5 The general characteristics of anti-HIV positive blood donor with HIV indeterminate results

3 討論

ART 藥物的廣泛應用使得HIV 患者愈后改善，并發癥減少，生存質量提高，使獲得性免疫缺陷綜合征( acquired immune deficiency syndrome，AIDS)成為1 種可防可控的慢性疾病。 我國對所有HIV 陽性患者均提供免費抗病毒治療藥物。 與感染后患者開展治療不同，PrEP 是在未感染HIV的高危行為人群中使用ART，預防HIV 感染，過去5 年在高收入國家迅速推廣。 初步統計截止2019年底，英國有19 500 人，主要是男同性戀者和雙性戀者應用PrEP 預防高危行為暴露后感染HIV[4]。PrEP 包括每日口服富馬酸替諾福韋酯(TDF)和恩曲他濱(FTC)，2012 年經美國食品藥品監督管理局批準投入使用，已被研究證實，可將經性行為感染風險降低至少90%，將經注射吸毒共用針具感染艾滋病風險降低至少74%[12]。 暴露后預防(PEP)和PrEP 服用的藥物均屬于抗病毒類藥物，PEP 需要在HIV 高危暴露后(72 h 內)立即服藥28 d。 2 h內服藥，最大程度杜絕此類風險[13]。

但是，ART 治療方法的應用可能會增加HIV經輸血傳播風險。 在藥物作用下，HIV 病毒復制受到抑制，影響HIV 診斷標記物HIV RNA、病毒蛋白及相關抗體的生成及檢測，早期開展ART 導致血清學逆轉及檢測標記物質和量上改變，增加了獻血者HIV 篩查的不確定性和風險性。 鑒于血液篩查檢測靈敏度的限制，迫切需要了解這一人群的獻血比例，調查影響因素，采取干預措施識別高危人群，以減少這種情況[14]。

本研究首先確定了同時檢測血漿中8 種抗病毒藥物標準品HPLC-MS/MS 混樣檢測體系的混樣人數。 圖1 顯示，8 種ART 藥物標準品血漿濃度線性區間范圍相差較大，洛匹那韋標準品最高可檢測濃度是替諾福韋標準品最低可檢測濃度的7 500倍。 根據預實驗數據，同時考慮成本效益及后期對大規模人群ART 藥物使用情況調查，本研究后續選擇1 ∶2人份混合血漿標本，大于3 種常用ART 藥物檢測下限的混樣稀釋倍數。 以1 ∶2人份混樣的陰性對照組未檢測到基線濃度的ART 藥物，再次驗證定期獻血者是最安全的血液來源[15]。 HIV 實驗組混樣后拆分確證檢出4 例ART 藥物標本，檢出率為4.08%，低于2020 年報道的美國HIV 陽性獻血者ART 藥物檢出率15.4%[3]，也低于2021 年和2023 年發表的英國團隊調查的梅毒確診呈陽性獻血者的檢出率6.5%和5.6%[4-5]，考慮與我國抗病毒藥物使用開展較晚，深圳志愿、無償、利他的獻血工作開展基礎較好有關。 表2 中，本研究實驗組3 例檢出ART 藥物替諾福韋、拉米夫定、依非韋倫，1 例檢出拉米夫定、洛匹那韋、利托那韋、齊多夫定，共有6 種藥物，檢出藥物種類多，血藥濃度除了I1 齊多夫定和I3 拉米夫定在最低檢出限以下，其他幾種藥物濃度均在線性范圍內，替拉依3 種藥物濃度與Oluoch[16]等研究中的血藥濃度有差別，但差別不大。 具體分析時需考慮血藥濃度受每日是否按時服藥，服藥后檢測時間等因素的影響。

抗-HIV 陽性者使用ART 藥物后獻血對血液安全的威脅主要在于服藥期間發生高危行為，獻血者不確定是否突破感染但隱瞞高危史、服藥史前來獻血，由于HIV 窗口期存在，血液篩查試劑對這類標本可能存在漏檢風險。 本研究中，HPLC-MS/MS 系統檢出的4 名使用ART 藥物的抗-HIV 陽性者，抗-HIV-A 和抗-HIV-B，WB 結果均為陽性，I1 標本HIV RNA 鑒別結果陰性，其余3 例均為陽性，說明HIV 患者用藥后，抗體試劑檢出能力較核酸試劑受到的影響更小，但是，因WB 結果均為陽性，抗體條帶完整，提示4 例使用ART 藥物獻血者不是早期感染后服藥，沒有發生HIV 突破感染及感染早期治療后的血清學逆轉[14，17]。 表3 中I2 標本抗-TPA 和抗-TP-B 及TPPA 同時陽性，支持既往研究的觀點:使用ART 藥物包括PrEP、PEP 藥物主要集中在具有高危性行為人群[18]。 同時，表3 中I2 病例早在2015 年3 月26 日已由深圳疾病預防控制中心(CDC)出具HIV 確證陽性報告，說明深圳地區抗-HIV 陽性獻血者中存在使用ART 藥物情況，而且有已知確診感染病例仍然獻血的現象。 因血站信息系統與CDC 信息系統未聯網，故而此類人群可能獻血，但本文此名患者第1 次獻血即被篩查檢出，更加凸顯血液篩查的必要性和有效性。 表3中，4 位服藥獻血者因未打通電話等原因，無法追蹤問詢，但推測可能存在以體檢為目的獻血，也不排除惡意獻血等極端行為。

由于本研究檢測藥物種類有限，并未囊括所有ART 藥物，各組是否存在服用其他ART 藥物尚未檢出情況，研究者將繼續展開研究。 根據《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》(WS293-2019)版針對HIV 感染后ART 新的診療趨勢，增加HIV 核酸定性或定量檢測結果與WB 結果一樣，都可作為HIV感染的診斷依據。 表4 結合抗-HIV 陽性人群中WB 和HIV RNA 結果，分析這2 種檢測方法對服用ART 藥物標本的檢測能力。 引起研究者注意的是，除了使用ART 藥物病例WB 確證試驗結果均為陽性，還發現1 例WB 確證試驗結果陰性，抗-HIV 陰性，HIV RNA 陽性標本，也即HIV 窗口期標本；發現1 例WB 確證試驗結果陽性，HIV RNA 陰性標本，也即服用ART 藥物后前來獻血的標本。 更需要關注的是表5 中4 例確證結果不確定的抗-HIV陽性標本，HIV RNA 均陽性，其中I8 為HIV 窗口期標本，I7 為HIV、TP 共感染標本，年輕男性，無法聯系隨訪，既往獻血2 次，多方面因素提示不確定結果中有可能包括HIV 感染者，或是早期感染WB 抗體條帶種類尚未完全產生，或是服用ART 藥物WB抗體條帶種類產生受抑制，導致出現不確定結果。遺憾的是缺乏隨訪信息以及更多藥物檢測結果，我們未能明確這些獻血者服藥情況。 本文數據及既往研究證實，現有血液篩查檢測方法可以檢出確定服藥及可能服藥的抗-HIV 陽性者，但抗-HIV 陰性獻血者中是否存在服用ART 藥物但尚未突破感染的情況，需要檢測更多陰性對照人群血漿是否存在ART 藥物，明確PrEP 在獻血人群中的應用情況[19]。

目前，國內外多項臨床試驗中暴露前預防有效性和安全性已得以驗證[20-22]。 雖然PrEP 藥物在我國獲批上市較晚，但部分經濟發達城市已經試點使用。 研究調查顯示，我國2021 年男男性行為者(MSM)的PrEP 相關知識知曉水平較2019 年大幅增高[23]，應采取綜合性措施加強對獻血者中MSM人群關于PrEP 對血液安全影響的宣教。 面對ART藥物使用所帶來的輸血風險，獻血招募人員也應及時調整高危風險問詢內容，采取積極應對措施。

作為采供血機構，為更加從容應對HIV 診斷治療新趨勢帶來的挑戰，需要及時評估ART 藥物使用對血液安全的影響，在獻血招募過程中增加問卷調查內容，同時加強科普和法制宣傳教育，最大程度上減少HIV 高危人群給血液安全帶來的風險。