同種抗-C、e 伴類同種抗-e、Jkb自身抗體的鑒定及輸血治療

鄒昕 馬思飛 楊紅梅 范小杰

(1.江蘇省常州市中心血站，江蘇 常州 213000；2.江蘇省常州市第一人民醫院檢驗科)

為了提高臨床輸血效率，意外抗體的篩查已經作為輸血前的常規檢查項目。 意外抗體主要包括同種抗體和自身抗體兩大類，也是引起溶血性輸血反應的主要原因之一。近年來，類同種自身抗體(mimicking antibodies，簡稱類抗體)的報道逐漸增加，它具有明顯紅細胞同種抗體特異性，又能被該特異性抗原陰性的紅細胞吸收[1-3]。 日常工作中吸收放散試驗是準確判斷抗體性質的利器，然而多系統聯合多種抗體同時出現，常給輸血前鑒定帶來極大的困難。我們在工作中發現了1 例同時產生抗-C、e 同種抗體和抗-e、Jkb類同種自身抗體的案例，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 患者資料

患者，女，44 歲，于2022 年12 月因貧血收入常州市某醫院住院治療，期間輸血1 次(2022 年12 月12 日，抗體篩選陰性輸注懸浮少白細胞紅細胞1.5 U)。 2023 年5 月因異常子宮出血手術需要備血，抗體篩查試驗由陰性變為陽性，送常州市中心血站輸血研究室特配紅細胞。

1.2 血清學檢查

1.2.1 試劑與儀器

IgM 型抗-A/B、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、反定型紅細胞、抗球蛋白試劑、酸放散試劑(上海血液生物，批號:20220101、20223001、 20223101、 20223203、 20223301、 20235316、20225001、20222102)； 抗-D ( 北京金豪制藥， 批號:20220601102)；抗-Jka、抗-Jkb單克隆抗體(德國CE 公司，批號:OJkaM220-1、OJkbM136-1)；篩選細胞(匈牙利Reagens公司，批號:702307)；譜細胞(匈牙利Reagens 公司/荷蘭Sanquin 公司，批號:732307、8000459230)；凝聚胺(珠海貝索生物，批號:A211203)；微柱凝膠卡(奧森多，批號:AHC290H)。 KA-2200 血型血清學專用離心機(日本久保田)；醫用離心機(江蘇貝索生物)；恒溫水浴箱(上海躍進醫療)；血型及配血離心孵育工作組(奧森多)。

1.2.2 ABO 血型、Rh 分型和Kidd 血型的鑒定

采集EDTA 抗凝全血，采用試管法鑒定ABO、Rh 和Kidd 血型系統相關抗原。 ABO 血型正定型、Rh 分型和Kidd血型鑒定，分別加入1 滴相應的抗體試劑和1 滴洗滌過的患者3%的紅細胞，1 000 g 離心15 s， 觀察凝集結果。 ABO 反定型， 3 支試管分別加入2 滴患者血清和1 滴試劑盒Ac、Bc、Oc，1000 g 離心15 s， 觀察凝集結果。

1.2.3 抗體鑒定試驗

利用鹽水法、抗球蛋白試驗和凝聚胺法配合2 套譜細胞進行抗體特異性鑒定。 抗球蛋白試驗包括直接抗人球蛋白試驗(direct antiglobulin test， DAT) 和間接抗人球蛋白試驗(indirect antiglobulin test， IAT)。 DAT:采用多抗、抗-IgG和抗-C3d 試劑，試管法室溫鹽水直接離心檢測。 IAT:按照試劑說明書利用微柱凝膠卡法檢測。

1.2.4 吸收放散試驗

選擇O 型Rh、Kidd 表型多種組合的獻血者壓積紅細胞與患者血清1 ∶1于37℃孵育吸收1 h，分離上清備用，紅細胞進行酸放散，放散液用試管法和微柱凝膠卡進行抗體鑒定。

1.2.5 抗體效價測定及積分評分法

等比稀釋法進行抗體效價檢測，用經典抗球試管法進行測定。 凝集強度的判讀和分級參考AABB 技術手冊(第18 版)，肉眼觀察結果為1 個牢固的凝塊為4＋，評12 分；若干個大凝塊為3＋，評10 分；中等大小凝塊，背景干凈為2＋，評8 分；小凝塊，背景渾濁為1＋，評5 分；凝塊極小，背景渾濁為1＋w，評3 分；凝塊幾乎不可見，背景渾濁為±，評2 分；無凝塊為0 分。

1.2.6RHCE、JKA/JKB基因測序及分析

設計匹配引物擴增RHCE基因、JKA/JKB基因。 基因組DNA 的提取、PCR 擴增及產物純化及測序，均參照ISBT 血型相關抗原等位基因數據庫進行比對分析，該試驗由天津秀鵬基因技術有限公司完成。

1.2.7 交叉配血試驗

前后共篩選出6 單位A 型ccDEE、Jk(a＋b-)洗滌紅細胞，分別以試管法、凝聚胺、微柱凝膠法進行交叉配血試驗。輸注d2 監測血紅蛋白(Hb)等相關指標。

2 結果

2.1 患者ABO、Rh、Kidd 血型及直抗試驗(DAT)

試管法鑒定該患者血型為A 型，Rh 分型結果為ccDEE，Kidd 分型為Jk(a＋b＋)，多次離心后未見有混合凝集，見表1。

-D -C -c -E -e -IgG， C3d -IgG C3d -Jka -Jkb IS 4＋ 0 3＋ 3＋ 02＋2＋01＋1＋多次 4＋ 0 4＋ 4＋ 02＋2＋03＋1＋

2.2 抗體篩選試驗

患者血清與抗體篩選細胞在鹽水室溫即刻離心(immediate spin， IS)中無凝集、無溶血，在凝聚胺、微柱凝膠卡中有凝集，提示該患者血清中含有不規則抗體，需進一步抗體特異性鑒定。

2.3 抗體特異性鑒定試驗

將患者血清與2 套譜細胞反應，結果見表2～3。 患者血清與譜細胞在微柱凝膠卡中均出現不同強度的凝集，符合抗-e 和抗-Jkb格局。 但不排除抗-C、抗-f。 患者直抗呈弱陽性，繼而對患者自身紅細胞進行酸放散，放散液抗體鑒定檢出抗體，符合抗-e 和抗-Jkb格局，見表3。

2.4 多重吸收放散鑒定抗體特異性

將患者血清分別用O 型R2R2獻血者壓積紅細胞1 號[ccDEE、Jk(a＋b-)]、2 號[ccDEE、Jk(a-b＋)]吸收，將吸收后的紅細胞進行洗滌，直至洗滌液抗篩結果為陰性，再把1、2 號細胞進行酸放散試驗，紅細胞放散液與譜細胞在鹽水介質中呈陰性反應，吸收后的上清和紅細胞放散液與譜細胞反應，在微柱凝膠卡中結果如表4。 可以證實吸收后的上清仍能檢出抗-e 特異性，放散液中同樣也有抗-e 和抗-Jkb，這是類抗體的特性，因此該患者血清中存在類抗-e 和類抗-Jkb。 用2 號吸收過的上清液分2 份繼續進行2 次吸收，1 份用O 型rr 獻血者壓積紅細胞3 號(ccdee)，吸收后的上清液鑒定出抗-C，基本排除抗-Ce，同時放散液中檢出抗-e 特異性。 1 份用O 型R1R1獻血者壓積紅細胞4 號(CCDee)，吸收后的上清液未檢出抗體，排除抗-f，而放散液檢出抗-e(不排除抗-C)特異性見表4。

Rh-hr D C Ece Cw K k M N Ss P1 Lea Leb Fya Fyb Jka Jkb Dia Kpa Kpb Lua Lub IS IAT Poly 1 R1R1K＋ ＋＋00＋0＋0＋00＋＋0＋＋＋0＋00＋0＋0 4＋ 4＋2 R2R2＋0＋＋000＋＋＋＋＋00＋0＋＋＋＋0＋0＋0 1＋ 2＋3r’r0＋0＋＋00＋0＋0＋＋0＋0＋＋000＋0＋0 4＋ 4＋4r′′r00＋＋＋00＋＋＋0＋＋0＋＋0＋000＋0＋0 4＋ 4＋5 rrK＋000＋＋0＋＋＋0＋0＋000＋0＋00＋0＋0 4＋ 4＋6R0r＋00＋＋00＋＋＋0＋＋0＋＋00＋0＋＋0＋0 4＋ 4＋7 R1R1 W ＋＋00＋＋0＋0＋＋＋＋0＋＋＋＋000＋0＋0 4＋ 4＋8rr000＋＋00＋0＋0＋00＋0＋＋＋0＋＋0＋0 4＋ 4＋9 R1R2＋＋＋＋＋0＋＋＋0＋＋0＋0＋0＋＋00＋0＋0 4＋ 4＋10 R1R1＋＋00＋00＋＋＋＋0＋000＋＋000＋＋＋0 4＋ 4＋11rr000＋＋00＋＋＋0＋＋＋0＋0＋000＋0＋0 4＋ 4＋自身0 2＋ 2＋

2.5 抗體效價積分鑒定

為了驗證患者血清中是否存在同種抗-e，用紅細胞(ccDEE)4 次吸收血漿中的抗體；同時用已知抗-E 做陽性對照吸收，見圖1。 測定多次紅細胞吸收前后血清中抗體效價。 原血清抗-e 效價為16，評分為46 分；4 次吸收后血清抗-e 效價為8，評分為40 分，患者效價結果沒有明顯的變化，而平行陽性對照效價從16 降為1，積分從47 下降至2，抗體在吸收放散時會有部分稀釋作用導致效價及評分下降，該試驗證明患者血清中存在未能被紅細胞(ccDEE)吸收的同種抗-e。

圖1 抗-e 多次吸收前后抗體效價及積分鑒定Figure 1 The titer and integral of anti-e before and after multiple absorption

2.6 RHCE 和JK 基因型分析

RHCE基因采用直接測序法測定1～10 外顯子，RHCE?01 相比， 第5 外顯子676 位出現G＞C，其余外顯子沒有發生突變，由此可以判斷RHCE血型基因型為cE/cE純合，其表型為ccEE 型。JK基因中第9 外顯子838 位是JKA與JKB等位基因的區分位點，采用測序法僅檢測該突變點位置。 以JK?01 為參考序列發現838G/ A 雜合，由此可以判斷其表型為JK(a＋b＋)型，見圖2～3。

圖2 RHCE 基因測序結果Figure 2 The results of genetic sequencing for RHCE gene

圖3 JK 基因測序結果Figure 3 The results of genetic sequencing for JK gene

2.7 輸血效果

3 討論

在同種抗體和自身抗體之間還存在1 種類同種抗體，可以有同種抗體的性質，選擇性地針對相應紅細胞上的血型抗原，又有自身抗體的特性，具有針對自身紅細胞血型抗原[4]。 類抗體的出現與紅細胞上是否有相應抗原沒有必然聯系，一般是由于直接抗人球蛋白試驗陽性，放散后發現與紅細胞上抗原不符；或者血清中抗體與紅細胞上抗原相互矛盾而發現的。 因此當懷疑有類抗體時，可能需要較多試驗來鑒定抗體的性質及血清學特征。 目前血清學、分子生物學聯合應用于輔助診斷未知抗體的產生，該技術的發展提高了臨床輸血的安全性[5-7]。 然而吸收放散試驗是區分類同種抗體和同種抗體的利器，多次吸收放散可鑒別區分多重混合抗體。 在不改變抗體性質的前提下促使血清抗體與紅細胞抗原可逆性結合，通過改變物理條件，血清抗體可從紅細胞中脫落，再利用已知抗原紅細胞進行鑒別，繼而達到吸收、放散過程[8-10]。

本患者有輸血史，產生同種抗體的可能性極大，經毛細管分離試驗排除輸血反應。 通過血清抗體特異性鑒定發現其血清中除抗-e、抗-Jkb之外還有易漏檢的抗-C 以及抗-f，而放散液檢出抗-e 及抗-Jkb。 因與患者ccDEE 、Jk(a＋b＋)分型有矛盾，提示有類抗-e 和類抗-Jkb。 利用紅細胞1 號[ccDEE、Jk(b-)]、2 號[ccDEE、Jk(b＋)]、3 號(ccdee)吸收放散，吸收后的上清液都沒有抗-Jkb，且能在放散液中檢出抗-Jkb，證實患者血清里存在類抗-Jkb，同時也檢出類抗-e、抗-C，排除抗-f，但是不排除同種抗-e。 利用紅細胞(ccDEE)多次吸收患者血清，檢測吸收前后的抗-e 效價，結果抗體效價和評分均未明顯改變，血清多次吸收后仍存在抗-e 格局抗體，而平行陽性對照抗-E 吸收后積分及效價直線下降，而紅細胞(ccdee)吸收后血清中未見抗-e，說明患者體內存在同種抗-e。

大多數情況下， 由于機體存在免疫監視、免疫自穩和免疫耐受的原因， 患者體內不會自發產生同種抗體和自身抗體[11-12]，然而輸血過程中患者容易發生各種不良反應，輸血免疫反應、基因突變或者藥物都會影響檢測結果，通過分子生物學技術對JK和RH基因型的精準分析，結果顯示該患者JK基因中第9 外顯子838G/ A 雜合[13]，由此可以判斷其表型為Jk(a ＋b ＋)型；RH基因型是DcE/DcE，其表型為ccDEE。 這些結果基本排除由于體內細胞基因突變導致產生類抗體而逃避自身免疫監視，但RHCE基因以及JK基因的轉錄翻譯以及抗原的完整性是否有影響還有待進一步研究。 有關類抗體產生的原因目前仍需大量試驗研究，有報道指出單獨藥物所致占比最多，可達48%左右[14]，涉及抗腫瘤、抗生素、抗病毒以及抗炎藥等多種藥物，可能是與藥物相關的免疫機制生化修飾作用所致[15]。 該患者最近半年服用補血類中藥制劑等藥物，結合病史高度懷疑患者因使用多種藥物導致產生自身類抗體。

區分同種和類同種抗體的目的在于輸血研究，對于存在類抗體的患者，輸血時我們應考慮多方面問題，是選擇與患者同型，還是避開類抗體。 部分研究者認為對于產生類抗體的貧血患者如病情允許，應避免輸血為宜，如必須要輸血治療，可以選擇暫時避開類抗體特異性輸血，若尋找類抗體對應抗原陰性的紅細胞太困難，可考慮忽略類抗體，采取最小不相容輸注策略，但是要注意是否發生遲發性溶血反應，關注患者輸血后Hb[16]。 2023 年本實驗室檢出的另3 例類抗體標本，我們運用紅細胞同型和非同型在體外溶血試驗配血[17]，發現避開類抗體的相容性試驗，溶血時間明顯延后，患者輸血后效果良好，說明在輸血時如果可以盡量避免類抗體以及增加體外溶血試驗配血。

綜上所述，該患者在半年之內產生了抗-C、e 同種抗體伴隨抗-e、Jkb類同種自身抗體。 血清學結合分子生物學對患者紅細胞表型鑒定，以及吸收放散試驗和效價積分法對患者血清、紅細胞進行抗體特異性檢測，綜合分析可區分出同種抗體或類同種抗體，選擇相應抗原陰性的血液進行輸注，為精準輸血做好保障。