基于NF-κB信號通路探究miR-3197在糖尿病視網膜病變中的作用機制△

韓莎莎 李躍峰 徐新萌

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病常見的慢性并發癥,主要是由糖尿病所致的眼底微血管病變,也是糖尿病較為嚴重并發癥之一[1]。臨床上對糖尿病引起眼底病變的發生機制尚未完全明確,認為可能與血糖、胰島素分泌、甘油三酯(TG)等有關,這些因素參與了DR的疾病進展[2]。miRNA是一類小分子非編碼RNA,通過轉錄后調控靶基因/信號通路表達介導參與DR的發生發展,如miR-139-5p、miR-200c-3p等[3-5]。Ji等[6]通過微陣列分析發現,miR-3197在DR患者中表達上調,且具有一定的診斷效能,但具體作用機制尚不清楚。核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路可在所有細胞類型中存在,抑制NF-κB信號通路可影響多種疾病的發展[7],如Shao等[8]研究證實,抑制NF-κB信號通路可減輕高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞(hRMEC)氧化損傷和凋亡?；谝陨涎芯勘尘?本研究分析DR患者外周血中miR-3197的表達情況,觀察其與實驗室指標的相關性,并基于NF-κB信號通路探究miR-3197在DR中的作用機制,以期為臨床治療DR提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

hRMEC購自美國ATCC公司;LipofectamineTM3000試劑購自美國Invitrogen公司;胎牛血清、DMEM培養基、葡萄糖購自美國Gibco公司;anti-miR-3197、anti-miR-3197及引物購自上海吉瑪公司;Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自賽默飛世爾公司;凋亡試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒購自北京索萊寶公司;活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase 3)、Bax,以及NF-κB信號通路相關蛋白[磷酸化NF-κB p65(p-p65)、p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)及NF-κB抑制蛋白(IκBα)]及內參GAPDH購自英國Abcam公司。

1.2 樣本收集

選取衡水市人民醫院2021年1月至2021年12月收治的47例DR患者為DR組,并收集同期及同年齡段47名健康人作為對照組,收集其性別、年齡、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、TG、總膽固醇(TC)。納入標準:(1)均為1型或2型糖尿病患者所致的DR;(2)健康人群血糖、眼底檢查正常;(3)所有納入人員無血液系統疾病,無精神、認知障礙。排除標準:(1)患有其他糖尿病并發癥;(2)患有免疫性疾病或嚴重感染疾病、高血壓及惡性腫瘤。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養和轉染

常規復蘇hRMEC,用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基培養,放入培養條件為37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱內培養。細胞融合為85%時,加胰蛋白酶消化培養。取第3～5代細胞,分別采用5.5 mmol·L-1、30.0 mmol·L-1葡萄糖處理細胞24 h,記作低糖組(NG組)與高糖組(HG組);按照LipofectamineTM3000試劑盒說明書,分別將anti-miR-NC、anti-miR-3197轉染細胞6 h后,加30.0 mmol·L-1葡萄糖處理細胞24 h,記作HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-3197組。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測miR-3197相對表達量

收集DR組與對照組人員當日靜脈血及各組hRMEC,Trizol法提取總RNA,檢測濃度和純度后,利用逆轉錄試劑盒合成cDNA,參照熒光試劑盒進行擴增反應,2-△△Ct法計算miR-3197相對表達量。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集各組hRMEC,培養24 h后加預冷磷酸鹽緩沖液沖洗,3 000 r·min-1離心6 min保存細胞沉淀,加500 μL結合緩沖液制備細胞懸液,先后加5 μL的Annexin V-FITC、PI試劑,避光反應15 min,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.4 酶聯免疫吸附法檢測TNF-α、IL-6

各組hRMEC培養48 h,離心后收集上清液,參照TNF-α、IL-6試劑盒說明書,檢測TNF-α、IL-6表達。

1.3.5 Western blot檢測cleaved-caspase3、Bax、NF-κB信號通路蛋白表達

各組hRMEC培養48 h,并提取各組細胞總蛋白,經檢測定量后,高溫煮沸變性5 min,取上樣蛋白30 μg行凝膠電泳處理,半干法轉膜、封閉培養60 min,將封閉的膜放入一抗稀釋液中,4 ℃過夜孵育,次日加HRP標記的二抗稀釋液室溫孵育60 min,加化學發光試劑顯影,采集圖形后,采用Quantity One分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 兩組人員一般資料及外周血中miR-3197相對表達量比較

DR組與對照組人員性別、年齡比較,差異均無統計學意義(均為P>0.05);DR組患者FBG、FINS、TC及TG水平均高于對照組,差異均有統計學意義(均為P<0.001)(表1)。DR組患者外周血中miR-3197相對表達量為2.76±0.67,高于對照組(1.03±0.34),差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組人員臨床資料及實驗室指標比較

2.2 miR-3197相對表達量與實驗室指標的相關性及ROC分析

相關性分析顯示,DR組患者miR-3197與FBG、FINS、TC及TG均呈正相關(r=0.672、0.587、0.511、0.423,均為P<0.05)。以DR組患者為陽性樣本,以對照組為陰性樣本,繪制miR-3197對DR診斷的ROC曲線圖,其曲線下面積(AUC)為0.919,敏感度與特異度分別為85.11%與89.36%(圖1)。

圖1 miR-3197相對表達量對DR診斷的ROC曲線圖

2.3 各組hRMEC凋亡、cleaved-caspase3及Bax蛋白表達比較

與NG組相比,HG組凋亡率、cleaved-caspase3及Bax蛋白表達均顯著增加(均為P<0.05);與 HG+anti-miR-NC組相比,HG+anti-miR-3197組凋亡率、cleaved-caspase3及Bax蛋白表達均顯著降低(均為P<0.05)(圖2、3,表2)。

圖2 各組hRMEC中cleaved-caspase3及Bax蛋白表達條帶圖

圖3 流式細胞術檢測各組hRMEC凋亡圖

表2 各組hRMEC凋亡、cleaved-caspase3及Bax蛋白相對表達量比較

2.4 各組hRMEC炎性因子TNF-α及IL-6表達比較

與NG組相比,HG組TNF-α及IL-6表達量均增加(均為P<0.05);與HG+anti-miR-NC組相比,HG+anti-miR-3197組TNF-α及IL-6表達量均降低(均為P<0.05)(表3)。

表3 各組hRMEC炎性因子TNF-α及IL-6表達比較

2.5 各組hRMEC中NF-κB信號通路相關蛋白變化比較

與NG組相比,HG組p-IκBα、p-p65蛋白表達均增加(均為P<0.05);與HG+anti-miR-NC組相比,HG+anti-miR-3197組p-IκBα、p-p65蛋白表達均降低(均為P<0.05)(圖4、表4)。

圖4 各組hRMEC中NF-κB信號通路相關蛋白條帶圖

表4 各組hRMEC中NF-κB信號通路相關蛋白變化比較

3 討論

糖尿病主要特征為高血糖,長期高血糖可導致機體糖代謝紊亂,進而損害多種器官,如腎、心肌、視網膜等組織[9]。研究顯示,12.8%～40.0%的糖尿病患者伴有DR,進一步引起周圍細胞選擇性喪失、細胞炎性損傷[10]。FBG、FINS、TC及TG是DR發病的高危因素,可反映患者病情變化[11]。

miRNA在多種疾病、腫瘤中異常表達,可廣泛參與機體中多種生理病理過程,是新型診斷標志物和治療靶點,既往研究顯示,miRNA可參與糖尿病及其并發癥的發生,且與患者FBG、FINS等指標密切相關[12]。有研究發現,miR-21在DR患者血清中表達高于2型糖尿病患者,而miR-93表達低于2型糖尿病患者,且與患者FBG、FINS密切相關,可見miR-21、miR-93可能是DR的潛在標志物[13-14]。劉迪[15]研究顯示,miR-15在DR患者中表達水平較2型糖尿病高,且與患者FBG、糖化血紅蛋白密切相關。張浩等[16]通過MicroRNA微陣列分析發現,miR-3197在DR患者血清中表達水平高于非DR患者,且與患者FBG、TC、TG水平均呈正相關,其診斷DR的AUC為0.903。本研究發現,DR患者外周血miR-3197水平高于健康人,且與患者FBG、FINS、TC及TG水平均呈正相關,其診斷DR的AUC為0.919,敏感度與特異度分別為85.11%、89.36%,這與張浩等[16]研究結果一致,證實miR-3197可介導參與DR發展,可作為DR的潛在標志物。

隨著對DR的研究深入,發現hRMEC是其病變關鍵細胞之一,可合成和分泌多種物質[17-18],本研究通過高糖誘導hRMEC建立DR體外細胞模型,結果發現,高糖誘導hRMEC后可加速細胞異常凋亡,并促進細胞炎性因子TNF-α與IL-6的釋放,提示模型構建成功,這與Xiao等[19]的研究結果一致。Wang等[20]研究結果顯示,miR-1243在高糖誘導的hRMEC中表達下調,敲低過表達可減輕高糖誘導的hRMEC炎癥損傷,可見miRNA可介導參與hRMEC的發生發展。本研究發現,高糖環境下hRMEC中miR-3197表達上調,轉染anti-miR-3197并經過高糖處理,下調miR-3197可降低高糖誘導hRMEC中miR-3197的表達,證實miR-3197參與了DR的發展。進一步分析miR-3197在DR體外細胞模型中的作用機制,發現下調miR-3197可降低高糖誘導hRMEC的細胞凋亡率、減少TNF-α與IL-6的釋放,并下調cleaved-caspase3及Bax蛋白的表達,提示下調miR-3197可減輕高糖誘導的hRMEC凋亡和炎性損傷。

NF-κB信號通路是一條高度保守的信號通路,可介導參與細胞免疫、炎癥反應及細胞凋亡等多種生物學進程[21]。NF-κB常以二聚體形式存在,以p65、p50較為常見,在靜息狀態下主要在胞漿中存在,可與抑制蛋白I-κB形成三聚體形式,三聚體NF-κB在釋放p65/p50時可發生核移位,可在細胞核中與IκBα結合,轉移至細胞外,進而參與疾病進展[22]。研究顯示,miR-874可通過抑制NF-κB信號通路激活減輕DR大鼠內皮細胞損傷[23]。本研究發現,高糖誘導hRMEC后,p-IκBα及p-p65蛋白表達上調,下調miR-3197可降低高糖誘導的hRMEC中p-IκBα、p-p65蛋白表達,提示下調miR-3197可通過調節NF-κB信號通路參與DR進展。

本研究存在的不足在于miR-3197與NF-κB信號通路對DR的具體作用調控機制尚不十分清楚,下一步可通過建立體內動物實驗,探究miR-3197與NF-κB信號通路對DR影響的實驗研究。

4 結論

DR患者外周血和高糖誘導的hRMEC中miR-3197高表達,下調miR-3197可通過抑制NF-κB信號通路激活減輕高糖誘導的hRMEC凋亡與炎性損傷。