罕見抗-Dib 致嚴重胎兒新生兒溶血病的實驗室檢測與相關研究

廖志堅 賈雙雙 溫機智 莫春妍 邵媛 張潤青 羅廣平 姬艷麗

(廣州血液中心臨床輸血研究所廣州市血液安全重點實驗室，廣東 廣州 510095)

在國際輸血協會(ISBT) 命名的血型系統中，Diego 為第10 號血型系統(DI，010)，包含22 個血型抗原(DI001～DI022)，其中最具有臨床意義的2個對偶抗原分別是Dia和Dib[1]。 Diego 血型系統中抗-Dia，抗-Dib和抗-Wra是臨床上最有意義的同種抗體，可引起輕重程度不等的胎兒新生兒溶血性疾病(hemolytic disease of the fetus and newborn， HDFN)和溶血性輸血反應[1]，抗-Dia和抗-Dib通常是在前1 次血型不合妊娠或輸血免疫后產生。 此前，由抗-Dib導致HDFN 的報道主要是來自日本人群[2-4]。 近年來隨著我國輸血相關檢測技術的不斷提高，陸續有抗-Dib導致HDFN 的病例報道，其臨床意義不容忽視[5-7]。

1 材料與方法

1.1 標本來源

患兒，男，出生1 d 15 h，第2 胎，足月順產，因新生兒高膽紅素血癥及新生兒貧血，黃疸及貧血持續加重由外地緊急轉院至廣州一三甲?？漆t院NICU 科治療，因無法找到配合血液送檢配血，在輸血治療前主要用靜脈大劑量丙種球蛋白(IVGG)維持治療。 患兒母親，28 歲，G2P2，白族，于2015 年10 月第1 胎分娩第1 孩，無明顯黃疸，分娩前輸注了配血相合紅細胞4 U。 患兒父親為漢族。 用于篩選相合血液的標本來自產婦家屬和健康無血緣關系獻血者。

1.2 主要試劑與儀器

抗-A 及抗-B 血型定型試劑(批號:20200913，上海血液生物)； 單克隆抗-D 試劑(批號:BMG1604B，英國Milipore)；低離子抗人球蛋白卡(批號:50531.62.12，瑞士BIO-RAD)；新生兒血型卡(批號:20500.01，西班牙GRIFOLS)；意外抗體篩選細胞(批號:45330.78.X，瑞士BIO-RAD)；意外抗體鑒定細胞(批號:732105，匈牙利REAGENS)；菠蘿酶(批號:BCCC9201，美國Sigma)；胰蛋白酶(批號:SLBS8956，美國Sigma)；抗胰蛋白酶(批號:SLBQ8063V，美國 Sigma)。 臺式離心機(型號:KA2200，日本久保田)； DNA 提取儀(型號:Quick Gene-Mini80，日本Kurabo)； DNA 提取試劑盒(Quick Gene DNA whole blood kit S，批號:11904-07，日本Kurabo)；微量紫外線核酸蛋白分析儀(型號:P-330，德國Im-plen)，PCR 儀(型號:ABI，Veriti)卡式孵育器(型號:BS-F24，貝索)卡式離心機(型號:12SⅡ，瑞士BIO-RAD)；單克隆抗-Dib(澳大利亞紅十字血液服務中心Yew wah Liew 惠贈)；抗-k(批號:NZD2101A，英國Milipore)；抗-Kpb(批號:32275-A2，法國DIAGAST)；Human IgG subclass kit 試劑盒(批號:8000150564，荷蘭Sanquin)；Red Fluorescence Cell Linker 試劑盒(批號:MKCM8734，德國Sigma)；FITC 抗人CD14(批號:1075136，德國BD)；Ficoll 淋巴細胞分離液(批號:10300123，美國Cytiva)；RP-MI-1640(批號:8121313，美國Gibco)；胎牛血清( Fetal bovineserum ( FBS)， 批號:DF29570026，美國Hyclone)；磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline(PBS)，批號:AG29643103，美國Cytiva 公司)；流式細胞儀(型號:BD FACS Canto Ⅱ，德國BD)、KX-21N 分析儀(型號:XS-500i，德國Sysmex)、細胞培養箱(型號:Forma311，美國Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 血清學檢測方法

1.3.1.1 新生兒溶血病檢測

采用新生兒血型卡測定患兒血型及直接抗人球蛋白試驗；采用Rh 血型分型卡檢測Rh 其他抗原；對患兒壓積紅細胞進行酸放散處理，采用抗人球凝膠卡對患兒血漿及放散液進行意外抗體篩選試驗。 相關操作按照試劑說明書進行。

1.3.1.2 患兒母親血型抗原鑒定

采用試管鹽水介質法檢測ABO 和RhD 抗原；采用Rh 血型分型卡檢測Rh 其他抗原；相關操作按照試劑說明書進行。

1.3.1.3 患兒及母親意外抗體鑒定

1.3.1.3.1 酶溶液的配制

菠蘿酶工作液(5 mg/mL)配制:將50 mg 菠蘿酶粉末溶于10 mL(pH5.5)PBS 溶液；胰蛋白酶工作液(2.5 mg/mL)配制:將25 mg 胰蛋白酶粉末溶于10 mL(pH7.4 ～7.7)PBS 溶液；抗胰蛋白酶工作液(5 mg/mL)配制:將50 mg 抗胰蛋白酶粉末溶于10 mL(pH7.4～7.7)PBS 溶液。 充分溶解后分裝于1.5 mL EP 管中，于-25℃保存備用。

1.3.1.3.2 酶處理意外抗體篩選及鑒定細胞的制備

將意外抗體篩選及鑒定細胞用生理鹽水洗滌3 次后，制備成壓積紅細胞。 分別按1 ∶1(菠蘿酶)或1 ∶4(胰蛋白酶和抗胰蛋白酶)的體積比加入壓積紅細胞及相應酶工作溶液。 混勻后，放入37℃水浴箱中，分別孵育10 min(菠蘿酶)、30 min(胰蛋白酶)及60 min(抗胰蛋白酶)。 期間每隔10 min輕輕混勻1 次。 離心去除上清，用1×PBS 溶液洗滌4 次，去上清，再用生理鹽水配制成1%～2%的紅細胞懸液備用。

1.3.1.3.3 意外抗體鑒定

采用未經酶處理的意外抗體篩查細胞及抗體鑒定細胞通過試管鹽水介質法和抗人球凝膠卡法，分別對患兒血漿進行意外抗體篩查，對患兒母親血漿進行抗體鑒定。 再分別采用經3 種不同酶處理的意外抗體篩查細胞及抗體鑒定細胞，通過抗人球凝膠卡法分別對患兒血漿進行意外抗體篩查，對患兒母親血漿進行抗體鑒定。 相關操作按照試劑說明書進行。

1.3.1.4 特殊血型抗原鑒定

用IgG 單克隆抗-Dib，抗-k，抗-Kpb，采用抗人球凝膠卡法，進行母親紅細胞特殊抗原鑒定，相關操作按照試劑說明書進行。

1.3.1.5 初步交叉配血

用患兒血漿與母親紅細胞，以及ABO 同型Di(b-)液氮解凍紅細胞，采用抗人球凝膠卡法進行交叉配血。

1.3.2 抗體IgG 分型

根據Human IgG subclass kit 試劑盒說明書進行抗體IgG 分型檢測。

1.3.3 流式細胞術檢測單核細胞體外吞噬致敏紅細胞試驗(the monocyte monolayer assay，MMA)

按照文獻[8]中報道方法，混合3 ～5 人份獻血者外周血，用Ficoll 分離單核細胞，同時用1 年后隨訪患兒母親的血漿致敏PE 熒光標記的Di(b＋)紅細胞，用單核細胞吞噬致敏紅細胞后，裂解未吞噬紅細胞，加入FITC 抗人CD14 單抗反應后，用流式細胞術檢測單核細胞的吞噬效率，單核細胞吞噬效率計算方法為:PE 和FITC 抗人CD14 雙陽性細胞群百分比除以FITC 抗人CD14 陽性細胞群的百分比。

1.3.4 分子生物學檢測

1.3.4.1 基因組DNA 提取

吸取200 μL(EDTA-K2抗凝) 外周血標本，使用DNA 提取儀，按照DNA 提取試劑盒操作說明，提取基因組DNA，并使用微量紫外線核酸蛋白分析儀，測定DNA 濃度和純度，所有操作均按試劑盒及儀器說明書進行。

1.3.4.2 基因測序

根據文獻[9]中報道的方法，對患兒及母親Diego 血型系統的編碼DI基因第19 號外顯子進行PCR 擴增，PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳(2%瓊脂糖凝膠，150 V 電泳15 min) 檢測后，送廣州天一輝遠生物科技有限公司進行Sanger 測序。 用DNAStar 軟件對序列結果進行比對和分析。

1.3.5 配合性血液的大規模篩選

檢測母親抗體效價，以最大稀釋倍數稀釋母親血漿，采用間接抗人球蛋白凝膠卡試驗，對ABO 同型及O 型獻血者紅細胞進行配合性篩選。 具體步驟為:在96 孔板中，將獻血者紅細胞用加樣儀稀釋到1%濃度，在抗人球凝膠卡編上對應96 孔板的標記，用排槍加50 μL 紅細胞懸液加入凝膠卡，再用排槍加25 μL 稀釋好血漿到凝膠卡中，37℃孵育15 min后，離心看結果。 與母親血型初篩反應陰性紅細胞，再用單克隆抗-Dib進行Dib 抗原的確認。

2 結果

2.1 血清學結果

2.1.1 HDFN 試驗

患兒血型鑒定結果為A 型，RhD 陽性，RhCE血型為CCDee；直抗IgG 強陽性(3＋s)；血漿及酸放散液與抗篩細胞反應均為陽性(表1)。

抗篩細胞Ⅰ抗篩細胞Ⅱ抗篩細胞Ⅲ游離試驗2＋2＋2＋放散試驗4＋4＋4＋

2.1.2 母親血清學檢測

母親血型為A 型，RhD 陽性，RhCE 血型為CCDee，直接抗人球蛋白試驗陰性。

2.1.3 意外抗體篩選與鑒定

患兒血清與抗篩細胞在鹽水介質中反應均陰性，在抗人球介質凝膠卡中反應均陽性(2＋)，與菠蘿酶處理后細胞反應增強(4＋)，與胰酶和抗胰蛋白酶處理后細胞反應強度稍增強(3＋)(表2)。

抗篩細胞 生理鹽水NPTCⅠ02＋4＋3＋3＋02＋4＋3＋3＋Ⅲ02＋4＋3＋3＋Ⅱ

患兒母親血漿與抗篩細胞及鑒定譜細胞在鹽水介質中反應均陰性，在抗人球介質凝膠卡中反應均4＋。 與菠蘿酶、胰酶和抗胰蛋白酶處理后細胞反應強度不變(均4＋)(表3)。 根據抗體對3 種酶處理紅細胞的反應強度的變化分析，初步符合抗-Dib，抗-k 和抗-Kpb特性，即對菠蘿酶、胰蛋白酶和抗胰蛋白酶處理細胞反應均抵抗。

序號Kell Rh MNS P Lewis Duffy Kidd Diego Lutheran 試驗結果D CEce cw Kk Kpa Kpb M NSs P1 Lea Leb Fya Fyb Jka Jkb Dia Lua Lub N PTC 1＋＋00＋0＋00＋0＋0＋00＋＋＋＋＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋2＋0＋＋000＋＋＋＋＋＋＋＋0＋0＋＋000＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋30＋0＋＋00＋0＋＋0＋0＋0＋0＋＋000＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋400＋＋＋0＋＋0＋＋＋0＋0＋00＋＋＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋5000＋＋0＋＋0＋＋＋＋＋00＋0＋0＋0＋＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋6＋00＋＋00＋0＋0＋0＋＋0＋＋0＋000＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋7＋＋00＋＋0＋0＋＋0＋0＋000＋0＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋8000＋＋00＋0＋＋＋＋0＋0＋＋＋＋＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋9＋＋＋＋＋00＋0＋0＋＋＋＋00＋00＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋10 ＋＋00＋00＋0＋0＋＋＋00＋＋0＋＋＋0＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋11 00＋＋＋00＋0＋＋00＋＋＋0＋0＋＋00＋ 4＋ 4＋ 4＋ 4＋

2.1.4 患兒母親特殊血型抗原鑒定

用針對3 種高頻抗原的單克隆抗體，鑒定患兒母親特殊抗原結果為Di(b-)，k(＋)和Kp(b＋)。

2.1.5 初步交叉配血

患兒血漿與母親紅細胞及A 型Di(b-)液氮解凍紅細胞交叉配血主側相合。 初步證實患兒母親和患兒體內存在IgG 類抗-Dib，進一步檢測母親抗體的效價，結果為512。

2.2 抗體IgG 分型結果

對直抗IgG 強陽性的新生兒紅細胞，采用Human IgG Subclass Kit 試劑盒對紅細胞表面致敏的IgG 抗體進行IgG 亞型分型，結果顯示為IgG1 和IgG2 亞型(稀釋倍數分別達到2 430 和810)，IgG3及IgG4 亞型未檢出(表4)。

亞型稀釋倍數1030902708102430 7290 21 870 IgG14＋4＋4＋3＋2＋1＋00 IgG24＋4＋3＋2＋1＋000 IgG300000000 IgG400000000

2.3 流式細胞術檢測單核細胞體外吞噬致敏紅細胞試驗結果

單核細胞對未致敏紅細胞(陰性對照)、抗-D單克隆抗體致敏紅細胞(陽性對照)和人源抗-Dib致敏紅細胞(試驗組)吞噬效率，分別為1.52%、91.30%和88.83%，試驗組的吞噬效率遠高于陰性對照組，二者之間的差異具有統計學意義(χ2＝152.616，P＜0.001)(圖1，表5)。

圖1 使用流式細胞術檢測抗體介導的單核細胞對致敏紅細胞的吞噬活性Figure 1 Phagocytosis activity of monocytes on sensitized red blood cells by flow cytometry analysis

編號名稱抗體種類 抗體效價直抗(Coom′s 卡)吞噬效率(%)Q2/(Q2＋Q3)1 陰性對照 RPMI1 640培養基/-1.52 2 陽性對照抗-D 致敏1 0243＋s91.30 3 母親血漿致敏紅細胞抗-Dib致敏1283＋s88.83

2.4 基因測序結果

Diego 系統血型抗原由DI基因編碼的單核苷酸多態性引起的氨基酸決定，DI基因的c.2561T 位點編碼的亮氨酸(Leu)表達Dia抗原，而c.2561C 位點編碼的脯氨酸(Pro)則表達Dib抗原。[1]通過對DI編碼基因外顯子19 的c.2 561T/C 位點進行測序分析，結果表明患兒母親該位點為c.2 561T/T 純合子，推測的Diego 血型表型為Di(a＋b-)；患兒父親該位點為c.2 561C/C 純合子，推測表型為Di(ab＋)；患兒舅舅該位點為c.2 561T/C 雜合子，推測表型為Di(a＋b＋)(圖2)。 患兒由于血量不足，未進行基因型檢測。

圖2 DI 基因外顯子19 測序結果Figure 2 Sequencing results of exon 19 of the DI gene

2.5 配合型血液的大規模篩選及臨床輸血治療

在患兒鑒定出抗-Dib隨后的1 周時間內，利用稀釋的患兒母親血漿，從5 520 名獻血者中篩查到2 名Di(b-)獻血者的血液。 患兒出生后血紅蛋白(Hb)從86 g/L 持續下降，在出生12 d 時最低下降到42 g/L；血膽紅素升高以間接膽紅素升高為主，出生d1 間接膽紅素達到240.5 μmol/L，后經治療持續下降至穩定水平。 在患兒貧血期間有核紅細胞絕對值也處在較高水平，提示骨髓造血活躍。 在新生兒出生d 12，輸注了1U Di(b-)的O 型洗滌紅細胞，Hb 水平由輸血前42 g/L 升至93 g/L(圖3)?；純汉箜樌鲈?，未再進行輸血治療；隨訪至1 歲時，生長發育正常。

圖3 患兒出生后Hb、膽紅素及有核紅細胞變化Figure 3 The changes of hemoglobin， bilirubin and number of nucleated red cells of the newborn

后續在獻血者中繼續篩查Di(b-)稀有血型，篩選的獻血者總數達到51 334 例，共篩查到17 名Di(b-)獻血者，該數據表明Di(b-)在廣州地區獻血者中的分布頻率約為三千分之一(0.033%，17/51 334)。

3 討論

本研究通過血清學檢測和DI基因測序[10]，成功鑒定了1 例Di(b-)稀有血型產婦產生抗-Dib所致的嚴重胎兒新生兒病例，通過及時的Di(b-)稀有血型血液的篩查，最終對該患兒進行了成功救治。 在本研究的病例中，患兒與母親血漿及患兒紅細胞放散液與全部抗篩細胞及譜細胞反應均為陽性，與母親紅細胞反應陰性，血清學格局提示該病例為母親體內針對高頻抗原意外抗體所致的HDFN。 進一步根據抗體對3 種酶處理紅細胞的反應格局分析，認為初步符合抗-Dib，抗-k 和抗-Kpb特性(即對菠蘿酶、胰蛋白酶和抗胰蛋白酶處理紅細胞反應強度均抵抗)[3]，從而初步判斷患兒體內抗體可能是針對這3 種高頻抗原的其中1 種。 對母親紅細胞高頻抗原的進一步鑒定，發現母親為稀有的Di(b-)血型。 患兒血漿與母親紅細胞及液氮保存Di(b-)解凍紅細胞反應陰性，進一步證實為針對高頻Dib抗原的抗-Dib。 因母親在第1 胎分娩時有過輸血史，考慮是輸血和第1 胎妊娠的免疫導致母親體內產生了抗-Dib。 母體內的高效價(512)抗-Dib致敏了胎兒紅細胞導致新生兒重度貧血及黃疸。 我們對患兒父親及舅舅的DI基因第19 外顯子測序分析，從基因層面及家系調查證實患兒母親DI?A/A基因型，舅舅是DI?A/B雜合基因型，父親是DI?B/B純合子，從分子生物學層面為患兒Diego 血型不合的HDFN 提供了證據[11]。

一般認為，抗-Dib屬于IgG(IgG1 或IgG3)性質，只能通過間接抗人球蛋白方法檢出[1]。 本研究也對抗-Dib亞型分型進行了檢測，發現本例患兒紅細胞表面包被的IgG 抗體亞型為IgG1 及IgG2 型，未檢出IgG3 型[1]，一般認為當存在母嬰Dib血型不合時，無論IgG1 或者IgG3 型的抗-Dib都有導致嚴重新生兒溶血可能性[4]，這次檢出合并IgG2 亞型是否能導致嚴重新生兒溶血需要未來進一步研究確認。

在無法確定傳統血清學方法檢測到抗體的臨床意義時，可以通過MMA 等體外功能性試驗來加以補充。 通過體外觀察單核細胞對致敏紅細胞的吞噬或破壞作用，來推測紅細胞抗體在體內是否具有臨床意義。 MMA 檢測除了可以應用于母嬰血型不合導致的HDFN 發生嚴重與否的風險預測外[12]，還可以在血清學交叉配血不合的情況下，尤其是具有多種混合抗體難以獲得完全相合的紅細胞時選擇體外吞噬率低于閾值的不相容紅細胞進行輸注，以保障血液供應和輸血安全[13]。 在本試驗中，我們采用改良的流式細胞術檢測單核細胞體外吞噬致敏紅細胞試驗，觀察到患兒母親抗-Dib體外單核細胞吞噬效率達到88.83%，接近于陽性對照(91.30%)，試驗結果與臨床表現的嚴重程度高度吻合，并且其高吞噬率提示只能找配血相合血液進行輸注才能夠達到輸血治療的目的。 此外，此試驗方法改良了傳統MMA 方法中耗時長，結果判讀主觀性較強等問題[14]，可作為預測抗體是否會導致胎兒溶血風險的有效方法，并且比常規抗體效價檢測準確率更高，可以進一步改良后作為臨床常規檢測進行推廣[4]。

Di(b-)表型在我國人群中分布罕見，臨床也常常有Di(b-)血液的需求，因此是具有重要臨床意義的稀有血型庫建設種類之一。 以往報道顯示日本人群中Di(b-)表型分布頻率約0.2%；而我國人群中，上海地區645 名獻血者中篩選出1 名Di(b-)表型；深圳市從2 990 名獻血者中篩選到2 例Di(b-)；山東報道從345 名獻血者中篩選出1 名Di(b-)表型，后來篩選2 643 名獻血者，僅發現1例Di(b-)表型，推測中國人群中Di (b-)表型頻率在1 /1 000 ～1 /2 000 之間[6]。 我們陸續從51 334名獻血者中篩選到17 例Di(b-)，因此在廣州地區人群中Di(b-)表型頻率約為1/3 000 左右。

高劑量IVIG 可以治療嚴重高膽紅素血癥，緩解貧血癥狀[8]，本例患兒經高劑量IVIG 治療后黃疸癥狀得到一定緩解，但Hb 水平一直維持在40 g/L左右，無法通過自身造血恢復，最終還是通過輸注篩選出的Di(b-)紅細胞才得以康復，所以治療抗-Dib導致的嚴重HDFN 常常存在嚴重貧血無法改善的情況，快速篩查到Di(b-)血液，進行輸血治療還是非常關鍵的。 本病例的救治提示我們稀有血型庫建立工作的重要性和緊迫性，稀有血型庫的建立不但可以在發現抗-Dib患者時及時找到相匹配的血液，而且日常稀有血型篩查過程中獲得的Di(b-)鑒定紅細胞，也能作為鑒定紅細胞試劑，在鑒定抗-Dib或作為抗-Dib合并其他復雜抗體時的鑒定過程中發揮重要作用，因此平時積累并凍存適量的Di(b-)稀有紅細胞對于提高參比實驗室的鑒定能力也是非常重要的。 此外，由于用于篩查Di(b-)稀有血型獻血者的抗-Dib單克隆抗體，國際上仍缺乏相應的商品化試劑的供應，在這種情況下，利用已經致敏個體體內的人源抗體開展大樣本篩查是有效的補充途徑。 本研究中，我們采用間接抗人球試驗方法，利用母親高效價人源抗體，進行適度稀釋，后續進行大規模獻血者的篩查，篩到了17 名Di(b-)稀有獻血者，并進行甘油冰凍紅細胞的制備，使稀有血型庫的庫存得到擴充。 當然，人源抗體的利用存在來源有限的局限性，進一步開發制備單克隆抗-Dib仍是血型血清學稀有血型篩查方法完善和創新的重要努力方向[15]。