去除雷達木干擾輸血相容性檢測的方法及輸血療效評估對比

張警丹 孫佳麗 杜瑞輝 李鵬 孫麗妲 李強

[1.中國醫學科學院血液病醫院(中國醫學科學院血液學研究所)，血液與健康全國重點實驗室，國家血液系統疾病臨床醫學研究中心，細胞生態海河實驗室，天津 300020；2.天津醫學健康研究院]

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是1 種起源于患者骨髓，漿細胞克隆性增殖的血液系統惡性腫瘤[1]。 CD38 分子是1 種單鏈Ⅱ型跨膜糖蛋白，在包括MM 在內的血液惡性腫瘤中廣泛高表達[2]，因此CD38 分子被當做治療MM 的靶點[3]。2019 年7 月，雷達木作為第1 款抗-CD38 單克隆抗體[4]在我國上市，其已被《中國多發性骨髓瘤診治指南(2020 年修訂)》推薦為治療復發難治性MM的治療藥物[5-6]。 CD38 抗原廣泛表達，RBC 上也有表達，盡管水平較低，雷達木單抗與RBC 表面CD38 抗原的結合仍會在間接抗人球蛋白試驗(indirect antiglobulin test， IAT)中產生泛凝集，并導致抗體篩查和交叉配血結果陽性[7-8]。 因此經DARA治療后的MM 患者輸血相容性檢測需使用特殊的配血策略。

血液與生物治療促進協會(Association for the Advancement for Blood ＆ Biotherapies，AABB)非緊急情況下推薦使用經DTT 處理過的RBC 與患者血清進行試驗，因為DTT 可使RBC 表面CD38 變性從而阻止其結合抗體，這是目前國際上消除CD38單抗干擾的最常用方法[9-10]。 但DTT 處理RBC 后雖然不影響A、B 抗原，Rh 系統抗原及部分其它系統抗原，卻會影響K、k、LWa、Ytb 等抗原[11-12]，造成相對應抗體的漏檢。 Egon 等[13]使用木瓜蛋白酶的Fab 試劑盒將DARA 裂解為DARA-Fab 片段，該片段可與RBC 表面CD38 抗原結合，此法可在不漏檢抗體的前提下解決DARA 對MM 患者的輸血相容性檢測干擾。 本研究通過比較2 種處理方式患者輸血前后的Hb、TBil、DBIL 和I-Bil 值，統計分析2種方法的差異性，驗證DARA-Fab 處理方法的可行性和有效性，評估該方法輸血療效，為解決DARA干擾輸血相容性檢測提供1 種新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2023 年2 月—7 月在本院就診的20 名MM 患者，其中男性13 名，女性7 名，年齡33～70 歲，中位年齡為59 歲，這些患者使用配血方法為DARA-Fab片段中和方法；2019 年9 月—2020 年11 月在本院就診的20 名MM 患者，其中男性12 名，女性8 名，年齡39～66 歲，中位年齡為57 歲，這些患者均使用DARA 治療。 2 組一般資料差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 試劑與儀器

PierceFab 制備試劑盒[英濰捷基(上海)，批號44985]；血型血清學離心機(久保田，KA-2200)；樣本離心機(北京白洋醫療，BY-150C 型)；抗人球蛋白檢測卡專用離心機(達亞美公司，ID-Centrifuge 12SⅡ)；RBC 血型抗篩細胞(西班牙戴安娜，批號22050.01，23003.01，23007.01，23011.01，23016.01，23021.01)， RBC 血型抗體鑒定細胞(批號8000458616，8000458859，80009055)，單克隆試劑抗-M(批號800456495)，單克隆試劑抗-Fyb(批號8000450774)， 單 克 隆 試 劑 抗-Jka( 批 號8000456033 )， 單克隆試 劑 抗-Jkb( 批 號8000457809)， 單克隆試劑抗-Lea( 批號8000451442)， 單克隆試劑抗-Leb( 批號8000455382)，均為荷蘭Sanquin 產品；單克隆試劑抗-N(批號994031A)，單克隆試劑抗-S(批號624024)，單克隆試劑抗-K(批號924685)，單克隆試劑抗-Fya(批號618021)，均為Immucor 公司產品；DTT 試劑(德國Roche 公司，批號38225823)；微珠凝膠卡(達亞美公司，批號8044088806)；Rh血型檢測卡(江蘇力博醫藥，批號202305005)等。

1.3 方法

1.3.1 DARA-Fab 片段的制備

將250 μL 固定化木瓜蛋白酶溶液置于0.8 mL自旋柱中，并以4 125 g 離心2 min，并棄去緩沖液。將3.5 mg 半胱氨酸鹽酸溶解在Fab 消化緩沖液(可提前制備)中，并用0.5 mL 消化緩沖液洗滌，4 125 g 離心2 min。 隨后，將200 μL DARA(2 mg)和400 μL 消化緩沖液混合加入到自旋柱中。 37℃孵育16 h，期間需多次混勻。 4 125 g 離心2 min 提取DARA-Fab 片段。 使用100 μL PBS(pH＝7.2)洗滌片段，并最終用100 μL PBS(pH ＝7.2)混合Fab片段置于-20℃儲存(可分裝，冷凍有效期可至數月)。

1.3.2 不同濃度DARA 對于紅細胞輸血相容性檢測干擾

將50 μL 0.8%細胞和25 μL 標準人血清混合DARA 溶液(濃度分別為500、1 000、1 500、2 000 mg/L)置于管中37℃孵育15 min，孵育期間多次混勻孵育結束后，取紅細胞混合液置于微住凝膠卡中，以未加DARA 血清為對照，135 g 離心10 min觀察結果。

1.3.3 不同劑量DARA-Fab 片段對于紅細胞輸血相容性檢測的去除效果

將50 μL 0.8%抗篩細胞、25 μL 標準血清混合DARA 溶液(濃度500 mg/L)和不同體積(5、10、15、30 μL)DARA-Fab 片段，共同在在試管中37°C孵育15 min，紅細胞被多次攪拌，將整個細胞懸液轉移到微柱凝膠卡中，以未加DARA 血清為對照組，在卡式離心機中離心10 min 觀察結果。 將15 μL DARA-Fab 片段和50 μL 0.8%抗體鑒定細胞與25 μL 標準血清混合DARA 溶液(濃度500 mg/L)為試驗組，未加DARA-Fab 片段為對照組，孵育離心方法與上述3 步驟一致。 未完全中和的部分鑒定細胞，選擇30 μL DARA-Fab 片段來孵育離心，觀察結果。

1.3.4 DARA-Fab 對紅細胞表面抗原的影響

選擇抗篩譜中對應抗原陽性的抗篩細胞，吸取50 μL 抗篩細胞與15 μL DARA-Fab 片段加入試管中，并在試驗組中加入20 μL 對應的單克隆抗體(抗-M、-N、-S、-Fya、-Fyb、-K、-Jka、-Jkb、-Lea、-Leb)，且組內選取每個系統抗原陰性的抗篩細胞為組內對照，37°C 孵育15 min，以未加15 μL DARA-Fab片段為對照組，將試管中溶液加入微柱凝膠卡中離心查看結果。 吸取50 μL Rh 血型系統中陽性的抗篩細胞與15 μL DARA-Fab 片段加入試管中，37°C孵育15 min，紅細胞被多次攪拌，為試驗組，以未加15 μL LDARA-Fab 片段為對照組，孵育后加入Rh血型檢測卡，離心10 min，觀察結果。

1.3.5 DTT 處理供者紅細胞的輸血相容性檢測

操作步驟詳見參考文獻[14]。

1.3.6 RBC 輸注

DARA-Fab 片段組和DTT 組均選擇使用交叉配血、抗體篩查試驗均為陰性的RBC 給與患者輸注，并將患者輸注前后1d 的Hb 含量作為輸血療效的重要指標，并記錄患者輸血前后的TBil、DBIL 和I-Bil。

1.4 統計學處理

采用SPSS19.0 軟件進行數據統計學分析，實驗室指標值輸血前后以“均值±標準差(±s)”表示，采用配對t檢驗進行統計學檢驗，P＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度DARA 對于紅細胞輸血相容性檢測的干擾

500、1 000、1 500、2 000 mg/L 濃度的DARA 對于紅細胞交叉配血中均有干擾，在微珠凝膠卡中顯示均為2 ＋，見圖1。 因由文獻[15] 報道214、575 μg/mL為給藥8、16 mg/kg DARA 后每周給藥結束時的平均給藥前血清濃度，故后面試驗均選用500 mg/L 濃度。

圖1 不同濃度DARA 對于紅細胞交叉配血的干擾Figure 1 The interference of different concentrations of DARA on RBC cross-matching

2.2 不同劑量DARA-Fab 片段對于紅細胞輸血相容性檢測的去除效果

5、10 μL 的DARA-Fab 片段結果為陽性，15、30 μL結果為陰性，見圖2。

圖2 不同劑量DARA-Fab 片段對紅細胞交叉配血的去除效果Figure 2 The removal effect of different doses of DARAFab fragments on RBC cross-matching

2.3 DARA-Fab 片段處理抗體鑒定細胞的劑量選擇

15 μL DARA-Fab 處理抗體鑒定細胞后基本為陰性，但有個別鑒定細胞可能因為CD38 抗原較多，無法完全封閉掉抗原，故又選擇1、6、8、10、12號抗體鑒定細胞經30 μL DARA-Fab 片段處理后，結果為完全陰性，見圖3。

圖3 DARA-Fab 片段處理抗體鑒定細胞的劑量選擇Figure 3 Dose selection for DARA-Fab fragment treatment of antibody identification cells

2.4 DARA-Fab 對紅細胞表面抗原的影響

DARA-Fab 對MNS 系統、Duffy、Kidd、Kell、Lewis 和Rh 血型系統中的陽性和陰性抗原均無影響，見圖4。

圖4 DARA-Fab 對紅細胞表面抗原的影響Figure 4 The effect of DARA-Fab on RBC surface antigen

2.5 DARA-Fab 片段中和的輸血相容性檢測方法輸血前后實驗室指標

輸血前后Hb 有明顯差異(P＜0.01)，TBil、DBIL 和I-Bil 無明顯差異(P＞0.05)，見表1。

Hb(g/L)TBil(μmol/L) DBIL(μmol/L)I-Bil(μmol/L)輸血前 63.60±1.5816.25±3.546.31±2.329.94±1.38輸血后73.90±1.90?17.87±3.577.10±2.8010.77±1.22

2.6 2 種配血方法患者輸血前后實驗室指標差異比較

2 組患者輸血前后Hb 值、TBil、DBIL 和I-Bil的差值，P均＞0.05，見表2。

Hb 差值(g/L)TBil 差值(μmol/L)DBIL 差值(μmol/L)I-Bil 差值(μmol/L)DTT 處理方法 10.75±1.04 3.31±1.472.76±1.24 1.97±0.40 Fab 封閉方法10.30±0.98 3.31±0.552.60±0.83 2.82±0.53

3 討論

DARA 是1 種新型人源IgG1κ 型抗-CD38 單克隆抗體，具有較強的抗MM 活性，可作為單藥物治療MM，也可與其它藥物聯合使用[2]。 DARA 單抗可靶向結合骨髓瘤細胞表面高表達的CD38 分子，通過多種作用機制(補體依賴細胞毒性、抗體依賴細胞介導的細胞毒性、抗體依賴細胞吞噬和抑制CD38 酶活性)誘導腫瘤細胞死亡，對于治療復發性難治性MM 有著很好的療效效果[16]。 隨著DARA單抗在我國正式上市，其不僅廣泛應用于MM 治療，也在其它腫瘤治療中得到應用[16]，但由于DARA 可干擾輸血相容性檢測，這就需要輸血科制定適當的解決方案來應對。

本研究通過Fab 制備的試劑盒，將DARA 裂解為DARA-Fab 片段，該制備方法簡單易行，不需要特殊設備。 木瓜蛋白酶可將DARA 分解成2 個Fab 片段和1 個Fc 片段，Pierce Fab 試劑盒使用木瓜蛋白酶(1 種非特異性硫醇內肽酶)固定在瓊脂糖樹脂上，可以從IgG 中高效地生產Fab。 固定化酶的優勢在于可以通過從樹脂中去除IgG 溶液來立即停止消化，以免酶的殘留影響所得產物，保證產物的純凈不存在剩余酶的干擾。 該試劑盒包括便于操作酶樹脂的旋轉柱，預包備和固定化的NAb蛋白A、離心柱結合Fc 片段和未消化的IgG。 通過使用試劑盒中的蛋白A 消除Fc 片段將木瓜蛋白酶純化不是必需的，因為Fc 片段在溫育期間不會干擾DARA-Fab 片段和RBC 表面CD38 抗原的結合。與患者血清抗體中IgG 濃度相比，Fc 片段的低量預期不會干擾輸血相容性檢測中抗原抗體的結合，這也使得DARA-Fab 片段制備更加簡易，無需后續步驟來純化Fab 片段。

在第1 次全劑量使用DARA 后，DARA 的消除半衰期平均為(110±42)h，在第7 次使用16 mg/kg DARA 的情況下，DARA 的消除半衰期平均為(587±487)h[15]。 有報道[17-18]也表明DARA 引起的泛凝集可在MM 患者持續用藥6 個月后繼續發生。我們采用500、1 000、1 500、2 000 mg/kg 的濃度來測試DARA 對紅細胞輸血相容性檢測的干擾，是由于相關文獻[13，15]報道患者在給予DARA 治療后可出現426～993 mg/L 的較高血清峰濃度。 圖1 顯示這4 個濃度對于IAT 最終結果均為2 ＋的凝集強度，推測這是由于RBC 表面CD38 抗原的表達數量是有限的，因此DARA 與CD38 抗原凝集強度的上限也就是2＋，故在試驗中均采用了500 mg/kg 的血清濃度來代表MM 患者經過DARA 藥物治療后的血清濃度。

隨后，為了測試不同劑量DARA-Fab 片段遮蔽紅細胞表面CD38 的效率，我們采用了5、10、15、30 μL 的Fab 片段和RBC 與添加DARA 的血清共同孵育離心，結果如圖2 顯示，15 μL 的Fab 片段可完全與紅細胞表面CD38 抗炎結合消除干擾，這與文獻報道一致[13]。 此方法使用的是競爭法，是讓Fab片段和DARA 競爭性地與RBC 表面CD38 抗原結合，我們先使用Fab 片段與RBC 孵育的封閉法，再使用與血清孵育的方法，這2 種方法均顯示15 μL的劑量可將CD38 單抗的干擾完全去除。 因競爭法比封閉法更為簡練且節約時間，故后續使用的均采用競爭法。 又考慮到體積增加對紅細胞有稀釋作用，影響最終反應結果，故我們采用改良的添加體積方案，使得紅細胞與血清的濃度不受影響，結果與傳統方案結果一致。

為了進一步驗證DARA-Fab 的遮蔽作用，我們使用15 μL Fab 與其共同孵育，結果見圖3，15 μL Fab 可與大多數抗體鑒定細胞陰性，但仍有部分細胞不能完全遮蔽掉，故又將這部分細胞使用30 μL Fab，結果最終為陰性。 這種現象推測可能與RBC表面CD38 抗原的表達量有關，存在個體差異；在后續配血過程中我們也發現主側配血時獻血者紅細胞也需30 μL Dara-Fab 才能完全封閉CD38 抗原，但抗篩細胞只需要15 μL，這一現象也提示紅細胞CD38 抗原表達也可能與紅細胞的新鮮程度有關。 因抗篩細胞為進口，待我們使用時已經保存較久，而獻血者紅細胞較為新鮮，這種現象與我們通過流式細胞術檢測時發現新鮮紅細胞CD38 抗原表達量最高是一致的。 為了保證試驗整體設計的一致性，后續試驗中我們統一采用30 μL Fab 來去除DARA 的干擾。

我們根據抗篩譜選取對應抗原陽性、陰性的細胞和對應單抗和Fab 片段共同孵育，圖4 顯示2 組結果一致，這表明DARA-Fab 片段對于紅細胞表面血型系統抗原的陽性和陰性表達無影響。 這與它去除干擾方式有關，Fab 片段只與RBC 表面CD38抗原結合，不會干擾其它血型系統抗原的表達。 與DTT 的干預方式完全不同，DTT 能裂解CD38 分子胞外區的二硫鍵，使得CD38 抗原分子變性來阻止與DARA 結合，但DTT 也會破壞部分血型系統抗原如K[14，19]。 這是DARA-Fab 片段方法的優勢所在，使用此方法可不受干擾地對紅細胞進行抗體篩查和抗體鑒定，為安全的輸血相容性檢測提供支持。 為了評估Dara-Fab 片段方法輸血療效，我們將其與DTT 方法的輸血效果進行了對比，分別選取2組20 名患者使用Fab 和DTT 方法來進行交叉配血，比較患者輸血前后的Hb 和TBil。 如表1 所示，經過統計分析，使用DARA-Fab 方法的配血患者Hb 值有明顯的差異，且TBil、DBIL 和I-Bil 無明顯差異，這表明患者輸血有效且未引起溶血反應。DTT 方法的有效性在我們已發表的文獻[14]中具體闡述過，且本次統計中均采用輸注2 U 紅細胞/人/次，其輸血前后紅細胞差值均為10 g/L，這與張之南等[20]研究的2 U 的紅細胞輸注后Hb 增量是一致的，表明紅細胞輸注的有效性。

隨著單克隆抗體治療的日益普及，輸血實驗室收到此類血液標本的可能性也隨之增加。 DTT 法使用最為普遍，但不易購得，且操作較為繁瑣費時，加之有毒還需在通風櫥內進行試驗。 而DARA-Fab片段可提前制備，且在-20℃下保存較久，需要使用時解凍即可；后續步驟簡便，采用卡式方法讀取結果即可。 此方法易于標準化，對操作人員要求較低，且不易漏檢抗體。 但Fab 試劑盒也與DTT 同屬科研試劑，需要相關資質購買，價格和DTT 一樣，略高，且DARA-Fab 的制備時間較長，但這仍為解決臨床上抗-CD38 單抗干擾輸血相容性檢測提供了1 種新的方案，保證患者能夠得到安全、快速的輸血治療。