骨免疫學背景下的NOD 樣受體及炎癥小體在關節炎中的研究現狀

鄧妃富，魏勁松

（廣東醫科大學附屬醫院骨科，廣東 湛江 524000）

固有免疫細胞是通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）非特異性識別體內外各種病原體啟動固有免疫反應后激活特異性免疫反應，進一步清除病原體，維持體內穩態。NOD 樣受體[nucleotide -binding and oligomerization domain（NOD）like receptors，NLRs]是一種類似Toll 樣受體的一組PRRs，可以識別病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）及損傷分子相關模式（endogenous damage-associated molecular patterns，DAPMs）。Toll 樣受體和c 型凝集素受體是檢測細胞外微生物的重要傳感器，而NLRs 是一種檢測細胞內的檢測分子。NLRs 介導的炎癥小體激活雖然說可以引發免疫反應，維持機體穩態，但NLRs 的過度激活可能會引發如骨性關節炎（osteoarthritis，OA）、類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）、痛風性關節炎（gouty arthritis，GR）等關節炎性疾病。NLRs 的異常激活通過骨免疫學對關節炎性疾病有重大影響，而了解NLRs 的病理生理激活機制，有助于對于靶向藥物的開發[1]。本文將結合骨免疫學探討不同NLRs 及炎癥小體在骨關節炎中的機制以及治療骨關節炎的理想治療靶點，以期為預防和治療該疾病提供新策略。

1 骨免疫學概述

骨免疫學主要研究骨骼系統及免疫系統之間的相互作用，兩個系統之間共享多種分子，包括細胞因子、趨化因子、轉錄因子和信號通路路徑等[2]。骨細胞有助于骨髓微環境之中的免疫調節，成骨細胞產生IL-7、DLL4 和CXCL12，分別支持常見的淋巴祖細胞、T 細胞祖細胞和B 細胞生長，破骨細胞骨吸收和破骨細胞衍生蛋白酶釋放鈣也可能有助于HSC調節，且破骨細胞骨吸收對于骨髓腔形成至關重要，有助于正常的造血微環境形成[3]。在骨免疫學經典的觀察中，促炎因子及免疫細胞可通過影響破骨細胞及成骨細胞協同作用進而影響骨骼系統。Treg 及CTLA4 以被證明抑制破骨細胞的分化。而相對于雌激素缺乏的骨質疏松是Th17 細胞過度表達產生IL-1、IL-6、IL-17 等促炎因子及RANKL 濃度增高引起破骨細胞活性增加導致的骨流失增多。Th1、Th9 及Th17 分別分泌的IL-1、IL-9 和IL-17 與巨噬細胞及中性粒細胞在關節囊內分泌的炎癥因子共同促進骨關節病的發生[4]。痛風及RA 等炎癥性關節炎中破骨細胞分化及活性增強，加劇骨流失，還會導致全身骨質疏松[5]。另外，在炎性關節炎中，TNF 主要通過3 種機制促進骨流失：①TNF 抑制成骨細胞分化；②TNF 促進RANKL 表達；③TNF 可直接作用于破骨細胞。Th17 作用于基質細胞和成骨細胞，調節RANKL 分泌促進破骨生成[6]。

2 NLRs 的生物學特性

NLRs 家族由人類22 種NLR 基因和小鼠34 種NLR 基因組成。NLRs 可以識別微生物的病原體成分（微生物核酸、鞭毛蛋白、病毒蛋白、肽聚糖等），宿主細胞損傷而釋放的細胞成分如ATP、K+,環境衍生物（二氧化硅、石棉等）。NLR 蛋白組成為中央的核苷酸結合域（NACHT）對于NLR 的活化和寡聚化非常重要。一個由幾個富含亮氨酸的重復序列（leucine-rich repeats，LRR）組成的羧基端（C 端）主要為配體結合區物和自身調節中起作用；氨基端（N 端）效應域為與其他蛋白結合發揮作用并激活caspase 的結構域，可與下游接頭蛋白質分子和效應蛋白質結合，啟動下游信號轉導[7]。

3 炎癥小體與NLRs

3.1 炎癥小體簡介 炎癥小體是一種多蛋白的分子聚合物，主要是由NLR、含有CARD 與凋亡相關的斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD，ASC）及caspase 蛋白酶組成。NLRs識別細胞內外PAMPs 或DAPMs 引發炎癥小體組裝，活化的caspase-1 將pro-IL-1β 和pro-IL-18 轉化為IL-1β 及IL-18，同時裂解gasdermin D（GSDMD），產生一個GSDMD-N 片段，從細胞質轉移到細胞膜后在細胞膜上形成孔，IL-1β 及IL-18 從這個孔分泌到細胞外，導致細胞焦亡[8]。炎癥小體失調造成較長時間的高炎癥水平會導致炎癥性骨病及骨發育缺陷。在炎癥條件下，破骨細胞及成骨細胞的協同作用會失衡，如TNF-α 抑制成骨細胞分化及IL-1β 促進破骨細胞分化，隨時間推移，骨流失及骨折風險增加[9]。因此，調控炎癥小體的表達對于骨細胞功能顯得尤為重要。

3.2 炎癥小體相關的NLRs

3.2.1 NLRP1 NLPR1 和ASC、CARD8、pro-caspase-1和pro-caspase-5 形成NLRP1 炎癥小體后促進IL-1β/IL-18 的加工成熟和細胞焦亡。而NLRP1 基因的多態性可導致NLRP1 表達增加，可增加RA 的易感性[10]。例如，佐劑誘導的大鼠RA 模型中，NLRP1在滑膜之中表達增高，抑制NLRP1 后關節炎的癥狀有所好轉[11]。機制上，炎癥小體活化導致IL-1β 和IL-18 成熟,IL-1β 和IL-18 被認為與RA 的發病機制密切相關。在RA 中，IL-1β 通過刺激成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）和軟骨細胞分泌基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）降解軟骨，進而加劇滑膜炎和骨破壞。IL-18 是一種多效性炎癥因子，對RA 炎癥爆發及維持起重要作用。IL-18 誘導FLS 的T 細胞分泌破骨細胞因子促進骨吸收[12]。血管翳形成是RA 的病理特征之一，有研究證實[13]，IL-18 可促進關節炎關節內血管形成。因此，NLRP1 與RA 的發病機制密切相關。NLRP1 也與骨性關節炎（osteoarthritis，OA）相關，敲低NLRP1 基因能減少OA-FLS 產生的IL-1β，而IL-1β 有助于軟骨細胞凋亡，促進OA 進展[14]。而NLPR1 對促進炎癥因子、RA 及OA 產生的影響機制還需進一步研究。

3.2.2 NLRC4 NLRC4 自身含有的CARD 結構域可激活pro-caspase-1，且ASC 可進一步增加caspase-1及IL-1β 的分泌。在臨床及動物實驗都能觀察到NLRC4 基因突變后，人或動物能夠產生炎癥性關節炎[15]。研究顯示[16]，牙周病小鼠模型之中，NLRC4 炎癥小體對于炎癥性骨吸收具有保護作用，可能與NLRC4 調控破骨細胞的活性有關。類似地，用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導小鼠炎性骨丟失，單純NLRP3 的敲除小鼠骨量增加，而NLRP3 和NLRC4都敲除的小鼠中骨量會降低[17]，進一步說明NLRC4炎癥小體在炎癥性骨吸收中的保護作用。然而，NLRC4 在骨轉換之中的描述及其影響炎癥性骨關節炎的機制仍需進一步研究。

3.3 非炎癥小體相關的NLRs

3.3.1 NLRP6 NLRP6 活化后與ASC 結合并激活caspase-1，把IL-1β 和IL-18 的前體切割成其生物活性形式并誘導細胞焦亡[18]。NLRP6 作為一種炎癥因子的負調節劑，如在牙周膜細胞中的NLRP6 可抑制NF-κB 及ERK 信號通路來抑制炎癥因子IL-6和TNF-α 的釋放[19]。相比于OA，NLRP6 在RA 中的作用更為關鍵。NLRP6 可抑制NF-κB 信號通路，且能抑制TNF-α 介導的RA 上FLS 促炎細胞因子及MMP 表達，與OA 患者相比，RA 患者的滑膜組織和FLS 中NLRP6 的mRNA 和蛋白水平均降低[20]。以上研究表明NLRP6 有作為治療RA 新靶點的潛力。

3.3.2 NLRP12 NLRP12 含有經典的NLR 三部分結構域結構，其N 端含有pyrin 結構域，可以與含有pyrin 的蛋白質相互作用而促進下游信號傳導事件傳導。NLRP12 基因和炎癥性關節炎存在相關性，在中國報告了3 例NLRP12 突變相關的自身免疫性炎癥性疾病如關節疼痛或關節炎，而外文報告的26 例文章之中出現多關節炎或關節痛的概率是59%[21]。研究認為[22]，大多數NLRs 具有促炎作用，雖然NLRP12 在特定情況下可作為炎癥因子的刺激點，如NLRP12 可增加IL-18 信號傳導降低小鼠對于鼠疫乳桿菌的易感性，但是NLRP12 可作為一種NLRs的抑制劑，能抑制炎癥且能減緩骨關節病進展過程。首先NLRP12 可抑制NF-κB 信號通路，減少炎癥反應及破骨細胞的生成，降低溶骨反應并維持骨穩態[23，24]。其次，NLRP12 通過抑制NF-κB 和MAPK 信號通路抑制RA-FLS 的增殖及炎癥反應，促進細胞凋亡，從而影響RA 的進展[25]。此外，NLRP12 能夠抑制Th17 細胞分化，減少細胞因子IL-17A、IL-17F 等的分泌，從而減緩RA 的炎癥反應[26，27]。進一步研究NLRP12 抑制NLRs 的機制能為關節炎帶來新的治療視角。

3.3.3 NOD1/2 NOD1/2 分別由CARD4 和CARD15基因編碼，共同屬于NLRC 家族，它們都包含NOD和LRRs 結構，但是它們的N 端NOD1 有1 個CARD 結構域，而NOD2 擁有2 個CARD。相比于NOD1，NOD2 對于關節炎的影響研究更為深入，但NOD1 也能對于NOD2 功能影響，在鏈球菌細胞壁誘導的小鼠關節炎模型之中，NOD2 促進促炎因子釋放和使關節炎癥及軟骨破壞加重，而NOD1 可能因對NOD2 信號調節作用而降低關節炎癥[28]。NOD2作為一種炎癥因子的調節劑，對骨關節病的發展起重要作用。在基因層面，在RA-FLS 中對于NLRs 的基因和蛋白水平進行檢測，發現NOD2 基因表達和蛋白質水平顯著升高，且NOD2 上升可導致促炎癥細胞因子及NF-κB 的上升[29]，推測NOD2 在RA 之中可以促進炎癥的發生發展。在細胞層面，NOD2 除作為一種炎癥因子促進劑外，還可作為Th17 細胞內源性負調節因子，減輕小鼠炎癥產生及自生免疫性關節炎[30]。IL-17 和Th17 細胞對于RA 的致病性具有重要的作用，Th17 細胞可以促進中性粒細胞的驅化并激活關節軟骨細胞和滑膜細胞，導致關節炎癥及軟骨的破壞[31]。在通路層面，發現用T-2 毒素（軟骨損傷的潛在因素）處理的軟骨細胞中，T-2 毒素可通過ROS/NF-κB 通路上調NOD2 表達，激活NOD2 信號通路，進而影響軟骨細胞的代謝基因表達和MMP 活性[32]。另外，在RA 中NOD2 主要在FLS 和滑膜巨噬細胞之中表達，NOD2 通過其配體鼠酰二肽（MDP）刺激p38 及NF-κB 通路增加了IL-6 和IL-8 的表達。同時，MDP 刺激MMP-1、3 和13 的表達，加速RA 的進展[33]。除了基因、細胞及通路水平，NOD1/2 還缺少臨床上對于骨關節病機制的研究。

3.4 NLRP3 NLRP3 炎癥小體是研究最多的炎癥小體，NLRP3 有3 種激活途徑，包括經典、非經典激活途徑和其它途徑。其中，NLRP3 的經典炎癥小體激活：PRRs 如toll 樣受體（TLRs）識別PAMPs 或DAMPs 可以誘導轉錄因子NF-κB 的激活，促進NLRP3 和IL-1β 的轉錄，NLRP3 炎癥小體組裝，之后caspase-1 促進IL-1β 及IL-18 和細胞焦亡。而NLRP3 的非經典途徑激活為細胞內LPS 觸發，LPS在鳥苷酸結合蛋白（guanylate binding proteins，GBPs）幫助下激活caspase-4/-5/-11 后，切割GSDMD 及Pannexin-1，從而促使膜孔形成[8]。相關研究顯示[34]，NLRP3 炎癥小體異常激活在多種骨關節病發生發展中起著關鍵作用，NLRP3 炎癥小體的異常激活可促進IL-1β 的成熟，IL-1β 可引起白細胞募集并引起一系列炎癥反應，可以促進破骨生成同時通過激活NF-κB 信號通路來抑制成骨的形成。同時，NLRP3 炎癥小體異常激活可導致小鼠血清炎癥水平高，觀察到膝關節軟骨生長板異常及軟骨細胞生長停滯[35]。

值得注意的是，NLRP3 在不同骨關節病中激活的機制不盡相同。在骨質疏松中，衰老或雌激素缺乏誘導的慢性炎癥微環境激活NLRP3 炎癥小體，促進炎癥因子的產生，并增強炎癥反應。NLRP3 炎癥小體在雌激素缺乏和持續甲狀旁腺激素暴露下可被激活，加速骨吸收，并且在許多高骨轉換模型中NLRP3 敲除可減少骨丟失[36]。在痛風中，GR 的危險因素之一是NLRP3 基因突變，在患者血清之中能檢測到高水平NLRP3、caspase-1、IL-1β 及IL-18[37]。二氧化硅和MUC 吞噬之后會導致溶酶體的酸化，進而導致NLRP3 炎癥小體的激活，而抑制溶酶體的酸化可以抑制NLRP3 激活以及后面IL-1β 的釋放。另外，通過NF-κB 信號激活途徑介導，促進NLRP3炎癥小體的組裝，激活痛風[38]。同時，NIMA 相關蛋白激酶7（NIMA-related kinase 7，NEK7）參與激活NLRP3，隨后激活caspase-1 不僅會促進IL-1β 成熟和釋放[39]。炎癥小體激活后介導的IL-1β 釋放觸發了重要的炎癥反應，血管擴張和中性粒細胞快速募集到晶體沉積部位，從而導致急性痛風炎癥發作[40]。在RA 中，NLRP3 基因和RA 的易感性相關。RA 抗瓜氨酸蛋白抗體（anti-citrullinated protein antibodies，ACPA）是一組針對瓜氨酸蛋白肽的自身抗體，是RA 的生物標志物。ACPA 通過激活NLRP3炎癥小體促進RA 中IL-1β 的產生[41]。另一方面，A20 基因可抑制NLRP3 激活，在A20 基因敲除的小鼠（一種RA 模型）可觀察到NLRP3、caspase-1 及IL-1β 產生減少，小鼠RA 炎癥癥狀也有所減輕[42]。在OA 中，關節滑液尿酸可激活NLRP3 炎癥小體，導致IL-1β 及IL-18 增加，引起OA 嚴重程度加重[43]。另外，OA 的嚴重程度和尿酸水平及滑液之中IL-1β及IL-18 有關，說明OA 的進展和NLRP3 炎癥小體的激活密不可分。NLRP3 的激活可以引起多種骨關節病，但是NLRP3 激活引起這些疾病的確切機制以及炎癥小體組裝和激活的機制還需要進一步研究。

4 NOD 樣受體及其產物

目前，臨床上對于GA、RA 及骨質疏松等骨關節病的常規治療，藥物的長期服用有安全隱患或療效不盡如人意。而對于NOD 樣受體及其產物的研究為骨關節病的治療提供了新思路。治療骨關病的NOD 樣受體產物抑制劑主要有caspase-1 抑制劑及IL-1β 抑制劑。caspase-1 抑制劑如VX-765 作為一種口服藥物可在血漿中被迅速降解，能改善小鼠RA 嚴重程度及炎癥介質的表達[44]。另外，研究表明caspase-1 抑制劑能減少慢性關節炎炎癥產生及改善軟骨破壞[45]。但是對caspase-1 抑制劑的特異性要求較高，因為其有非常保守的催化核心，如對凋亡caspase-1 抑制可能產生不良后果。IL-1β 抑制劑有Anakinra 及Auranofin。Auranofin 可阻斷RANKL 誘導的破骨細胞活化并抑制炎癥小體活化介導的IL-1β 分泌，可以作為治療骨質疏松的藥物，同時也被批準作為治療RA 的藥物[46]。Anakinra 可用作于治療RA，但是安全性仍有待驗證。NOD 受體抑制劑如化合物MCC950 是一種被廣泛研究的NLRP3 抑制劑，被用于RA 的臨床試驗，但由于其藥物毒性，試驗被迫終止[47]。天然物中的槲皮素和冬凌草素可以抑制NLRP3 激活從而改善痛風癥狀[48]。生活中的生酮飲食增加β-羥基丁酸酯來抑制的NLRP3 激活，從而減輕痛風的癥狀及進展[49]。另外，其它天然物質如甘草醇酮B 及褪黑素都可以抑制NLRP3，是治療炎癥性疾病很有前景的藥物[50，51]。NOD 受體及其產物抑制劑對于骨關節病可取得較好的療效，如Anakinra 可用作其它藥物治療痛風急性發作無效時的治療藥物，但抑制劑安全性還需提高。

5 總結

炎癥小體的激活會促進炎癥因子的產生，增強炎癥反應，而在骨免疫學的背景下，炎癥因子的產生，會對成骨細胞及破骨細胞產生影響，進而導致一系列的骨關節病的產生。研究炎癥小體的激活以及之后的產生炎癥因子如何影響骨細胞代謝，促進關節炎的發生，對于關節炎的治療至關重要。NOD 樣受體及炎癥小體并沒有一致的激活路徑，其激活的確切機制還需進一步研究闡述。NLRP3 炎癥小體影響關節炎的機制研究較為深入，其他炎癥小體對于骨關節病的影響還需要進一步研究。未來對于NOD樣受體及炎癥小體和骨細胞之間作用研究的激增，將會設計出更有效、特異性和安全的炎癥小體抑制劑，關節炎患者將會從炎癥小體關節生物抑制劑中受益。