一種具有識別Hg2+和ClO-熒光探針的設計和應用

廖元淏， 王帥， 陳婉慧， 馮華杰， 陳光英， 何文英*

（1. 熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室， 海南 ?？?571158；2. 海南師范大學 化學與化工學院， 海南 ?？?571158）

1 引言

許多重金屬離子如Cd2+、Cr2+、Hg2+、Pb2+等不僅對人體有害，分布在水體或土壤中也不能分解或降解[1-2]。 其中Hg2+就是一種很典型的重金屬污染物，可在水中被微生物轉化為甲基汞，通過食物鏈進入人體并在人體內蓄積，生物體攝入后可導致正常的生理功能紊亂，引起消化道、腎臟、大腦或神經系統等的病變；汞沉入水中后可經過水生食物鏈快速積累，對水體環境造成極大的污染[3-4]。次氯酸/次氯酸（HOCl/ClO-）在日常生活中可用于殺菌、染料脫色、土壤氧化污染的處理等；在生物體內控制參與多種生理過程, 如組織修復、細胞生命周期和防御系統中的抗菌活性等。但過量的ClO-會導致如肺部病變、心血管疾病或動脈粥樣硬化等多種人體疾病[5-6]。因而通過研究新合成的1, 2, 3-三氮唑衍生物對汞離子或ClO-的特征顯色識別和建立在生理條件下檢測這兩種離子的方法，實現在活體細胞中的應用，對環境和人類的生命安全具有非常重要的理論與實際意義。

離子的檢驗方法多種多樣，取決于所要檢測的離子種類以及分析的具體需求。常見的離子檢驗方法：滴定法（Titration），原子吸收光譜法, 離子選擇性電極法（Ion-selective electrode, ISE）, 質譜法，色譜法,電化學法[7-8]。而熒光光譜法具有良好的生物相容性、較低的毒性和易于結構修飾而得到廣泛的發展，其作為一種分析工具, 具有選擇性高、操作簡單、消耗少、成本低等優點, 在生物成像方面應用最為廣泛，可對化學及生物樣品進行定性和定量測定，在藥學、農學、食品工業等領域已有眾多的應用[2-6,9-10]。羅丹明類化合物是具有獨特“開-關”結構的熒光化合物。當金屬離子被識別時，螺內酰胺環除具有優異的光化學和光物理性質外，還具有特定的電子重排形成一個大而穩定的剛性平面，在這個過程中熒光和顏色的變化是肉眼識別的基礎。羅丹明類衍生物因具有摩爾消光系數高、光穩定性好、熒光量子產率高、較大的激發和發射波長等優異的光學性能，被廣泛地應用于離子探針的設計[11-13]。近年來，具有雙功能的熒光探針也越來越受到關注, 可用來同時檢測生物體等樣品中的陰陽離子或其他小分子[14-15]。

1,2,3-三氮唑是一類非常重要的含氮雜環化合物，具有如抗菌、抗結核病、抗病毒、抗瘧疾、抗腫瘤等多種生物活性[16]，易與其他取代基合成多種類型的衍生物，在有機化學、材料化學、環境科學及醫藥學等方面已顯示出其特有的物理化學性質、藥理活性和廣闊的應用前景[17-18]。有些合成的三氮唑衍生物可與某些金屬離子特異性鍵合，顯示如良好的催化性等多方面的功能[9,19-20]，尤其是一些金屬離子與三氮唑通過發生不同的顯色反應，可作為金屬離子的探針進行定性或定量分析，在化學、生物、環境科學及其他領域具有眾多應用[21]。因此，基于1，2，3-三氮唑的低毒性和良好生物活性，開發1,2,3-三氮唑-羅丹明類熒光探針具有良好的應用價值。

本文通過點擊化學方法合成了一種新的1,2,3-三氮唑羅丹明B衍生物L2。L2具有檢測兩種陰陽離子的熒光探針性質；探針L2不僅顯示出良好的熒光性能，且對Hg2+和ClO-有高選擇性和靈敏性的識別；并可用于HeLa細胞中Hg2+和ClO-的細胞成像。

2 實驗

2.1 儀器與試劑

測試儀器：400 MHz AV-400型超導核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），1H NMR和13C NMR分別以CDCl3-d/DMSO-d6為溶劑, 以四甲基硅烷（TMS）為內參照；Agilent 1100-Bruker Esquire HCT高分辨質譜儀（美國Agilent公司-德國Bruker公司離子質量分析器）；U3900/3900H紫外可見光分光光度計（日本日立公司）；F-7000熒光分光光度計（日本日立公司）; MCO-15A型CO2細胞培養箱（日本SANYO）；Nikon TS100-F倒置熒光顯微鏡（日本尼康）；SW-CJ-1F凈化工作臺（蘇潔凈化）；6孔細胞培養板（Costar公司）；PHSJ-3F型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

本實驗所用試劑均為商品化的分析純或化學純產品, 未經純化直接使用。所使用的超純水為實驗室自制。19種金屬離子Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+、Pd2+、Sn4+和14種陰離子ClO-、S2-、SCN-、CN-、CO32-、SO42-、ACO-、NO2-、NO3-、Br-、F-、Cl-、ClO2-濃度均為1000 μg/mL，購自國藥化學試劑公司，均不含結晶水。其中，Mo6+所用緩沖溶液為H2O/tr.NH4OH，W6+所用緩沖溶液為0.2%（v/v）HNO3和2%（v/v）HF，Hg2+、Cd2+和Pb2+所用緩沖溶液均為HNO3（1.0 mol/L），Ag+、Pd2+和Sn4+所用緩沖溶液均為5%（v/v） HNO3，Cu2+和Co2+所用緩沖溶液均為3%（v/v） HNO3，Ca2+和Mg2+所用緩沖溶液均為5%HCl，Fe3+、Zn2+和Al3+所用緩沖溶液均為10% HCl，Ni2+所用緩沖溶液均為2%（v/v） HNO3，Mn2+所用緩沖溶液為5%（v/v） H2SO4，其他的陽離子和陰離子所用的緩沖溶液均為H2O。人宮頸癌細胞株HeLa細胞由海南師范大學熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室提供，DMEM培養基及噻唑藍購自北京索萊寶公司，胎牛血清購自浙江天杭生物公司。

2.2 探針L2的合成路線及方法

首先合成了2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二乙酸乙酯，再通過偶聯反應生成了2-苯基-2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二乙酸乙酯，然后經過水解、酰氯反應、與羅丹明酰肼的酰胺縮合反應等，合成了化合物L2（圖1）。

圖1 探針L2的合成Fig.1 Synthesis of the probe L2

2.2.1 2H-1，2，3-三氮唑-4，5-二乙酸乙酯的合成

稱取2.5 g（14.69 mmol）丁炔二酸二乙酯在250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL二甲基亞砜作溶劑，在室溫下攪拌半小時后，再稱取1.91 g（29.38 mmol）NaN3緩慢加入圓底燒瓶中，然后升溫至80 ℃，通過TLC監測反應。反應完畢后，冷卻至室溫，緩慢加入100 mL次氯酸鈉水溶液攪拌猝滅反應，然后使用3 mol/L 鹽酸溶液調節pH值為2左右，反應體系顏色由深棕色變為紅色；使用乙酸乙酯和水萃取，有機相使用飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，柱層析PE/EA=2∶1，即可得到黃色油狀液體。1H NMR（400 MHz, 氘代氯仿）δ分別為4.47（q,J= 7.1 Hz, 4H）, 1.41（t,J=7.1 Hz, 6H） （補充文件圖S1），13C NMR（101 MHz, 氘代氯仿）δ分別為160.36, 139.20, 62.90,14.54 （補充文件圖S2）。

2.2.2 2-苯基-1，2，3-三氮唑-4，5-二羧酸的合成

稱取2H-1,2,3-三氮唑-4,5-二乙酸乙酯1.60 g（7.50 mmol）到100 mL圓底燒瓶中，加入1.20 g（15 mmol）吡和40 mL 四氫呋喃，攪拌均勻，稱取1.36 g（7.5 mmol）醋酸銅到圓底燒瓶中，再稱取1.83 g（15.0 mmol）苯基硼酸緩慢加入圓底燒瓶中，使整個體系處于氧氣環境下，然后升溫至60 ℃反應12 h，通過TLC監測反應。反應結束后，用乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鈉干燥，柱層析PE/EA=10∶1，粗品加入無水乙醇40 mL，稱取0.84 g（15 mmol）氫氧化鉀固體，攪拌均勻后加熱回流3 h。通過TLC監測反應結束，旋蒸后加熱少量水以溶解產物。再使用濃鹽酸調節pH值為1，出現大量白色固體析出，抽濾，干燥后即可得到白色固體產物。1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ分別為8.05（d,J= 7.6 Hz, 2H）,7.62（t,J= 7.8 Hz,2H）, 7.53（t,J= 7.4 Hz, 1H）（補充文件圖S3），13CNMR（101 MHz, DMSO-d6）δ分別為161.69,142.18, 138.88, 130.42, 129.79, 119.85（補充文件圖S4）。

2.2.3 2-苯基-1，2，3-三氮唑-4，5-二酰氯的合成

稱取200 mg的2-苯基-三氮唑-4,5-羧酸，然后加入2 mL過量氯化亞砜，加熱回流3 h，TLC監測反應結束后，蒸出多余的氯化亞砜，即可得到白色固體產物，粗品直接用于下一步。

2.2.4 羅丹明B酰肼的合成

參照文獻[22]，在100 mL圓底燒瓶中，分別加入30 mL乙醇與5.0 g（10.5 mmol）羅丹明B，在室溫下劇烈攪拌，然后緩慢滴入80%的水合肼（12 mL）。滴加結束，攪拌回流，TLC檢測反應完畢后，冷卻溶液，再減壓蒸去乙醇。在燒瓶中加入1 mol/L的HCl 50 mL，得到橙紅色溶液；在不斷攪拌下，慢慢加入1 mol/L NaOH溶液，調節pH到9～10之間至出現大量白色沉淀；進行抽濾后用少量水洗滌濾餅3次；再通過真空干燥，得到羅丹明B酰肼。1H NMR（400 MHz,DMSO-d6）δ分別為7.76（d,J= 5.8 Hz, 1H）, 7.53～7.41（m, 2H）, 6.98（d,J= 5.9 Hz, 1H）, 6.35（d,J= 16.6 Hz, 6H）, 4.26（s, 2H）, 3.33～3.25（m, 8H）, 1.08（t,J= 7.0 Hz,12H）（補充文件圖S5）；13C NMR（101 MHz, DMSOd6）δ分別為165.82,153.49,152.33,148.60,132.89, 128.60, 128.13, 123.93, 122.65, 108.27,105.83, 97.89, 65.28, 44.16, 12.90（補充文件圖S6）。

2.2.5 探針L2的合成

將上述2-苯基-1,2,3-三氮唑-4,5-二酰氯粗品稱取0.23 g（0.85 mmol），加入10 mL二氯甲烷攪拌溶解后，緩慢加入0.77 g（1.7 mmol）的羅丹明B酰肼，然后再滴加過量三乙胺作縛酸劑，常溫下攪拌12 h以上。通過TLC監測反應結束后，除去溶劑二氯甲烷后用乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鈉干燥，柱層析PE/EA=1∶1，即可得到白色固體產物L2（產率34%）（如圖1）。1H NMR（400 MHz, 氘代氯仿）δ分別為10.00（s, 2H）,7.93（m,3J= 9.5,6.8, 1.8 Hz, 4H）,7.48～7.41（m, 4H）,7.39～7.34（m, 3H）, 7.10～7.05（m, 2H）, 6.75（d,J= 8.8 Hz,4H）, 6.32（s, 4H）, 6.26（d,J= 8.2 Hz, 4H）, 3.24（d,J= 6.9 Hz, 16H）, 1.08（t,J= 7.0 Hz, 24H）（補充文件圖S7）；13C NMR（101 MHz, CDCl3）δ164.46（s）,157.44（s）, 153.43（s）, 152.71（s）,152.65（s）,148.93（s）,139.87（s）,138.44（s）,133.05（s）, 133.03（s）,129.27（s）,128.88（s）,128.03 （s）, 123.87（s）,123.47（s）,120.03（s）,114.25（s） 107.94（s）, 104.23（s）, 97.87（s）44.31（s）, 12.67（s）（補充文件圖S8）。質譜檢測HRMSm/z（[M+H]+）: 計算值1110.5276; 實驗值:1110.5261（補充文件圖S9）。

2.3 實驗試劑配制

標準離子的配制：取一定體積Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+、Pd2+、Sn4+金屬陽離子標準溶液和ClO-、S2-、SCN-、CN-、CO32-、SO42-、AcO-、NO2-、NO3-、Br-、F-、I-、Cl-、ClO2-陰離子標準溶液于10 mL比色管中，加去離子水定容配制為1.0×10-3mol/L標準溶液。

探針L2溶液的配制：稱取55.5 mg的探針L2于50 mL的容量瓶中，使用DMSO定容配制為1.0×10-3mol/L的溶液。

細胞相關溶液的配制：DMEM完全培養基：購買市售培養基溶液，按總體積10%的體積加入滅活的胎牛血清，再加入1%的雙抗；PBS緩沖液：使用電子分析天平稱取NaCl：8.0 g，KCl：0.2 g，KH2PO4：0.24 g，Na2HPO4：1.44 g，用超純水定容1 L，在120 ℃高壓滅菌器中滅菌30 min；胰蛋白酶：使用電子分析天平結晶胰島素粉末2.50 g，高壓滅菌后的PBS緩沖液1 L，充分攪拌溶解后，用0.22 μmol/L的滅菌過濾器過濾溶液進行滅菌；MTT溶液：使用電子分析天平稱取MTT粉末0.50 g，用PBS緩沖液100 mL充分溶解后，分裝在1.5 mL EP離心管中，放置-5 ℃冰箱中避光冷凍待用。

2.4 光譜實驗測定

紫外吸收光譜測定：設置波長掃描范圍為250～700 nm，掃描速度為快，掃描間隔為1 nm，取60 μL DMSO到1 cm石英比色皿中，再加入60 μL的探針（1.0×10-3mol/L），用DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v）緩沖溶液或甲醇溶液定容3 mL，進行波長掃描，再分別逐漸加入Hg2+或ClO-進行測定。

熒光光譜測定：設置激發波長為560 nm（檢測Hg2+）和555 nm（檢測ClO-）, 掃描發射波長為570～700 nm，激發和發射狹縫寬度均為5.0 nm，電壓為700 V，響應時間為0.1 s 掃描速度為1200 nm/min。取60 μL的探針（1.0×10-3mol/L），用DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v）緩沖溶液定容3 mL，進行波長掃描。

2.5 理論計算

所有幾何優化和能量計算都是使用B3LYP泛函在Gaussian 09中進行的，采用密度泛函理論DFT方法在6-311G（d）基組下進行了基態的全優化, 用含時密度泛函TD-DFT對最低激發態的構型進行全優化，Hg的基集為LANL2TZ, H、C、N和O的基集為6-311G（d）[23]。

2.6 細胞毒性測定

將HeLa細胞經過細胞復蘇、細胞凍存、細胞傳代處理，取對數生長期的HeLa細胞，通過細胞計數，調整細胞濃度為2.5×104/孔；將DMEM細胞培養液加入到96孔板中，每孔100 μL，在37 ℃5% CO2培養箱中培養24 h；按梯度濃度將L2濃度調整為0,10,20,40,60,80,100 μmol/L，使得DMSO加入的體積在細胞中含量小于4‰即可。依此方法將HeLa細胞分為空白組和實驗組，實驗組按照上述濃度梯度每孔加入100 μL，空白組只加培養液100 μL，每個濃度均設置6個復孔；然后放入細胞培養箱中繼續培養24 h后，每孔加入20 μL MTT試劑，放入細胞培養箱中繼續培養4 h，使得MTT還原成藍紫色結晶甲瓚；棄去培養液，每孔加入200 μL DMSO輕微震蕩使其充分溶解；通過酶標儀測定570 nm處吸光值。重復實驗3次，計算L2對HeLa細胞的毒性。

2.7 細胞成像實驗

取對數生長期的HeLa細胞，將細胞培養液加入到35 mm細胞培養皿中，在37 ℃ 5% CO2培養箱中培養24 h，吸取培養液，用PBS沖洗細胞3次；加入探針L2（20 μmol/L）培育1 h后，用PBS沖洗3次；除去未進入細胞的探針，隨后分別加入濃度均為20 μmol/L Hg2+和ClO-溶液，繼續培養0.5 h后，用PBS洗滌3次后，進行熒光成像。

3 結果與討論

3.1 紫外-可見光譜分析

通過分析有機化合物的紫外光譜可初步獲得分子層面的結構信息。為篩選探針L2對不同金屬離子和陰離子溶液中的識別能力，在DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, 20 μmol/L）溶液中，分別測定了L2對Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+、Co2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+、Pd2+、Sn4+作用的紫外吸收光譜（見圖2（a）），以及在甲醇溶液中對ClO-、S2-、SCN-、CN-、CO32-、SO42-、AcO-、NO2-、NO3-、Br-、F-、I-、Cl-、ClO2-作用的紫外吸收光譜（見圖2（b））。由于探針L2為無色溶液，故選擇純水做空白參比。從圖2可以看出，在設置波長為400～700 nm范圍內，吸收峰的起止波長和加入前后最大吸收波長處強度的變化不大，L2+Hg2+體系在565 nm處有最大紫外吸收峰，L2- ClO-體系在555 nm處有最大紫外吸收峰，說明Hg2+和ClO-的存在使得L2的分子結構發生了一定的變化而產生了兩個新的吸收峰。同時，兩組不同溶液體系的顏色由無色透明液體轉變為粉紅色，而其他離子的加入不會引起溶液中明顯的顏色變化。實驗結果表明，探針L2對Hg2+和ClO-具有較高的選擇性，L2與Hg2+或ClO-的相互作用影響了羅丹明基團的吸收，導致其螺環結構發生開環，使得在565 nm和555 nm處出現吸收增強的現象。

圖2 （a）在DMF/Tris-HCl溶液（1∶1，v/v，pH=6.0）中，不同金屬離子存在時，L2 （20 μmol/L）的紫外可見吸收光譜；（b）在MeOH溶液中，不同陰離子存在時，L2 （20 μmol/L）的紫外可見吸收光譜Fig.2 （a）UV-Vis spectra of L2（20 μmol/L） in the presence of different metal ions（20 μmol/L） in DMF/Tris-HCl（1∶1， v/v，pH=6.0）. （b）UV-Vis spectra of L2（20 μmol/L） in the presence of different anions（20 μmol/L） in MeOH

3.2 熒光光譜分析

為探究L2和不同陰陽離子的熒光性質，在DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, 20 μmol/L）溶液中測定了L2與各種金屬離子的熒光光譜，以及在MeOH溶液中L2與各種陰離子的熒光光譜，所有加入離子濃度均為等量（見圖3）。從圖3可見，當激發波長為563 nm時，L2沒有出現明顯的熒光發射峰，這也是羅丹明結構的一個典型特點；但當其與不同的陰陽離子相互作用時，只有Hg2+使體系的熒光強度在585 nm處出現明顯增強（圖3（a）），也只有ClO-使體系的熒光強度在576 nm處有顯著增大（圖3（b）），而其他金屬離子或陽離子幾乎沒有帶來變化。同時，伴隨著熒光光譜峰型和強度的變化，只有Hg2+-L2體系或ClO--L2體系的顏色也呈現出裸眼可見的粉紅色溶液（如圖2中插圖所示），而在相同條件下的其他離子-L2體系則沒有顏色的變化。這再次表明探針L2在兩種溶液體系中對Hg2+和ClO-具有高選擇性和特異性。通常情況下，具有閉環酰肼結構的羅丹明及其衍生物是無色或非熒光的，而開環酰肼結構的羅丹明可產生較強的熒光并伴隨溶液呈現粉色的顏色變化[24-25]。據此推測本實驗中Hg2+或ClO-可能使L2分子中的羅丹明基團從閉環的酰肼結構轉換為開環的酰肼結構，從而形成了Hg2+-L2或ClO--L2兩種新的配合物，也導致溶液有粉色的變化。

圖3 （a）在DMF/Tris-HCl（1∶1，v/v）中，L2（20 μmol/L）和不同金屬離子（20 μmol/L）存在的熒光光譜，λex=560 nm；（b）MeOH中，L2（20 μmol/L）和不同陰離子（20 μmol/L）存在的熒光光譜，λex=555 nmFig.3 Fluorescence spectra of L2（20 μmol/L） in the presence of different metal ions（20 μmol/L） in DMF/Tris-HCl（1∶1，v/v）（a）（λex=560 nm） and in the presence of different anions（20 μmol/L） in MeOH（b）（λex=555 nm）， respectively

3.3 探針L2對Hg2+和ClO-的選擇性和抗干擾性分析

優良的選擇性也是熒光探針的重要性能之一。圖4為探針L2分別對Hg2+（圖4（a））和ClO-（圖4（b））的選擇性實驗。圖4（a）為在DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, pH=6.0，20 μmol/L）溶液中，加入金屬離子（Hg2+、Ag+、W6+、Cu2+、Zn2+、Al3+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、Cd2+、CO2+、Fe3+、Mo6+、K+、Mg2+、Ni2+、Na+、Pd2+、Sn4+）時測定不同體系的熒光強度，可看出僅僅當Hg2+與 L2相互作用時，在585 nm處的熒光強度約為1500，且溶液顏色呈現粉紅色；而加入其他金屬離子后，這些體系的熒光強度則沒有顯示出明顯的增大和顏色的變化。從圖4（b）可看出，ClO-與L2相互作用也發生相似的情況，在甲醇（20μmol/L）溶液中加入不同的陰離子（ClO-、S2-、SCN-、CN-、CO32-、SO42-、ACO-、NO2-、NO3-、Br-、F-、I-、Cl-、ClO2-）時，在576 nm處的熒光強度約為1100，且溶液顏色呈現較深的粉紅色，而加入其他陰離子后的體系則沒有引起明顯的熒光強度和顏色變化。這些結果表明，相比實驗中絕大多數的陰陽離子，L2對Hg2+和ClO-有較高的選擇性，可以特異性地裸眼識別Hg2+和ClO-。

另外，由于L2是分別在DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v,pH 6.0, 20 μmol/L）和MeOH（20 μmol/L）溶液中對Hg2+和ClO-顯示出高選擇性和靈敏性，盡管L2-Hg2+和L2-ClO-體系的最大熒光強度分別在585 nm處（圖3（a））和576 nm（圖3（b）），但不同溶劑的體系可以避免同時測定Hg2+和ClO-時的相互干擾效應。

為評估探針在共存離子情況下的抗干擾性，進行了離子競爭實驗. 分別在有探針L2存在的DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, 20 μmol/L）溶液中加入Hg2+和MeOH（20 μmol/L）溶液中加入ClO-測試體系的熒光強度，再分別加入等量的同離子再測試其熒光強度（圖5）。從圖5可看出，在相同的實驗條件下，加入Hg2+和ClO-體系中測得的熒光強度和其他金屬離子或陰離子與Hg2+或ClO-共存時不同體系的熒光強度有略微的波動，但變化不大，說明這些離子的存在對探針檢測Hg2+和ClO-沒有明顯的干擾。因此，探針L2可以作為高選擇性的Hg2+和ClO-熒光探針。

圖5 （a）在DMF/Tris-HCl（1∶1，v/v，pH=6.0）中，L2對Hg2+（20 μmol/L）及與其他離子（20 μmol/L）共存時的熒光強度，λex=560 nm；（b）在MeOH（20 μmol/L）中，L2對ClO-（20 μmol/L）及與其他離子（20 μmol/L）共存時的熒光強度，λex=555 nmFig.5 （a）The fluorescent selectivity of L2 toward Hg2+（20 μmol/L） coexisting with other metal ions（20 μmol/L） in DMF/Tri-HCl（1∶1， v/v， pH=6.0）， λex=560 nm. （b）The fluorescent selectivity of L2 toward ClO-（20 μmol/L） coexisting with other anions（20 μmol/L） in MeOH， λex=555 nm

3.4 探針L2對Hg2+和ClO-的定量分析

基于以上紫外和熒光光譜的定性分析結果，暗示L2可以被開發利用作為定量分析Hg2+和ClO-的一種新型探針。我們首先評估了pH值對探針L2熒光強度的影響，由于本研究檢測Hg2+時使用DMF/H2O（1∶1）體系，而檢測ClO-時在MeOH體系完成，因此以下只分析L2與Hg2+體系的pH值適用范圍。我們測試了L2和Hg2+-L2體系在pH值3.0～10.0范圍內熒光強度的變化曲線（補充文件圖S10），從圖S10可見，在pH＜4.0的較強酸性條件下，L2本身會產生微弱熒光；而在4.0＜pH＜10.0范圍內，L2的熒光愈加減弱并接近消失。這些結果表明，在pH值3.0～10.0范圍內，L2結構中的羅丹明是一種閉環的酰肼結構。相應地，當在L2中加入Hg2+后，pH值在3.0～7.0范圍內熒光強度很高，尤其是pH=6.0時熒光強度最大。雖然pH在6.0～7.0之間體系的熒光強度有所降低，但均說明L2結構中的羅丹明酰肼鍵處于開環狀態。當pH值從7.0調節為8.0時，體系熒光強度驟然下降到幾乎沒有熒光，這可能是因為OH-跟Hg2+結合形成了沉淀，而無法跟L2發生絡合。因此，本研究中所有的光譜實驗均選擇在pH值為6.0的DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v）溶液體系中進行。另外，選擇熒光光譜分析的時間-熒光強度模式，測定了L2對Hg2+和ClO-的響應時間及穩定時間（補充文件圖S11）。實驗結果表明，兩個體系發生顯色反應的時間很短，且L2與Hg2+或ClO-作用后比較穩定，在1800 s內熒光強度沒有發生明顯的增加或下降趨勢，這說明探針L2可以在水溶液或甲醇溶液中對Hg2+或ClO-進行實時分析。

良好的靈敏度是離子探針的一個重要指標。通過熒光滴定實驗確定探針L2對Hg2+和ClO-的靈敏度。分別在存在L2（20 μmol/L）的DMF/Tris-HCl（1∶1,v/v, 20 μmol/L）、MeOH溶液中，逐漸加入濃度梯度的Hg2+或ClO-進行熒光測試（圖6）。從圖6可以看出，隨著Hg2+或ClO-濃度的增加，探針L2-Hg2+體系在585 nm處的熒光在逐漸增強，這可能是由于探針L2對Hg2+發生配位反應，發生內酰胺開環釋放熒光；而ClO-的氧化作用也可以使得L2斷鍵在576 nm處釋放熒光。圖6中的兩個插圖表明L2與Hg2+（5.0～26.7 μmol/L,R2=0.9802）、L2與ClO-（3.33 μmol/L～0.7 mmol/L,R2=0.9959）分別存在兩種線性相關關系。根據相關公式CL= 3σ/K（其中，CL為檢出限，σ為測定空白值的標準偏差，K為標準曲線的斜率）, 計算出L2對Hg2+的檢出限為7.45 nmol/L，對ClO-的檢出限為0.67 μmol/L. 實驗結果表明，探針L2對Hg2+和ClO-的檢測具有潛在的應用價值，可以用來檢測環境或生物樣品中這兩種有害離子的含量。

圖6 （a）在DMF/Tris-HCl（1∶1， v/v， pH=6.0）中，λex=560 nm，隨著Hg2+濃度（濃度變化對應數值：0，3.3，4.9，6.6，8.3，9.9，11.5，13.1，14.7，16.3，18.0，19.1，22.8，25.9，29.1，32.2，38.4，44.5，50.6，56.6，62.5，66.7μmol/L）增加，探針L2 （20 μmol/L）的熒光光譜；（b）在MeOH中，λex=555 nm，隨著ClO-濃度（濃度變化對應數值：0，3.33，10.0，16.6，33.3，66.6，100， 133.3，200，366.6，533.3，700，866.6，1033.3，1200， 1366.6 μmol/L）增加，探針L2（20 μmol/L）的熒光光譜，其中的插圖分別為L2與Hg2+和L2與ClO-的線性關系Fig.6 Fluorescence spectra of L2（20 μmol/L） with the increasing concentration of Hg2+（0-66.7 μmol/L） in DMF/Tris-HCl（1∶1， v/v， pH=6.0）（a）（λex=560 nm） and with the increasing concentration of ClO-（0-1.36 mmol/L） in MeOH（b） （λex=555 nm）， the linear relationship between L2 with Hg2+ and ClO-（inset）

3.5 L2響應Hg2+或ClO-的機理推測

為闡明探針L2與Hg2+和ClO-的作用機理，分別采用質譜分析、Job's plot等摩爾連續變化法、1H NMR核磁滴，研究該探針對Hg2+和ClO-的識別機制。

首先運用質譜儀器Aglient1100-Bruker的正離子模式測定探針與Hg2+和ClO-發生反應后分子量的變化情況 （補充文件圖S12）。通過圖S9（a）可以看出，質譜中m/z為1651.2，分子量與[L2+2Hg2++2NO3-+H2O]的分子量相匹配；在相同條件下，測定探針L2-ClO-的質譜為圖S9（b），可看出質譜中m/z為465.3，分子量與[RhB+Na+]的分子量465相吻合。對于L2-Hg2+體系，這些結果說明探針L2與Hg2+能夠產生熒光是兩者可能發生1∶2配位絡合的原因，該結果也與后面用等摩爾連續變化法測定的絡合比結果一致；對于L2-ClO-體系，ClO-可能通過氧化L2而導致其中羅丹明結構中的酰肼鍵開環，進而產生熒光。

另外，采用Bruker AV-400核磁儀器，以DMSO-d6為氘代溶劑，分別測定了L2及L2-Hg2+、L2-ClO-的1H NMR譜（見補充文件圖S13和圖S14）。從圖S9和圖S10分析，在單獨探針L2的氫譜中，氨基—NH的H信號化學位移為1.136×10-5左右，苯環上的氫的化學位移為（7.9～8.0）×10-6，（7.8～7.9）×10-6，（7.5～7.6）×10-6左右。對L2-Hg2+體系，當加入Hg2+后，L2探針的—NH的H質子信號1.128×10-5移動，苯環上的氫的化學位移變為（7.75～8.0）×10-6，（7.5～7.75）×10-6左右。探針的—NH的H質子信號化學位移向高場1.128×10-5移動，苯環上氫由（7.8～7.9）×10-6向高場移動說明可能是Hg2+的加入使其化學環境發生了改變。Hg2+加入可能使探針的內酰胺發生開環（NH2和羰基參加配位后開環），C=O和氨基N原子與Hg2+絡合形成五元環，而這個五元環的形成導致氨基上的氫的化學環境改變，進一步對苯環上的氫的環境產生影響導致苯環上的氫的化學位移向高場移動，峰的裂分也受到影響。

對L2-ClO-體系，探針的—NH在1.136×10-5的H質子信號消失，苯環上的氫的化學位移變為（7.75～8.0）×10-6，（7.25～7.75）×10-6左右，且在8.30×10-6處出現了一個新峰，可能是由于電子轉移的原因，ClO-與L2發生了氧化作用使得—NH官能團從探針L2中脫離，導致加入ClO-后探針L2中—NH的H質子信號峰消失，從而打開了羅丹明的閉環結構產生了熒光，使得核磁結果產生了新的峰及峰的耦合變化，質譜圖及數據也證實了羅丹明B的產生。這些結果表明,L2對Hg2+或ClO-有不同的響應機理。

為了進一步驗證L2與Hg2+發生相互作用時可能的絡合比，采用等摩爾連續變化法[26]，分別配制L2/L2+Hg2+濃度比為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9的系列溶液，測定最大發射波長峰處的熒光強度（圖7）。圖7曲線表明，當摩爾分數約為0.34時，熒光強度有最大值，說明L2與Hg2+的配位絡合比為1∶2，與前面用質譜測定的結果相一致。

圖7 探針L2-Hg2+的化學計量比的Job's plot圖Fig.7 Job's plot for determining the stoichiometry of L2 and Hg2+

為了進一步驗證以上實驗結果，利用量子化學相關方法再次確證L2對Hg2+的作用機理。在Gaussian 09軟件中，采用基于B3LYP泛函的TD DFT方法，計算了L2和L2-Hg2+配合物的最高占據分子軌道（HOMO）和最低未占據分子軌道（LUMO），以此判斷L2和L2-Hg2+配合物的HOMO能級與LUMO能級之間是否發生相互作用及形成過渡態的主要原因；而能隙是LUMO軌道和HOMO軌道之間的能差，是影響化合物穩定性的關鍵因素[27]。補充文件中表S1為優化的L2基態參數，表中的鍵角和鍵長數據表明L2為非平面的分子結構；補充文件圖S11為探針L2與兩個Hg2+離子結合的優化結構，顯示出L2有足夠的空間來容納兩個Hg2+且可達到穩定狀態。圖8為探針L2和L2-Hg2+配合物的前沿分子軌道，可看出L2和L2-Hg2+配合物的電子轉移主要發生在由HOMO躍遷到LUMO，即表明它們具有熒光性質，光譜實驗也證明了該結果。計算出的L2的能隙值為3.50591 eV，L2+2Hg2+的能隙值為0.23129 eV，說明探針與2個Hg2+分子結構更穩定，能隙更小。因為復合分子的能隙越小，極化越強，這與高的化學反應活性和低的動態穩定性直接相關。電子由于具有較低的能隙，更容易被激發從基態躍遷到激發態從而產生熒光[27]，也再次從理論上確證了L2與Hg2+的配位絡合比為1∶2是合理的。

圖8 探針L2和L2-Hg2+配合物的基態LUMO、HOMO及其能隙前沿分子軌道Fig.8 The frontier molecular orbital of ground state on LUMO，the frontier molecular orbital of ground state on HOMO， and the HOMO-LUMO gap of L2 and L2-2Hg2+

綜合以上實驗結果，推測分析了探針L2與Hg2+和ClO-響應機制，如圖9所示。對于L2-Hg2+體系，沒有配合Hg2+時，結構中的酰肼的閉環導致羅丹明本身的熒光猝滅；但有Hg2+存在時，L2可能通過C=O和氨基上的N原子與Hg2+配合形成穩定的五元環，導致羅丹明螺旋環開環，使得探針發出熒光。對于L2-ClO-體系，L2與ClO-的響應機制可能是L2的二芳基甲酰肼被ClO-氧化釋放二芳基甲酰二亞胺，產生羅丹明B結構，從而引起探針L2中的螺旋環開環產生熒光[24]。這里，L2可以作為反應基團，其中的羅丹明B分子作為提供光信號的基團，共同組成了一種熒光化學計量器來檢測Hg2+或ClO-。當Hg2+或ClO-存在時，L2分子中羅丹明從閉環的酰肼鍵結構轉換為開環的酰肼結構，伴隨著肉眼可見的粉紅色顯色反應發生。 雖然L2對Hg2+或ClO-有不同的響應機理，但是很確定的結論是L2與Hg2+以1∶2的絡合比進行反應，前面的質譜、1HNMR滴定、等摩爾連續變化都佐證了這個結論。

圖9 探針L2對Hg2+和ClO-響應機理推測圖Fig.9 Proposed mechanism of the the probe L2 response to Hg2+ and ClO-

3.6 細胞毒性和細胞成像分析

作為一種含氮五元雜環化合物，1,2,3-三氮唑類衍生物在生物、醫藥、農藥、超分子材料等領域都具有廣泛的應用，具有低毒及多種藥理活性[21,25,28]?？紤]到探針L2可能被開發應用在生物樣品中的Hg2+或ClO-測定，有必要對其進行細胞毒性和細胞成像的測定。首先利用MTT方法，將探針L2按梯度濃度調整為0，10，20，40，60，80，100 μmol/L，將HeLa細胞分為空白組和實驗組，在酶標儀上測定570 nm處的吸光值，計算L2干預下HeLa細胞的24 h后存活率（圖10）。從圖10可看出，探針L2在0～60 μmol/L濃度范圍內，對HeLa細胞的存活率均在80%，表現出良好的細胞低毒性，說明L2可以較好地運用在細胞中用來檢測離子的存在，具有良好的生物實用性。

圖10 探針L2在HeLa細胞中孵育24 h后的細胞存活率Fig.10 Cell viability graph of L2 using HeLa cells incubating for 24 h

鑒于探針L2有較低的細胞毒性及對檢測Hg2+或ClO-有高選擇性，可進一步開發是否能在生物樣品中應用。將HeLa細胞在37 ℃、5%CO2培養箱的6孔板中培養24 h后，再加入探針L21（20μmol/L）孵育1 h，隨后分別向6孔板中加入含（20μmol/L）Hg2+和ClO-，繼續孵育1 h后，在熒光顯微鏡下捕獲熒光圖像（圖11）。如圖11所示，單獨探針L2的HeLa細胞沒有發出熒光，而加入Hg2+和ClO-明顯觀察到HeLa細胞發出紅色熒光。這說明探針L2不僅可以很好地進入細胞內部，有良好的膜滲透性，也顯示出熒光探針具備特異顯色的“開關”性質，對于實現探針的生物體內應用具有很重要的價值。

圖11 探針L2在HeLa細胞中的細胞熒光成像：（a）單獨探針L2的明場圖；（b）探針L2與Hg2+的明場圖；（c）探針L2與ClO-的明場圖；（d）單獨探針L2的熒光圖；（e）探針L2與Hg2+的熒光圖；（f）探針L2與ClO-的熒光圖Fig.11 Fluorescence images of HeLa cells treated with L2： （a）bright-field images of the probe L2， （b）bright-field images of L2-Hg2+ system， （c）bright-field images of L2-ClO- system， （d）fluorescence images of the probe L2 ， （e）fluorescence images of L2-Hg2+ system， （f）fluorescence images of L2-ClO- system

4 結論

本文合成了基1,2,3-三氮唑化合物與羅丹明B酰肼構建的雙功能熒光探針L2，分別在DMF/Tris-HCl（v/v=1∶1, pH=6.0）溶液中或MeOH溶液中可高選擇性地用于檢測溶液中的Hg2+和ClO-；并整合利用Job-plot、核磁滴定、質譜確證了探針L2識別Hg2+和ClO-的響應機制，兩種被測離子可將探針L2結構中羅丹明分子的螺環閉環轉換為開環狀態從而引起顯色反應。生物細胞毒性測定結果表明，探針L2具有較低的細胞毒性，并可成功用于HeLa細胞中Hg2+和ClO-的熒光成像。探針L2在生物科學中有望被開發用于檢測Hg2+和ClO-，具有較大價值。

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