罕見Ael 亞型的鑒定及探討

周帆 楊久揚 趙恒麗

(武安市第一人民醫院輸血科，河北 武安 056300)

ABO 血型系統最初于1900 年提出，至今仍是輸血醫學和器官移植醫學中重要的血型系統[1]。 ABO 亞型是指紅細胞或分泌液所含A 或B 抗原量不同的表現，其在臨床工作中通常因血型正反定型不符而被發現[2]。 對亞型的正確鑒定是保證臨床用血安全的重要前提。 我們在對住院患者的血型鑒定中發現Ael 亞型，現將家系調查及血型鑒定結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

先證者為本院患者，郝某某，女，47 歲，2022 年7 月12日因子宮肌瘤入院。 既往病史否認血液系統、腫瘤等重大疾病，無化療史，無移植史，無輸血史。 術前常規檢查血型(微柱凝膠法)正定型為O 型RhD 陽性，反定型為A 型，提示ABO 正反定型不符，故送檢標本要求做進一步血型鑒定。

1.2 試劑與儀器

抗-A、抗-B 血型定型試劑(單克隆抗體)(20220607)、抗-A1 凝集素(20220221)、抗-H 單克隆抗體(20220214)，均為上海血液生物醫藥有限公司；抗-A，B(845000，DIAGAST)； ABO 血型反定型試劑盒( 人血紅細胞)(2022060102)、 意外抗體檢測試劑(人血紅細胞)(20220602)，均為長春博迅生物技術有限責任公司；人源抗-A 及新鮮Ac、Oc、Bc 對照細胞均為自制。 實驗室溫濕度符合要求，儀器設備均在檢定有效期內，所用試劑均嚴格按照說明書進行。

1.3 血清學試驗

1.3.1 ABO 血型鑒定、意外抗體篩查

參照文獻[3]對患者及其次子采用鹽水試管法進行ABO、Rh 血型鑒定，鹽水試管法和經典抗人球蛋白法進行意外抗體篩查試驗，觀察結果并記錄。

1.3.2 抗-H 檢測

取檢測當日新鮮A、B、O 細胞做對照，先證者及其次子血清分別于與抗-H 試劑反應，觀察結果并記錄。

1.3.3 人源抗-A 血清的制備

參照文獻[3]選取實驗室內8 份抗體篩選陰性的B 型血標本，初篩1 ∶8稀釋后血清與患者反定型A 細胞，1 000 g離心15 s 凝集達到4＋混合備用。

1.3.4 人源抗-A 血清的質量驗證

參照文獻[4]采用試管法對上述制備的人源化抗-A 血清的抗體效價進行測定。

1.3.5 唾液血型物質檢測

參照文獻[5]采集患者及其次子的唾液10 mL，經離心、煮沸、再離心收集上清液，加入標化后的單克隆抗體試劑，中和后與相應紅細胞反應，觀察結果并記錄。

1.3.6 吸收放散試驗

參照文獻[6]，結合IgM 類抗體的性質進行冷吸收和熱放散。 先證者及其次子在冷吸收時均同時采用上述試驗制備的人源化抗-A 血清、標化的商品化單克隆抗-A 試劑及未標化的商品化單克隆抗-A 試劑進行試驗，同步吸收，以檢測用于吸收的抗體試劑的吸收能力。 同時使用新鮮O 型紅細胞作為陰性對照與先證者及其次子的紅細胞做平行試驗。

1.4 基因測序

經與患者及家屬溝通，除先證者次子外，其他家屬尚未同意，故家系調查僅采集次子血樣及先證者血樣，委托中濟萬泰生物醫藥有限公司代為進行ABO 基因測序。

2 結果

2.1 血清學試驗

2.1.1 ABO 血型鑒定、唾液血型物質、意外抗體篩查結果

先證者鹽水試管法ABO 血型鑒定立即離心，正定型為O 型Rh D 陽性，反定型Ac 管鏡下可見凝集；將試管置于4℃1 h 后可見Ac 管凝集增強，先證者血漿與Oc 及自身紅細胞均無凝集。 先證者次子鹽水試管法ABO 血型鑒定立即離心，正定型為B 型Rh D 陽性，反定型為B 型；將試管置于4℃1 h 后未見凝集強度增強，其血漿與Oc 及自身紅細胞均無凝集，結果見表1。 先證者及其次子鹽水抗人球蛋白法不規則抗體篩查結果均為陰性，結果見表2。

抗-A抗-B抗-D抗-A1抗-A，BAcBcOc自身對照唾液血型物質先證者IS004＋00±2＋s00H 物質4℃1 h004＋--2＋3＋--次子 IS04＋4＋04＋2＋000B 物質4℃1 h04＋4＋--2＋0--H 物質

2.1.2 抗-H 檢測

先證者及其次子紅細胞與抗-H 反應，見表3。

先證者 次子正常B細胞對照正常O細胞對照正常A細胞對照抗-H4＋w3＋1＋s4＋1＋

2.1.3 人源化抗-A 血清的質量驗證

參照文獻[4]對制備的人源化抗-A 血清的抗體效價和意外抗體篩查進行鑒定，其效價＞64，意外抗體篩查試驗結果為陰性，符合試驗要求。

2.1.4 吸收放散試驗

先證者及其次子的紅細胞經人源化抗-A 及標化的商品化單克隆抗-A 試劑吸收并放散后，放散液均與標準A 細胞反應，證實先證者及其次子的紅細胞表面存在A 抗原；先證者及其次子的紅細胞經未標化的單克隆抗-A 試劑吸收并放散后，與標準A 細胞反應未產生凝集現象。 陰性對照O 細胞經人源化抗-A、標化的單克隆抗-A 及未標化的單克隆抗-A 吸收后的放散液與標準A 細胞均不反應，見表4。

人源化抗-A 標化單克隆抗-A 未標化單克隆抗-A先證者2＋2＋0次子2＋2＋0陰性對照(O型紅細胞)0 0 0末次洗滌液000

2.2 基因測序結果

委托中濟萬泰生物醫藥有限公司對其測序后發現，先證者及其次子A等位基因在A102(基因測序模板A102 在A101 基礎上發生467 C＞T 的錯義突變)的基礎上，第7 外顯子發生767 T＞C 的錯義突變，導致多肽鏈第156 位(467 C＞T 的錯義突變)發生脯氨酸被亮氨酸替換、第256 位氨基酸發生異亮氨酸被蘇氨酸替換，見圖1。 綜合基因測序結果先證者的基因型為AEL05/O01，其次子基因型為AEL05/B101，檢索ISBT 官網[7]，先證者的ABO 血型基因型ISBT 命名為ABO?AEL.05//ABO?O.01.01，其次子基因型ISBT 命名為ABO?AEL.05//ABO?B.01.01。

3 討論

ABO 亞型是指紅細胞或分泌液所含A 或B 抗原量不同的表現，是由基因變異而形成的。 ABO 亞型在臨床工作中通常因血型正反定型不符而被發現[2]。 臨床上較為常見的A 亞型按紅細胞上A 抗原決定簇數量下降依次分為A1、A2、A3、Ax、Aend、Am、Ael 亞型等[8]。 大多數Ael 等位基因的先證人群為亞洲人， Ael 在人群中頻率較低且存在差異，報道顯示韓國約0.001%、日本約0.004 9%[9]。 Ael 血型亞型在我國人群表達概率約為八萬分之一[9]， 約為Rh 陰性血型的千分之一。

ABO 基因位于人類染色體9q34，全長19.5kb，由7 個外顯子組成，長度超19.5kb，共編碼354 個氨基酸。 其開放閱讀框主要位于第6、7 號外顯子，編碼酶催化區，也是決定ABO 基因產物糖基轉移酶功能的主要區域。 本案例中先證者及其次子經基因測序發現特征性突變位點均位于第7 外顯子，為467 C＞T、767 T＞C 雜合突變，證明患者的這一特征性突變已遺傳至下一代，符合ABO 亞型必須具有遺傳學基礎的特點[3]。 767 位堿基發生的T＞C 突變可能導致α-1，3-N-乙酰半乳糖胺基轉移酶的穩定性降低，從而使A 抗原表達減弱，形成Ael 亞型[10-12]。

現已報道的Ael 亞型等位基因共有12 種[13]，檢索血型抗原基因突變數據庫， 767 位堿基突變只有Ael05 等位基因， 其他等位基因未發現在767 位發生突變，Ael05 型最早在我國被報道，并且主要發生在我國[13]。

利用基因測序的方法檢測ABO 血型基因是目前血型鑒定的金標準[14]，但由于價格、試驗設備、試驗場地、人員等條件限制，基因測序無法在基層醫院開展，而吸收放散試驗因無需特殊儀器設備、簡單易學等優點適合基層醫院開展。

有文獻報道，在吸收放散試驗中使用單克隆抗血清吸收并放散后檢測不到相應抗原，需使用人源抗血清吸收放散才能檢出[3]，而人源化抗血清制備繁瑣，并且需要鑒定抗體效價、抗體親和力等指標，給吸收放散試驗帶來不便。 在本次吸收放散試驗中同時使用人源化抗-A 血清、未經標化的單克隆抗-A 試劑以及標化的單克隆抗-A 試劑與患者及其次子的紅細胞做平行試驗，試驗結果顯示，未經標化的單克隆抗-A 試劑與紅細胞吸收后，其放散結果為陰性，而人源化抗-A 血清及經標化的單克隆抗-A 試劑與紅細胞吸收后，放散結果均為陽性。 此外，在本次試驗中使用的是經標化的單克隆抗體試劑，目的是盡量避免商品化單克隆抗體試劑效價過高或放散液中的抗原量、唾液中的血型物質含量過低，而產生的前帶現象，使試驗結果產生假陰性。 本次試驗發現的未經標化的單克隆抗體做吸收放散試驗漏檢弱抗原事件是偶然現象還是規律，其原因及影響因素尚需進一步試驗驗證。

吸收放散試驗在血型抗體減弱或缺乏導致正反定型不符的血型鑒定中發揮重要作用[15]。 此外，吸收放散試驗在亞型的鑒定[2，5，8]、類抗體的檢測[16]、高效價冷凝集素標本的處理[17]中具有重要臨床意義，其具有簡單易學、無需特殊儀器設備及試劑等眾多優點，非常適合基層醫院開展。 正確、熟練、靈活應用吸收放散試驗可大大提高血型鑒定結果的準確性，提高臨床用血的安全性和科學性，避免血液資源的浪費。