TFF3依賴TWIST1上調TRIB3促結直腸癌轉移的機制

陳佳樂，帕爾哈提·沙依木，舒垠，蘇比依努爾·蘇拉依曼，艾克熱木·玉蘇甫

0 引言

結直腸癌已成為世界第三大常見癌癥，僅次于肺癌和乳腺癌（女性）/前列腺癌（男性），并且也是導致癌癥相關死亡的主要原因[1]。結直腸癌的復發和轉移是患者生存率下降的主要原因之一，在結直腸癌患者中，15%～25%的患者在診斷時已經出現了惡性擴散，而這些患者的5年生存率僅有10%左右[2]。因此，深入探究結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制對于阻斷該疾病的進展至關重要。

三葉因子3（trefoil factor 3, TFF3）是一種由TFF基因編碼的小分子肽類蛋白。它通常存在于多種黏膜表皮細胞中，如胃腸道、呼吸道及泌尿生殖道等部位[3]，可通過促進黏膜細胞增殖和遷移、以及調節黏附分子表達等途徑參與黏膜屏障的維持和修復[4]。新近研究發現，TFF3在多種惡性腫瘤中顯著上調，并都發揮著相似的生物學功能，與腫瘤細胞增殖、浸潤、遠處轉移以及凋亡耐受等過程密切相關，其高表達通常提示著腫瘤的高侵襲性和不良預后[5-8]。故TFF3被認為是癌基因，有望成為潛在的治療靶點。盡管TFF3在多種腫瘤組織中存在表達增高的現象，但是關于其在結直腸癌中的表達情況報道不一[9-10]，而有關TFF3如何促進結直腸癌侵襲和轉移的具體機制知之甚少。TWIST1是一種高度保守的堿性螺旋-環-螺旋（bHLH）蛋白和轉錄因子。已被證明可以調節癌癥轉移并誘導上皮間質轉化（epithelial- mesenchymal transition, EMT）[11]。 我們前期研究發現[12]，TFF3和TWIST1基因在不同轉移潛能的結直腸癌細胞系中表達逐漸增強，TFF3的過度表達可以上調Twist1的表達水平，故推測TFF3可能調控Twist1表達，并促進結直腸癌細胞的侵襲、轉移，且此作用可能與EMT有關。

為了探究TFF3表達調控的下游分子，我們通過分析穩定上調TFF3的HT29細胞的表達譜芯片發現，TFF3過表達可以顯著增強假性蛋白激酶3（tribble homolog 3, TRIB3）基因的表達。因此，我們推測TFF3可能與TWIST1轉錄調控下上調TRIB3的表達有關，并且通過與TWIST1/TRIB3通路協同作用來調節結直腸癌細胞的生物學行為。為了證實這種假設，本研究計劃構建TFF3過表達HT29細胞模型，并檢測TWIST1和TRIB3的表達情況，以深入研究它們對HT29細胞增殖、侵襲、轉移能力的影響及EMT誘導的分子機制，為結直腸癌的治療和預防提供新的靶向策略。

1 材料與方法

1.1 材料

HT29人結腸癌細胞、McCoy’s 5A培養基購自南京凱基生物技術股份有限公司；胎牛血清、Lipofectamine?3000轉染試劑購自美國Life Technologies公司；青霉素-鏈霉素雙抗（10 000 U）購自美國Hyclone公司；TFF3過表達質粒載體購自日本TaKaRa公司；CCK-8試劑盒、qRT-PCR反應試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；FastQuant RT Kit（With gDNase）反轉錄試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；RIPA裂解液、兔抗山羊IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；ECL發光試劑盒、山羊抗兔IgG購自美國Thermo Fisher Scientific公司；TFF3、TWIST1、TRIB3、E-cadherin、Vimentin、Snail和β-actin抗體均購自英國Abcam生物公司；Transwell小室購自美國CORNING公司；傷口愈合2孔插件購自德國IBIDI公司；CO2細胞培養箱購自上海力康儀器有限公司；qRT-PCR引物由新疆昆泰瑞生物技術有限公司設計并合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HT29細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的McCoy's 5A完全培養基中培養，并置于37℃、5%CO2培養箱中。當細胞融合率達到90%時，采用PBS緩沖液洗滌兩次后加入1 ml的0.25%胰酶溶液進行消化，然后按照1:2的比例進行細胞傳代。取對數生長期狀態良好的細胞用于后續實驗。

1.2.2 TFF3表達質粒構建與細胞轉染 利用PCR技術擴增TFF3基因片段，并將其與pIRES2增強的綠色熒光蛋白載體連接構建TFF3表達質粒。將HT29細胞接種于24孔板中，每孔均勻分布5×103個細胞，當細胞融合率達到60%～80%后，使用不同濃度的Lipofectamine?3000試劑將TFF3表達質粒（pIRES2-TFF3組）或空載體質粒（Vector組）轉染到HT29細胞中。隨后，在37℃、5%CO2的培養箱中培養24 h、48 h后采用熒光倒置顯微鏡對轉染效果進行觀察和拍攝。

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達 向待測HT29細胞中加入0.5 ml RIPA裂解液（RIPA:PMSF=100:1）于冰上裂解，接著使用12 000 r/min、4℃離心15 min，收集上清液，并使用BCA蛋白質檢測試劑盒測量蛋白質濃度。然后將樣品與5×SDS-PAGE混合，100℃沸水加熱變性5 min，冷卻后，12 000 r/min、4℃離心5 min，收集的上清液即為總蛋白樣品。制備SDS-PAGE凝膠，每孔上樣20 μg蛋白質樣品后進行電泳分離，并轉移到PVDF膜上，隨后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉溶液封閉膜1 h，洗膜后用一抗4℃孵育過夜，分別孵育β-actin（1:2 500）、TFF3（1:300）、Twist1（1:500）、TRIB3（1:500）、E-cadherin（1:500）、Vimentin（1:500）、Snail（1:500）。 TBST洗膜三次后將膜與二抗兔抗山羊（1:5 000）或山羊抗兔（1:10 000）在封閉溶液中室溫下孵育1 h，ECL發光顯色液顯影曝光后用化學發光成像儀進行蛋白表達水平的檢測，并分析目的蛋白的相對表達量。

1.2.4 qRT-PCR實時熒光定量分析 使用TRIzol試劑提取待測HT29細胞中的總RNA。然后，參照FastQuant RT試劑盒說明書將RNA合成單鏈cDNA，在實時熒光定量PCR試劑盒的指導下制備PCR反應體系，并以該cDNA為模板，在PCR儀中進行40個循環擴增反應。反應條件：預變性（95℃, 2 min），變性（95℃, 15 s），退火延伸（60℃, 60 s）。β-actin作為管家基因，引物序列見表1。采用公式2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.5 CCK-8細胞增殖測定 將待測HT29細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入5×103個細胞，37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。棄去培養液，加入預先配置好的10%CCK-8溶液，并置于37℃、5%CO2培養箱中培養2 h。在450 nm波長處使用酶標儀檢測OD值。

1.2.6 細胞劃痕實驗 將轉染后的待測細胞接種于培養皿中間的2孔插件上，然后讓細胞在插件區域生長至覆蓋插件表面。隨后，使用鑷子輕輕地移除插件，從而形成一條寬度為500 μm的細胞劃痕。在0、24、48和72 h時使用顯微鏡觀察細胞在劃痕處的遷移狀態并拍攝圖片。

1.2.7 Transwell實驗 實驗前，使用無血清培養基稀釋Matrigel膠至終濃度1 mg/ml，并將其加入到chamber上室底部中央垂直位置，形成基質膠。待測的HT29細胞制備成濃度為每毫升2×105個細胞的懸液，將其以每孔100 μl分別加入到帶或不帶有基質膠的chamber上室底部，而下室加入含10%胎牛血清的完全培養基。細胞在37℃、5%CO2的培養箱中培養24 h后，取出小室進行固定、透化和染色。最后，擦去上室底部膜表面上的細胞，在顯微鏡下隨機選擇5個視野計數并統計結果。

1.2.8 透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構 收集轉染48 h后的HT29細胞并用PBS洗滌兩次后去除上清液，加入2.5%戊二醛進行固定。室溫下對固定的細胞進行丙酮脫水并在1%鋨酸溶液中處理2 h，環氧樹脂包埋。包埋完成后，利用超薄切片技術將樣品切成塊狀，并進行鉛、鈾染色。最后，通過透射電子顯微鏡觀察已染色樣品并拍攝圖像。

1.3 統計學方法

采用SPSS22.0軟件進行統計學分析，數據均用（±s）表示，兩組數據間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TFF3過表達后HT29細胞中TFF3、TWIST1和TRIB3的表達

qRT-PCR結果顯示：pIRES2-TFF3組TFF3 mRNA表達水平（2.283±0.405）顯著高于對照組（1.000±0.174）（P＜0.01），提示TFF3質粒轉染后能夠穩定提高TFF3的表達并為后續實驗提供可靠基礎。同時，相較于對照組，過表達TFF3后TWIST1（0.997±0.179vs.1.715±0.090）和TRIB3（0.804±0.215vs.1.802±0.115）的mRNA表達水平均明顯上升，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖1。Western blot結果顯示：TFF3蛋白在pIRES2-TFF3組和對照組細胞中均穩定表達，且在pIRES2-TFF3組中表達增加（P＜0.01）。TFF3過表達后導致TWIST1，TRIB3蛋白表達水平明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖1 TFF3、TRIB3及TWIST1基因相對表達量Figure 1 Relative expression levels of TFF3, TRIB3, and TWIST1 genes

圖2 TFF3、TRIB3及TWIST1蛋白表達情況Figure 2 Protein expression levels of TFF3, TRIB3, and TWIST1

2.2 TFF3過表達后對HT29細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結果顯示：pIRES2-TFF3組在450 nm波長處OD值（1.618±0.016）顯著高于對照組（1.461±0.012）（P＜0.01），說明TFF3過表達提高了HT29細胞的增殖能力。

2.3 TFF3過表達后對HT29細胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell體外遷移和侵襲實驗結果顯示：與對照組（78.333±32.097、62.600±28.127）相比，pIRES2-TFF3組的HT29細胞遷移（189.400±17.353）和侵襲（168.733±22.645）能力明顯增強（P＜0.01）；劃痕實驗結果顯示：72 h后，pIRES2-TFF3組細胞劃痕幾乎消失，而對照組仍有劃痕空隙，見圖3。該實驗進一步證實了上調TFF3基因可以顯著提高HT29細胞體外遷移速度。

圖3 TFF3過表達后對HT29細胞遷移和侵襲能力的影響F i g u re 3 E f f e c t o f TFF3 overexpression on migration and invasion ability of HT29 cells

2.4 TFF3過表達后通過調控下游分子促進EMT

Western blot和qRT-PCR實驗結果顯示：相較于對照組，pIRES2-TFF3組中間充質標志物Vimentin、Snail的mRNA和蛋白質的表達量都明顯增加（P＜0.01），而上皮標志物E-cadherin的表達量降低（P＜0.05），見圖4。此外，TFF3基因過表達后的HT29細胞出現了形態變化，表現為細胞間連接減少、絨毛脫落、偽足形成、形態上細胞從圓形轉變為多角形、梭形等，見圖5。

圖4 TFF3過表達后EMT相關基因相對表達量(A)和相關蛋白表達(B)情況Figure 4 Relative expression of EMT-related genes(A) and protein expression levels(B) after TFF3 overexpression

圖5 TFF3過表達后透射電子顯微鏡圖片Figure 5 Transmission electron microscopy images after TFF3 overexpression

3 討論

TFF3作為一種分泌性蛋白，在癌癥中的作用機制比較復雜。雖然早期研究TFF3被認為具有腫瘤抑制因子的特性[13]，但近年來其促癌作用備受關注。研究資料顯示，TFF3能夠激活HIF-1α/VEGFA信號通路刺激腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并參與調節細胞新生血管生成而發揮其促癌作用[14]。此外，TFF3的過表達可抑制線粒體介導的細胞凋亡，調控細胞周期，影響腫瘤細胞凋亡程序并參與前列腺癌變[15]。多項研究表明，血清TFF3的含量還可以作為胰腺癌[16]、子宮內膜癌[17]、胃癌[18]等惡性腫瘤的新型標志物來進行檢測和篩查。Zheng等[19]研究發現，TFF3可以持續上調TWIST1蛋白表達，并依賴TWIST1的激活來促進胃癌細胞株SGC7901的侵襲和遷移。而沉默TWIST1則削弱TFF3引起的侵襲和遷移效應，從而降低腫瘤的惡性程度。

TRIB3基因為新發現的假性蛋白激酶家族成員，其編碼的蛋白作為信號轉導介質和支架蛋白，能夠與多個信號通路的關鍵分子相互作用并影響它們的穩定性和活性，在細胞生存、分化和功能中發揮至關重要的作用[20]。研究表明，TRIB3在肝癌[21]、肺癌[22]、結直腸癌[23]等實體腫瘤細胞中高表達，被認為是一種潛在的癌基因；同時，在結直腸癌組織中TRIB3的表達水平與腫瘤轉移密切相關。此外，在急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）中，TRIB3可通過與TWIST1結合并穩定高水平的TWIST1表達來促進白血病細胞的生存,并導致對全反式視黃酸（ATRA）耐藥[24]。因此，基于之前的研究結果，進一步探究TFF3、TWIST1和TRIB3分子之間的相互作用機制，對于闡明結直腸癌發生、發展和轉移的分子機制具有重要意義。本研究通過構建pIRES2-TFF3質粒并將其轉染到結直腸癌HT29細胞中，采用Western blot和qRTPCR等實驗方法分析過表達細胞模型中TRIB3、TWIST1蛋白質和mRNA水平的變化趨勢，發現TFF3過表達后，在轉錄和翻譯水平上TRIB3、TWIST1均表達上調。體外實驗結果表明，TFF3基因的上調增強了HT29細胞的增殖、遷移和侵襲能力。上述結果共同表明，在HT29結腸癌細胞系中，高表達TFF3基因能夠正向調節HT29結腸癌細胞系中TWIST1和TRIB3 mRNA及蛋白質的表達水平。這提示TWIST1和TRIB3可能作為TFF3基因調控的下游分子靶點發揮其生物學功能，進而參與結直腸癌的發生發展。

轉錄因子TWIST1是調節EMT過程的主要基因之一[11]，而EMT的發生與進展被認為是癌癥侵襲和轉移的主要途徑，故推測TFF3基因在EMT過程中具有一定的作用。為了更深入地探究其作用機制，我們研究了TFF3基因表達調控對EMT過程的影響。實驗結果表明，在mRNA和蛋白質水平上，TFF3過表達顯著促進了間充質標志物Vimentin和Snail的表達水平，并抑制了上皮標志物E-cadherin的表達。同時，我們觀察到TFF3過表達的HT29細胞發生了典型的EMT樣式形態學改變：細胞逐漸失去其上皮特有的形態和功能，并獲得更多間充質細胞特征，如細胞骨架結構的改變、細胞黏附力下降等。這種轉化結果使得癌細胞具備了更強的侵襲和遷移能力，從而促進腫瘤的轉移和擴散。因此，經實驗驗證，TFF3基因的高表達促進了EMT過程，并且TWIST1和TRIB3基因的激活可能是TFF3介導的HT29細胞增殖并通過EMT引發腫瘤細胞遷移和侵襲的原因。

綜上所述，T F F 3 的過表達可能會啟動TWIST1/TRIB3信號轉導途徑并激活EMT過程，并促使其參與腫瘤的發展和浸潤轉移，從而增強結直腸癌HT29細胞的不良生物學行為如腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等，提示其可能作為結直腸癌新的治療靶點。然而，該研究仍需要進行TFF3基因敲減和使用TWIST1轉錄因子抑制劑等實驗來進一步確認其靶向作用，以提供更全面的認識。這些結果將為結直腸癌的初期診斷及有效的靶向治療提供重要策略和依據。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。