胰腺癌患者口腔菌群多樣性組成譜的系統評價

殷智洪，張郴燕，黃海溶

0 引言

胰腺癌是一種病死率高、預后差的消化系統腫瘤[1]。由于其發病的隱匿性，大多數患者發現時已處于中晚期，五年生存率約為11%[2]。隨著全球人口老齡化，胰腺癌的發病率在許多國家和地區都呈現上升趨勢，已經成為威脅人類健康的重要公共衛生問題[3]。臨床上胰腺癌的治療方法有手術、化療、放療、靶向藥物、免疫治療等等，但治療效果有限，亟需探索胰腺癌早期檢出和治療的方法。

口腔微生物群在人類口腔中共有700多種細菌，它們不僅維持口腔內環境的穩定，對于維持機體健康也發揮著重要作用[4]?？谇痪旱亩鄻有允侵冈诳谇粌榷ㄖ车募毦N類數，口腔菌群多樣性組成譜是指在口腔內定殖的細菌群落處于動態平衡的狀態，這種狀態有助于消化吸收、生長發育、能量代謝、免疫調控等，是維持身體健康的重要微環境。隨著微生物組學技術的發展，口腔菌群與各種疾病之間的關系成為研究的關注點，其不僅與牙周病、齲齒和口腔癌等口腔疾病密切相關[5]，與遠處器官的癌變也有關，如大腸癌、食管癌和胰腺癌等[6-8]。有研究發現，胰腺癌患者與健康對照的口腔菌群存在差異，但是多樣性組成譜的研究結果并不完全一致[9-15]。為了獲得更可靠的胰腺癌患者口腔菌群的特征，本研究系統評價了胰腺癌患者口腔菌群多樣性組成譜，以期為進一步開發胰腺癌早診早治的新方法提供參考。

1 資料與方法

1.1 納入和排除標準

納入標準：（1）研究類型：橫斷面研究；（2）研究對象：經腫瘤標志物、影像學檢查或病理檢測臨床診斷為胰腺癌的新發病例，對照為健康人群；年齡、性別均不限；（3）研究方法：采集研究對象唾液樣本立即凍存，通過Illumina MiSeq、HiSeq等平臺進行口腔菌群16SrRNA、16SrDNA或宏基因組測序；（4）分析指標：Shannon指數、Simpson指數、Chao1指數、相對豐度。排除標準：（1）重復發表或數據相同的文獻；（2）非中、英文文獻；（3）數據不詳或有誤的文獻。

1.2 文獻檢索策略

檢索The Cochrane Library、PubMed、Web of Science、Embase、CNKI、CBM、萬方和維普數據庫，搜集胰腺癌患者口腔菌群多樣性組成譜的橫斷面研究，檢索時限均從建庫至2023年7月15日。檢索采用主題詞與自由詞相結合的方式進行，并根據各數據庫特點進行調整。同時檢索納入研究的參考文獻，以補充獲取相關資料。英文檢索詞包括：Pancreatic Neoplasms、Pancreas Neoplasms、Cancer of Pancreas、Oral Microbiome、Oral Microflora、Oral Microbial Community、Oral Microbiota、Salivary Microbiota、Saliva Sample等。中文檢索詞包括：胰腺腫瘤、胰腺癌、口腔微生物組、口腔菌群、口腔微生物群落、唾液細菌、唾液樣本等。

1.3 文獻篩選和資料提取

由2名研究者獨立篩選文獻、提取資料并交叉核對。如有分歧，則通過討論或與第三方協商解決。文獻篩選時首先閱讀文題，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀摘要和全文以確定是否納入。如有需要，通過郵件和（或）電話聯系原始研究作者獲取未確定但對本研究非常重要的信息。資料提取內容包括：（1）納入研究的基本信息（第一作者、發表年份、樣本量等）；（2）研究對象的基本特征（年齡、性別等）；（3）測序方法、測序平臺；（4）研究結果。

1.4 納入研究的偏倚風險評價

偏倚風險評價采用AHRQ量表，該量表共有11個條目，其中條目11“如果有隨訪，查明預期的患者不完整數據所占的百分比或隨訪結果”不適用本研究，各條目分別用“是”、“不清楚”、“否”進行判斷，“是”記1分，“不清楚”和“否”記0分，≥7分為高質量，4～7分為中等質量，0～3分為低質量。

1.5 統計學方法

采用RevMan5.4軟件對ɑ多樣性的Shannon指數和Simpson指數進行Meta分析。計量資料采用均數差（mean difference, MD）或標準化均數差（standardized mean difference, SMD）為效應分析統計量，并計算95%CI。納入研究結果間的異質性采用χ2檢驗進行分析（檢驗水準為α=0.1），同時結合Ι2定量判斷異質性大小。若各研究結果間無統計學異質性（Ι2≤50%,P≥0.10），則采用固定效應模型; 若各研究結果間存在統計學異質性（Ι2＞50%,P＜0.10），則進一步分析異質性來源，在排除明顯異質性的影響后，采用隨機效應模型進行Meta分析。Meta分析的檢驗水準設為α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 文獻篩選流程及結果

通過文獻檢索共查找到681篇相關文獻，其中PubMed（n=176）、Web of science（n=369）、EMbase（n=77）、The Cochrane Library（n=11）、CNKI（n=20）、CBM（n=4）、萬方數據庫（n=20）、維普數據庫（n=4）。最終納入7項橫斷面研究進行系統評價，過程見圖1。

圖1 文獻篩選流程Figure 1 Flowchart of literature screening

2.2 納入研究的基本特征與偏倚風險評價結果

納入的7項研究中，3項研究對象是中國人，3項是美國人，1項是日本人。共納入187例胰腺癌患者，其中男103例，女84例；健康對照共440例，其中男215例，女225例。有6個研究的測序方法是16SrRNA，1項研究采用宏基因組測序；有4項研究的測序平臺是Illumina MiSeq，有1項研究的測序平臺是Illumina Novaseq6000，有1項研究的測序平臺是Illumina HiSeq，有1項研究的測序平臺未提供，見表1。

表1 納入研究的基本特征Table 1 Basic characteristics of articles included

采用AHRQ量表進行偏倚風險評價，結果顯示3項為8分，3項研究的總分均為7分，1項為6分。根據評價結果，有6項是高質量的研究，1項是中等質量研究，見表2。

表2 納入研究的偏倚風險評價結果Table 2 Bias risk assessment of included studies

2.3 口腔菌群ɑ多樣性Shannon指數的Meta分析結果

Shannon指數的Meta分析共納入3項研究[12-13,15]，由于Ι2=90%，故采用隨機效應模型。結果顯示，與健康對照組相比，胰腺癌患者腸道菌群Shannon指數降低（SMD=-0.02, 95%CI: -1.01～0.97,P=0.97），差異無統計學意義。逐一剔除每個研究進行敏感度分析，結果顯示每次剔除后結果未發生顯著變化，提示結果較穩定，見圖2。

圖2 口腔菌群Shannon指數的Meta分析Figure 2 Meta analysis result of Shannon index of oral microbiota

2.4 口腔菌群ɑ多樣性Simpson指數的Meta分析結果

Simpson指數的Meta分析共納入2項研究[13,15]。由于Ι2=0，故采用固定效應模型，結果顯示，與健康對照組相比，胰腺癌患者腸道菌群Simpson指數降低（SMD=-1.04, 95%CI: -1.42～-0.66,P＜0.001），差異具有統計學意義，見圖3。

圖3 口腔菌群Simpson指數的Meta分析Figure 3 Meta analysis result of Simpson index of oral microbiota

2.5 口腔菌群相對豐度分析

胰腺癌患者與健康對照比較，在門、屬、種水平相對豐度有差異的口腔菌見表3～4，其中有6項研究結果顯示，胰腺癌患者口腔菌群中厚壁菌門相對豐度較高，3項研究顯示普氏菌屬較高，2項研究顯示羅斯氏菌屬較高，2項研究顯示鏈球菌屬較高；有2項研究顯示胰腺癌患者口腔菌群中變形菌門相對豐度較低，4項研究顯示奈瑟菌屬相對豐度較低，2項研究顯示嗜血桿菌屬較低，2項研究顯示卟啉單胞菌屬較低，2項研究顯示副流感嗜血桿菌相對豐度較低。本研究結果顯示厚壁菌門、普氏菌屬、奈瑟菌屬的變化情況在多項研究中結果一致，見表5。

表3 胰腺癌患者相對豐度上升的口腔菌Table 3 Oral bacteria with increased relative abundance in patients with pancreatic cancer

表4 胰腺癌患者相對豐度下降的口腔菌Table 4 Oral bacteria with decreased relative abundance in patients with pancreatic cancer

表5 胰腺癌患者主要口腔菌相對豐度變化情況Table 5 Changes in relative abundance of major oral bacteria in patients with pancreatic cancer

3 討論

Shannon指數和Simpson指數均能反映菌群ɑ多樣性，Simpson指數主要體現物種的均勻度，Shannon指數對物種豐富度更敏感[16]。本研究發現，胰腺癌患者與健康對照相比，Shannon指數顯示口腔菌群豐富度雖有下降，但差異無統計學意義。進一步分析發現Shannon指數Meta分析時研究的異質性較大，其原因可能與納入的研究地區、研究對象的差異有關，經敏感度分析，提示結果較穩定。本研究發現反映口腔菌群均勻度的Simpson指數在胰腺癌患者中顯著降低，與健康對照比較差異有統計學意義，可能是胰腺癌細胞生長增殖對機體的營養需求和各類物質代謝與正常細胞有差異[17]，會導致部分口腔菌群的生長受到抑制或促進，而導致口腔菌群的均勻度有差異。

本研究發現厚壁菌門、普氏菌屬、鏈球菌屬等口腔菌群在胰腺癌患者中相對豐度升高，而奈瑟菌屬相對豐度下降。目前厚壁菌門、普氏菌屬、奈瑟菌屬等口腔細菌與胰腺癌的研究仍處于豐度層面，具體作用機制仍不明確。厚壁菌門是人類口腔菌群中占比較高的一個門類，門下有許多細菌，研究者更關注各菌屬與胰腺癌的關聯。一項胰腺癌與腸道菌群系統評價[18]結果表明，普氏菌屬在胰腺癌患者中的相對豐度較高，與本研究結果一致。普氏菌屬是一類革蘭氏陰性菌，目前發現普氏菌在泌尿生殖系統感染、多發性硬化癥和類風濕關節炎中都存在致病作用[19]，未發現有普氏菌與胰腺癌是否存在因果關聯的研究，提示有必要進一步研究普氏菌與胰腺癌的關系。奈瑟菌屬是一群革蘭染色陰性雙球菌，其中只有腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌對人體有致病性[20]；在另一項腸道微生物群與胰腺癌的系統評價中[21]也發現胰腺癌患者中奈瑟菌屬相對豐度下降，進一步說明奈瑟菌屬與胰腺癌存在相關性，值得進一步研究。鏈球菌屬一類革蘭陽性球菌，屬中的肺炎鏈球菌和A群鏈球菌已發現對人類有致病性[22]；本研究發現鏈球菌屬在胰腺癌患者中有較高相對豐度，Yang等[23]曾研究發現鏈球菌屬可作為胰腺癌的生物標志物，說明鏈球菌屬也與胰腺癌存在相關性，需進一步探討。綜上研究發現，未來需更多研究進一步驗證普氏菌、奈瑟菌、鏈球菌在胰腺癌發生發展中的作用，并深入探討其機制，為開發早診早治胰腺癌的新方法提供科學證據。

本研究的局限性：（1）受限于納入研究的數量、報告數據的不全，僅對口腔菌群α多樣性部分指標進行定量分析，未能全面分析口腔菌群的多樣性；（2）研究均為橫斷面研究，研究結果只能提示口腔菌群多樣性組成譜與胰腺癌有關聯，不能驗證兩者間的因果關系。

綜上所述，現有證據表明胰腺癌患者口腔菌群多樣性組成譜存在一定的特征。與健康對照者相比，定量分析中Simpson指數反映的多樣性顯著降低；定性分析中厚壁菌門、普氏菌屬、羅斯氏菌屬、鏈球菌屬的相對豐度較高，而變形菌門、奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、卟啉單胞菌屬、副流感嗜血桿菌的相對豐度較低。受限于納入研究的數量、質量、報告數據不全等問題，本研究結果尚待更多高質量研究予以驗證。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。