單細胞測序技術在婦科惡性腫瘤中的應用

朱志英，黃金智，李玉婷，陳 影，陳冀瑩

（1.廣東醫科大學第一臨床醫學院，廣東 湛江 524000；2.深圳市龍華區中心醫院婦產科，廣東 深圳 518110；3.佛山市順德區婦幼保健院婦科，廣東 佛山 528300；4.廣東醫科大學附屬醫院婦產科，廣東 湛江 524000）

腫瘤的發生發展是一個復雜且多階段的過程，當內外源性因素引起基因組的不穩定時，易導致基因突變，突變的基因不斷增殖和積累最終引起細胞表型發生改變，從而發生惡性分化。在細胞分化過程中，腫瘤細胞中遺傳特性差異是發生復雜的腫瘤異質性的主要原因[1]。目前，研究者們對腫瘤細胞間的異質性及其形成機制了解不足，使大多數癌癥患者的臨床診斷及治療方法仍面臨著巨大的挑戰。單細胞測序（single-cell sequencing，SCS）技術的引入，徹底改變了研究者們對腫瘤的了解[2]。隨著單細胞RNA 測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術的不斷創新，為深入研究肝癌、肺癌、婦科惡性腫瘤及血液系統等疾病的發生發展機制、治療、轉移及預后等提供了技術支持[3-5]。宮頸癌（cervical cancer，CC）、子宮內膜癌（endometrial carcinoma，EC）和卵巢癌（ovarian tumor，OC）是最常見的婦科惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢，且呈現年輕化趨勢。近幾年，免疫治療及靶向治療雖然使部分患者獲益，但仍無法滿足患者的需求。主要是由于腫瘤在發生發展過程中，不同群體的基因異質性在腫瘤微環境中不斷產生、擴增并與細胞相互作用，導致細胞代謝異常、免疫逃避以及耐藥的發生[6]。目前為止，scRNA-seq技術在婦科惡性腫瘤中的研究較少，尚有較大的研究空間，有望在該領域取得重大突破?；诖?，本文主要對近幾年scRNA-seq 技術在婦科惡性腫瘤中的應用進行綜述，以期為未來研究者提供研究方向和理論基礎。

1 單細胞測序技術

scRNA-seq 技術指在單個細胞水平上，對基因組或轉錄組進行擴增并測序的一項變革性新技術。自1975 年英國科學家Sanger F[7]發明了第一代基因測序以來，基因測序逐漸成為人們探索細胞遺傳物質變化和發病機制的強有力工具。2009 年，Tang F等[8]首次在Nature Methods 雜志上發表從單個細胞水平上的轉錄組測序相關文章，從此打開了scRNA-seq 的大門。相對于傳統測序，scRNA-seq 最顯著優勢是更為精準，scRNA-seq 能檢測到稀有的基因和亞群，能更好地揭示基因表達中特定細胞類型的差異，為癌癥患者精準治療提供理論基礎[9]。而這些往往被傳統測序所忽略。據國際癌癥研究機構評估發現[10]，2040 年全球癌癥預計將達到2840 萬例，比2020 年增長約47%，情況不容樂觀。在過去的幾年里，scRNA-seq 技術廣泛用于探索各種癌癥的細胞異質性、腫瘤微環境、腫瘤的侵襲轉移和耐藥等方面。同時也應用于婦科惡性腫瘤中，使得人們對婦科惡性腫瘤有了更深入的了解。

2 單細胞測序技術與CC

CC 是最常見的婦科惡性腫瘤，我國每年新發病例13 萬以上，發病率和死亡率位居全球第4 位[11]，且發病人群日趨年輕化。據預測[12]，2030 年全球新出現的CC 病例將增加至85 萬例，發病形勢不容樂觀。宮頸轉化區，即宮頸鱗狀上皮和柱狀上皮交接部，是CC 的好發部位。當轉化區受到外來物質刺激，如人乳頭瘤病毒感染、精液組蛋白及其他致癌物質，鱗狀上皮細胞可出現間變或不典型表現，形成宮頸上皮內病變，隨著病變繼續發展，最終發展成CC。正常情況下，當轉化區因病毒感染或其他攻擊而受到干擾后，轉化區會發生重塑從而維持其穩態[13]，目前尚不清楚該轉化區生態位是如何發生重構的。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌最常見的病因。有研究者發現[14]，HPV 感染主要是通過調控轉化區的儲備干細胞，造成轉化區穩態失調，導致腫瘤發生。與此同時，Chumduri C等[15]通過scRNA-seq 描述宮頸上皮細胞亞群的特征，研究發現宮頸柱狀上皮細胞和鱗狀上皮細胞來自不同的宮頸譜系特異性干細胞群，且由基質的Wnt 信號調控，Wnt 信號選擇性地驅動柱狀系，同時對同一組織中鱗狀系特異性干細胞施加靜止狀態，從而維持了轉化區生態位的穩定；當鱗狀上皮發生化生，Wnt 抑制劑顯著上調，這種Wnt 抑制微環境的轉變可能激活了靜止的鱗狀干細胞群，干細胞進一步侵入過渡區柱狀上皮而發揮作用。

一般認為，CC 發生發展過程中腫瘤間表現出高度的異質性，使得疾病發展過程中不斷進化，最終導致治療失敗[16]。Li C 等[17]首次利用scRNA-seq 技術對來自CC 和正常宮頸組織的20938 個細胞進行分析，發現了一個與腫瘤進展的發育層次相關的癌癥干細胞（Cancer stem cells，CSCs）子集，腫瘤來源的內皮細胞中ATP 結合盒亞家族B 成員1（ATP binding cassette subfamily Bmember 1，ABCB1）和ATP 結合盒亞家族G 成員2（ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2）的表達水平高于正常來源的內皮細胞，這與已發表的報道研究一致[18]。而ABCB1 和ABCG2 的表達被認為是癌癥耐藥的一個生物標志物，其上調可能有助于化療耐藥和抗凋亡[19，20]，藥物可能通過ABC 轉運體影響內皮細胞的功能而產生耐藥的。另有研究者[21]對正常子宮頸、高級別上皮內瘤變、原發腫瘤和轉移性淋巴結患者的宮頸組織進行scRNA-seq，結果顯示高級別上皮內瘤變組織表現出較低的腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME)，腫瘤組織表現出免疫抑制的TME，而轉移性淋巴結的TME 提示免疫反應處于早期激活階段。這些結果加深了研究者對腫瘤間和TME 的異質性理解，為揭示CC 的腫瘤內異質性提供了一定的理論基礎。

3 單細胞測序與子EC

EC 是發生于子宮內膜上皮的惡性腫瘤，位居全球女性惡性腫瘤第6 位[10]。EC 雖好發于絕經后女性，但診斷時年齡小于40 歲的患者高達10%[22]，且其發病率會隨著肥胖癥和糖尿病發病率的上升而持續升高[23]。晚期和復發性的EC 患者手術并發癥風險高，5 年生存率低于20%[24]。激素治療、化療和靶向藥物治療是目前無法手術或拒絕手術患者的主要治療手段[25]。但藥物治療存在不同程度上的耐藥性、毒性反應及療效不佳等問題。這些都與疾病的內在復雜性息息相關，而單細胞測序技術能解決以往研究的局限性，加深了對疾病的探索。

目前，scRNA-seq 技術在EC 中的應用相對有限。2017 年，Hashimoto S 等[26]率先使用Nx1-seq 技術對子宮內膜樣腺癌的肌層浸潤側（M 側）和子宮內膜側（E 側）進行單細胞轉錄組分析，結果證實E側癌細胞惡性程度高于M 側，E 側的上皮-間充質轉化細胞通過抑制上皮細胞基因表達，將其轉化為具有干細胞特性的侵襲性腫瘤細胞。該研究還表明子宮肌層浸潤是EC 淋巴結轉移的獨立預后參數。另外，有研究者[27]整合已發表的EC 單細胞轉錄組圖譜，揭示了ZEB2（E 盒結合鋅指蛋白2），發現上皮細胞轉化為間充質細胞過程中的重要參與者，在EC相關巨噬細胞中高度表達。此外，聯合相關數據庫發現ZEB2 與巨噬細胞相關的免疫浸潤有關，且影響EC 患者的預后。Guo YE 等[28]在主導的一項scRNA-seq 研究中發現了不同的CD8+T 細胞狀態和單核-巨噬細胞群體，其中耗盡的CD8+T 細胞和巨噬細胞在腫瘤中優先富集，且CD8+T 細胞和巨噬細胞均符合連續激活模式。PD1/PDL-1 通路的免疫檢查點阻斷可以使耗盡的CD8+T 細胞恢復活力。這意味著如果T 細胞衰竭可以更早被逆轉，將更有利于疾病的控制。

EC 是由子宮內膜上皮細胞發展而成，子宮內膜的上皮細胞由分泌細胞和纖毛細胞組成。Fu DJ 等[29]對成年小鼠的子宮內膜上皮細胞進行scRNA-seq，發現表達轉錄因子PAX8 的上皮細胞負責管腔上皮細胞和腺上皮細胞的長期穩定再生，若表達轉錄因子PAX8 的上皮細胞中腫瘤抑制基因Trp53 和RB1失活，將導致具有漿液性EC 特征的腫瘤細胞形成。另外，Cochrane DR 等[30]研究來自正常子宮內膜上皮組織的類器官，鑒定了分泌細胞和纖毛細胞中差異表達的蛋白質，發現EC 中纖毛細胞標記物（DYDC2、CTH、FOXJ1 和P73）和分泌細胞標記物（MPST）的高表達與EC 患者更好的疾病特異性和總生存率相關，且較高表達水平的MPST 可以用來細化EC 的ProMiSE 分子分類中除高拷貝數變異亞組的其他亞組的風險分層。

4 單細胞測序與OC

OC 死亡率居婦科惡性腫瘤之首，以上皮性卵巢癌中的漿液性OC 最為常見[31]，進一步可分為高級別漿液性OC（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）和低級別漿液性OC（low-grade serous ovarian cancer，LGSOC），HGSOC 是預后最差和死亡率最高的OC 組織類型。早有研究表明[32，33]，導致OC治療失敗和預后不良的主要原因是腫瘤的異質性。另一項研究對6 個獨立腫瘤組織進行scRNA-seq數據也顯示了HGSOC 具有廣泛的異質性[34]。腫瘤的異質性使得有效識別治療靶點存在很大的挑戰性。為確定HGSOC 的異質性水平，研究者[33，35]分析了來自原發性、轉移性及晚期HGSOC 樣本細胞轉錄組譜，結果顯示抑制HGSOC 中JUN 信號通路和JAK/STAT 信號通路可能具有強大的抗腫瘤活性，JUN 和JAK/STAT 信號通路可能成為OC 的潛在治療靶點。Olbrecht S 等[36]通過scRNA-seq 分析也為高級別漿液性輸卵管-卵巢癌的治療提供了43 個新的潛在靶點。這些OC 中異質性特征的發現有助于更好地理解OC 發生、轉移和耐藥性的發生機制。

OC 主要治療方法是手術和化療相結合，由于其高復發率和耐藥性，OC 的5 年生存率約為47%[22]。了解腫瘤微環境的細胞組成和細胞間的相互作用對于發展成功的癌癥免疫治療至關重要。Olalekan S等[37]對6 例OC 的大網膜組織中分離出的細胞進行了scRNA-seq，發現高T 細胞浸潤組中有獨特的巨噬細胞和B 細胞亞群。Wan C 等[38]主導的一項對HGSOC 類器官/免疫細胞共培養物進行了免疫功能和單細胞RNA-序列轉錄譜分析，發現與單特異性抗體相比，雙特異性抗PD-1/PD-L1 抗體獨特地誘導NK 細胞從惰性表型轉變為更活躍和細胞毒性更強的表型，另外還誘導了一個CD8+T 細胞亞群從幼稚表型向更活躍和細胞毒性的祖細胞耗盡表型過渡，這些狀態的變化是由雙特異性抗體誘導的含溴結構域蛋白BRD1 下調所驅動的。另有研究發現[39]，HGSOC 是由代謝和增殖（metabolism and proliferation，MAP）、細胞防御反應（cell defense response，CDR）和DNA 損傷修復（DNA damage repair，DDR）3種原型表型驅動的。在接受多種治療的腫瘤細胞中，MAP 與CDR 發生了轉變，隨著對多種治療的耐藥性的獲得，MAP 原型的亞克隆表現出高度富集?？偟膩碚f，更好地理解驅動這些功能失調狀態的機制，可能使腫瘤的免疫治療取得成功。

大量RNA 測序的分子亞型分類有助于更準確地表征OC 中腫瘤異質性。scRNA-seq 的分子亞型轉錄組學分辨率為這些亞型的預后和預測相關性提供見解。Olbrecht S 等[36]在高級別漿液性輸卵管卵巢癌的轉錄組譜中發現肌成纖維細胞、TGF-β 驅動的癌癥相關成纖維細胞、間皮細胞和淋巴內皮細胞預測了較差的結果，而漿細胞與更有利的結果相關。另一項研究分析了約4000 個輸卵管上皮細胞，漿液性OC 的起源細胞，發現了大量以前未被識別的腫瘤內非遺傳異質性，非遺傳異質性的腫瘤分層可以預測生存率[40]，為漿液性OC 的準確預后和治療分層奠定了基礎。與此同時，Liang L 等[41]利用基因表達綜合數據庫（GEO）的兩個OC 的scRNA-seq（GSE154600 和GES158937）數據集，開發了一個雙基因特征預后分層系統（CXCL13 和IL26），以識別潛在的免疫治療靶點，準確評估預后風險。

5 總結

scRNA-seq 技術在癌癥領域的應用前景非常廣闊，很大程度上推動了婦科惡性腫瘤的研究和發展。scRNA-seq 技術從單個細胞層面來剖析婦科惡性腫瘤的發病、耐藥、侵襲和轉移機制，揭示腫瘤細胞異質性的程度和微環境的復雜性，尋找新的治療靶點，建立相應的預后風險評估指標，對婦科惡性腫瘤的研究具有重大意義，也為解釋癌癥的生物學提供了一種突出的方法。隨著單細胞測序的不斷發展和完善，基因組測序將為我們帶來新的改革。然而，scRNA-seq 的廣泛應用仍存在許多挑戰，關于如何定義質量控制標準、測序樣本中雜質過多及數據的丟失等問題尚未得到完善。此外，隨著實驗規模的擴大，研究成本高，數據分析的負擔也在增加。scRNA-seq技術的廣泛應用仍還有很長的路要走。