基于分子生物信息學分析DYNC1H1 在肝癌中的表達及意義

韋 程，董明右，2，宗子傲，2，王俊利，2，范傳濱，2

（右江民族醫學院研究生學院1，醫學檢驗學院2，廣西 百色 533000）

肝癌（liver cancer）是消化系統惡性程度極高的腫瘤之一，易復發、易轉移，進展期死亡率極高[1]，目前缺乏有效的早期肝癌診斷標志物和方法。隨著高通量技術，如測序技術和轉錄組學探索理論和技術的飛速發展，其在腫瘤損傷機體機制的分析中起著非常重要的作用。動力蛋白在動物體內的主要功能是細胞質動力蛋白（cytoplasmic dynein 1，Dynein）和軸突動力蛋白[2]。Dynein 負責逆行導向轉運細胞微管，并在細胞進行有絲分裂時發揮作用，軸突動力蛋白主要分布于鞭毛和纖毛的組裝。Dynein 由若干條輕鏈和6條不同分型的二聚體鏈構成，6 條二聚體鏈分別是2 條DYNC1H1（Cytoplasmic Dynein 1 Heavy Chain 1）、DYNC1I1、DYNC1I2、DYNC1LI1、DYNC1LI2[3]。Dynein 調節細胞有絲分裂并與一些癌癥的相關過程聯動進而加速腫瘤的形成，如果Dynein 的功能受到破壞，有絲分裂過程可能會變得異常，這個過程反而會抑制腫瘤的產生和發展。已經研究證實DYNC1H1 可作為潛在的生物標志物輔助診斷結直腸癌[4]，在胰腺癌中也發現了DYNC1H1 的突變[5]。除重鏈之外，已經有研究表明Dynein 的輕鏈表達滴度跟幾種常見的人類癌癥有關。Dynein 已經成為有效的抗癌藥物靶點標記，并研究出使Dynein失去活性，進一步降低介導平滑肌運動的Hedgehog途徑[6]。因此，Dynein 不僅在癌癥病理機制上提供見解，還在臨床藥物治療方案上展現可觀的潛能。DYNC1H1 突變通常會引起一些伴常染色體呈顯性遺傳的影響智力發育表現的疾病，但在肝癌中DYNC1H1 的表達和基因改變情況、臨床意義并不明確。本研究主要運用線上生物信息分析平臺，在TCGA 項目和GEO 數據庫對DYNC1H1 進行了肝癌分析，主要包含肝癌患者的病理標本，癌旁組織以及正常肝臟對照樣本數據，包括表達差異、表達水平與生存之間的相關性、基因改變、免疫浸潤和相關的細胞通路，以求揭示DYNC1H1 表達水平與肝癌發生發展的關聯，肝癌中DYNC1H1 基因變異的情況，以獲得DYNC1H1 對肝癌預后的價值和其他潛在的功能。

1 材料與方法

1.1 基因和蛋白表達分析 TIMER2.0 數據庫是能系統評估各種癌癥類型免疫浸潤的綜合數據庫，提供多種方法評估免疫浸潤程度，允許科研人員在線動態生成高質量的圖形，以全面探索多種腫瘤的免疫組學、臨床表現和基因組學特征，見圖1，進入在線TIMER2.0 數據庫（http://timer.cis-trome.org/），選擇評估方法、關注的腫瘤類型、目標基因即可算出免疫細胞的浸潤數據，并提供一鍵在線可視化[7]。利用該平臺分析肝細胞癌和其他類型癌組織中DYNC1H1的表達水平并分析其差異，探索DYNC1H1 水平是否與肝癌患者預后相關聯。設置的參數默認使用在線平臺的初始狀態。從GEPIA（gene expression profiling interactive analysis，http://gepia2.cancer-pku.cn）[8]網站收集了9736 例腫瘤樣本和8587 例健康樣本，并將所有RNA 序列進行數據化的信息統計歸納類，其中的基因數據全部來自癌癥基因組圖譜庫（the cancer genome atlas，TCGA）[9]和基因型組織表達數據集（the genotype tissue expression，GTEx）[10]，分析DYNC1H1 mRNA 的水平。設置的參數默認使用在線平臺的初始狀態。UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）TCGA RNA-seq 和31 種癌癥類型的臨床數據，用于TCGA 基因表達數據的深入分析[11]。使用臨床蛋白質組學腫瘤分析聯盟（CPTAC，http://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html）分析DYNC1H1 在腫瘤和正常樣本中的相對表達，以及基于個體腫瘤分級的各種腫瘤模型中的相對表達。

圖1 肝癌中DYNC1H1 mRNA 的表達水平

1.2 生存預后分析 使用GEPIA2.0 網絡工具進行患者生存分析。將DYNC1H1 基因輸入“生存分析”模塊，選擇一個自定義的癌癥類型，并使用Log-rank檢驗進行總體生存分析。高表達和低表達隊列被高（50%）和低（50%）截斷值劃分。Kaplan-Meier 繪圖儀（http://kmplot.com/analysis/）能夠評估54 000 個基因（mRNA、miRNA 和蛋白質）對21 種癌癥類型生存的影響。數據庫的來源包括GEO、EGA 和TCGA[12]。在“肝癌RNA-seq”模塊中分析了DYNC1H1 在不同癌癥類型中的表達與生存之間的相關性。

1.3 遺傳改變分析 cBioportal 數據庫（http://www.cbioportal.org）[13]提供分析研究腫瘤相關基因進行數據化和可視化工具。采用該平臺分析肝癌組織中DYNC1H1 基因改變情況（是否有基因突變、擴增等）及其與患者預后的關系。在“查詢”部分選擇了“精心策劃的非冗余研究集”（184 項研究，48 035 個樣本），并輸入“DYNC1H1”進行DYNC1H1 的遺傳改變特征查詢。然后，將DYNC1H1 mRNA 表達水平與對照組進行比較。在“圖”模塊中獲得假定的拷貝數改變（mRNA VS CNA），DYNC1H1 的突變位點信息可以顯示在“突變”模塊中。使用“比較/生存”模塊來獲得有或沒有DYNC1H1 基因改變的癌癥病例的總體和無復發生存差異的數據。

1.4 免疫濾過分析 使用TIMER2.0 系統分析不同癌癥類型的免疫浸潤的資源。將PPP1R14B 基因輸入“免疫”部分的“基因”模塊，然后選擇免疫浸潤類型，獲得不同癌癥類型中其表達與免疫浸潤水平的相關性數據。分析重要的免疫浸潤細胞，包括T cell CD8+、Common lymphoid progenitor、NK cell activat ed、Cancer associated fibroblast、T cell CD4+、Macrophage M2。

1.5 PPP1R14B 相關基因富集分析 String（cn.stringdb.org）構建蛋白之間相互作用網絡圖（protein-protein interaction，PPI）。使用生物信息學方法顯示蛋白物理相互作用、共表達、共定位、基因富集分析和網站預測等一系列相互作用的蛋白[14]。在“蛋白質名稱”的查詢中搜索了DYNC1H1，并選擇了“人”。設置以下主要參數：網絡邊緣的含義（“證據”）、主動交互源（“文本挖掘”“實驗”“數據庫”“共同表達”“鄰域”“基因融合”和“共發生”）、網絡類型（“全網絡”）、最低要求交互得分“中等置信度（0.400）”和顯示的最大交互者數（“不超過10 個交互者”）。使用TIMER2.0 探索DYNC1H1 與不同癌癥類型中DYNC1H1 結合的10 個相互作用因子的基因列表之間的相關性。在“探索”模塊的“基因_corr”部分輸入DYNC1H1 基因，然后輸入9 個相互作用子的基因列表，以獲得其表達的相關性數據。

1.6 統計學方法 DYNC1H1 拷貝數改變與其mRNA表達的關聯的數據來自cBioPortal 網站（https://www.cbioportal.org/），然后使用GraphPadPrism（81 版）對視窗進行非配對t檢驗進行分析。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 DYNC1H1 在肝癌中的表達 與癌旁正常組織進行比較DYNC1H1 在肝癌中呈高表達，見圖1A。選擇GTEx 數據集的正常組織作為對照，評估DYNC1H1 在肝癌和正常肝組織的表達差異，見圖1B，與正常組織相比，DYNC1H1 在上述腫瘤組織中高表達。蛋白質表達水平的變化與疾病、藥物作用或毒素作用直接相關。進一步分析了DYNC1H1 蛋白在腫瘤組織和正常組織中的表達差異，結果顯示，與正常組織相比，DYNC1H1 蛋白在肝癌中高表達，見圖1C。

2.2 DYNC1H1 在不同階段肝癌中的高表達DYNC1H1 在肝癌早期表達水平顯著升高，但在晚期和早期階段之間無顯著性差異。表明有可能涉及DYNC1H1 表達在癌癥的起始階段，而不是在癌癥的進展階段，見圖2。

圖2 肝癌中DYNC1H1 的過表達

2.3 DYNC1H1 評估肝癌預后的價值 以DYNC1H1基因表達的中位數為標準，將患者分為DYNC1H1基因高表達組（n=182）和低表達組（n=182）。DYNC1H1 基因低表達組的生存時間高于高表達組（P＜0.05），見圖3A；高表達的DYNC1H1 與肝癌的總生存期（OS）的不良預后相關，見圖3B。上述數據均顯示，DYNC1H1 的高表達與肝癌的不良預后密切相關，這可能是一種很有前途的肝癌預后標志物。

圖3 TCGA 中DYNC1H1 基因表達與肝癌生存預后的相關性

2.4 DYNC1H1 基因的突變特征 CNA 的“突變”型是肝癌的主要改變類型，改變頻率為3%，見圖4A。從TCGA 泛癌數據集發現DYNC1H1 被擴增，且mRNA 表達量顯著較高，見圖4B。DYNC1H1 基因改變的類型、位點和病例數見圖4C。DYNC1H1 的錯義突變是主要的基因改變類型，并在10 例病例中檢測到。DYNC1H1 基因改變與肝癌的臨床生存之間的關系見圖4D，DYNC1H1 改變的病例表現出較差的OS（Logrank TestP-value=0.166）。結果提示，肝癌中DYNC1H1 的基因改變參與了DYNC1H1mRNA 表達的改變且臨床生存率較差，值得更深入的研究。

圖4 肝癌中DYNC1H1 的突變特征

2.5 DYNC1H1 基因表達與免疫浸潤的相關性分析 在肝癌中，DYNC1H1 的表達與免疫細胞（T cell CD8+、Common lymphoid progenitor、NK cell activated、Cancer associated fibroblast、T cell CD4+、Macrophage M2）浸潤水平呈正相關（0＜P＜0.05），見圖5A～圖5F。

圖5 肝癌中DYNC1H1 的表達與免疫細胞浸潤的相關性

2.6 DYNC1H1 相關基因富集分析 String 分析共篩選出5 個已證實或預測的與DYNC1H1 相互作用蛋白，包括DCTN1，DYNC1I2，DYNC1LI2，DYNC1LI1，PAFAH1B1，見圖6A。在肝癌中，DYNC1I2、PAFAH1B1、DCTN1 的表達與DYNC1H1 呈正相關，見圖6B～圖6F。結合GEPIA2 工具和TCGA 的所有腫瘤表達數據，獲得了與DYNC1H1 的表達相關的前100 個基因，對上述兩組的交叉分析得到了1 個共同的成員，即DCTN1，見圖6G。DCTN1 與DYNC1H1 的表達呈較強的正相關，見圖6H。KEGG通路分析數據進一步表明，DYNC1H1 可能通過“抗利尿激素調節水的再吸收”“沙門氏菌感染”“噬菌體”“亨廷頓病”“帕金森病”“肌萎縮性側索硬化癥”“神經退行性便”“朊病毒疾病”參與肝癌的發生，見圖6I。生物過程富集分析表明，這些基因主要與核包膜拆卸、核遷移、逆行軸突運輸、中心體定位、主軸建立、有絲分裂紡錘體方向的建立的生物過程有關，見圖6J。

圖6 DYNC1H1 相關基因富集分析

3 討論

本研究發現DYNC1H1 在肝癌存在高表達，并且在早期階段存在顯著差異，這表明DYNC1H1 可能參與了肝癌的起始過程。此外，DYNC1H1 水平較高的患者預測肝癌的臨床預后較差。DYNC1H1 在肝癌中的突變特征分析顯示，以“突變”為主要類型的肝癌患者中DYNC1H1 的改變頻率最高（3%），而肝癌中DYNC1H1 的基因改變，改變了其mRNA 的表達。與未改變的DYNC1H1 組相比，DYNC1H1 改變的肝癌病例表現出較差的臨床生存期。

免疫細胞的浸潤是大多數惡性腫瘤的標志。免疫浸潤水平與癌癥的發生、進展或轉移密切相關。Dynein 在T 細胞的生長發育和活化中發揮作用。當T 細胞識別抗原提呈細胞上的復合體時，產生T 細胞受體簇（T cell receptor microclusters，TCR-MC）并且在Dynein 的驅動下形成中央超分子活化簇（Central supramolecular activation，CSMAC）。TCR-MC 運動所形成的CSMAC 依賴于dynein 和微管（Microtubules，MTs），該運動調節著T細胞活化[15]。Kreutzer M 等[16]報道，在多發性硬化癥（Multiple sclerosis）模型中，由DYNC1H1 介導的軸突運輸的缺陷與軸索病變有關，其免疫組化結果顯示DYNC1H1 在翻譯水平上出現下調，提示DYNC1H1可能是反映MS 病變的反應蛋白之一。在肝癌中，DYNC1H1 的表達與免疫細胞（T cell CD8+、Common lymphoid progenitor、NK cell activated、Cancer associated fibroblast、T cell CD4+、Macrophage M2）浸潤水平呈正相關。

此外，為了揭示DYNC1H1 在肝癌進展中的作用機制，本研究確定了與DYNC1H1 蛋白網絡相關的共表達基因，結果表明，在大多數癌癥中，DCTN1與DYNC1H1 的表達呈較強的正相關關系。目前有多種動力蛋白與癌癥發生發展有關，邊毅等[17]研究闡述了皮膚惡性黑色素瘤的發生與動力蛋白激酶2以及CD16 表達成正比。張琳等[18]的研究結果表明在肺腺癌中軸絲動力蛋白中鏈基因1 低表達并且抑制肺腺癌細胞侵襲能力。研究發現[18，19]，Tctex-1 高表達于腎癌組織，并且幫助確診，是腎癌臨床分期、病理分級的指標，可能對腎癌術后輔助治療有一定的參考價值。翟麗娜等[20]研究發現，線粒體動力蛋白MiD49 在肝癌中表達顯著上調，肝癌細胞的增殖會受到MiD49 的調控，且抑制凋亡，說明MiD49 是內在的促癌因子并可作為潛在的腫瘤治療靶標。由此可以推斷，動力蛋白與腫瘤的生長、癌細胞的轉移侵襲有關。

盡管跨多個數據庫整合了關于DYNC1H1 在肝癌癥中的作用信息，但仍有局限性。由于DYNC1H1的微陣列和測序數據是通過分析腫瘤組織信息收集的，因此免疫細胞標記物分析可能會引入系統偏倚。同時也沒有關于DYNC1H1 翻譯后修飾的信息，這可能會影響其功能。此外，本研究僅對不同數據庫中DYNC1H1 在肝癌中的作用進行了生物信息學分析，還需要進行體內和體外實驗驗證和進一步的機制研究。癌癥的進化包括遺傳、細胞狀態、表觀遺傳、空間和微環境因素的復雜相互作用。隨著測序和組學技術的快速發展，多組學、單細胞多組學和空間轉錄組學將為腫瘤復雜環境的研究增添動力。

綜上所述，DYNC1H1 可影響肝癌的預后，并與免疫浸潤密切相關。DYNC1H1 表達增加與肝癌的不良預后和免疫浸潤水平增加相關。DYNC1H1 可作為肝癌的預后生物標志物。這些發現可能提供了一種針對DYNC1H1 的抗腫瘤策略，包括操縱腫瘤細胞的生長或免疫細胞的浸潤。