京尼平苷對高糖誘導的人視網膜血管內皮細胞增殖及血管生成的影響及機制研究△

蘇 杰 楊馥宇 李 猛 蔣利生

糖尿病視網膜病變(DR)是一種與長期糖尿病相關的微血管疾病,大約1/3的糖尿病患者會受到DR影響[1-2]。DR發病機制復雜,包括氧化應激、炎癥反應、新生血管等多種因素[3]。在DR最后階段,血管內皮生長因子(VEGF)異常產生并釋放,導致新生血管形成,而視網膜新生血管是導致視網膜脫離、玻璃體積血和視力下降的主要原因[4-5]。目前,抗VEGF藥物成為了DR治療的一線選擇,如貝伐珠單抗(BEV)[4]。然而,在哺乳動物體內存在一種內源性VEGF抑制劑,即可溶性VEGF受體-1(sFlt-1),其能夠與VEGF結合,抑制VEGF分子功能,但正常生理條件下,VEGF與sFlt-1處于動態平衡狀態,起到相互制約的作用。有研究表明[6],過表達sFlt-1可顯著抑制視網膜血管生成。因此,內源性VEGF/sFlt-1分子軸可能成為治療DR的關鍵靶點。

京尼平苷(Gen)是一類環烯醚苷類化合物,具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗心肌功能障礙等多種藥理活性[7]。Gen在DR體外和體內模型中均發揮著抑制氧化應激和炎癥反應的作用,可減輕視網膜細胞和視網膜屏障的損傷[8]。Gen具有抑制VEGF表達作用,從而阻止血管生成[9]。因此,本研究推測Gen可能通過調控內源性VEGF/sFlt-1分子軸對DR患者血管新生產生抑制作用。本研究擬通過高糖條件培養人視網膜血管內皮細胞(hRVECs)模擬體外高糖模型,研究Gen對hRVECs增殖和血管形成能力的影響,并探討其作用機制,旨在為DR治療研究提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

hRVECs購自武漢普諾賽生命科技有限公司。Gen(≥98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DMEM、胎牛血清均購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;BEV購自美國MedChemExpress公司;Matrigel基質膠購自美國BD公司;兔抗人VEGF-A多克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)多克隆抗體、兔抗人基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體均購自英國Abcam公司;兔抗人sFlt-1多克隆抗體購自美國Invitorgen公司。

1.2 CCK-8檢測hRVECs增殖活性

(1)取對數生長期hRVECs,以每孔1.5×103個細胞的密度接種于96孔板中,待細胞生長至約70%融合度時,采用不同濃度(0、1、5、10、20、40、80 mg·L-1)Gen處理24 h。(2)取對數生長期hRVECs,以每孔1.5×103個細胞的密度接種于96孔板中,待細胞生長至約70%融合度時,加入含25 mmol·L-1葡萄糖的DMEM誘導hRVECs[10],同時分別加入不同濃度(5、10、20 mg·L-1)Gen或250 mg·L-1BEV,培養24 h。培養結束前4 h,每孔加入10 μL CCK-8溶液,孵育4 h。酶標儀檢測450 nm處吸光度,計算細胞增殖活性。

1.3 細胞分組處理

將對數生長期的hRVECs分為:對照組,高糖組,Gen低、中、高濃度組,BEV組和Gen高濃度+BEV組。除對照組采用含2.5 mmol·L-1葡萄糖的DMEM進行培養外,其他組均采用含25 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培養。Gen低、中、高濃度分別為5、10、20 mg·L-1,BEV組、Gen高濃度+BEV組中BEV 濃度均為250 μg·L-1[11],Gen高濃度+BEV組中的Gen 濃度為20 mg·L-1。

1.4 劃痕實驗檢測hRVECs遷移能力

實驗前于6孔板背后,每隔1 cm劃一道橫線,橫穿過孔。取對數生長期hRVECs接種于該6孔板,每孔加5×105個細胞,培養過夜。用無菌槍頭垂直于孔板背后橫線進行劃痕,PBS洗去劃落的細胞,按照1.3中分組加藥干預后培養24 h,顯微鏡下觀察劃痕處細胞遷移情況。計算劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.5 體外成管實驗檢測hRVECs成管能力

取對數生長期hRVECs,按照1.3中分組加藥處理24 h。提前取 Matrigel基質膠鋪設于24孔板中,每孔250 μL,靜置1 h備用。收集加藥處理后的各組細胞,制備單細胞懸液,向24孔板中加入細胞懸液,每孔500 μL,培養4 h。顯微鏡下觀察隨機視野中細胞成管情況。

1.6 Western blot檢測hRVECs中VEGF-A、sFlt-1、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

取對數生長期hRVECs,按照1.3中分組加藥處理24 h。取所有組細胞沉淀,裂解提取總蛋白,BCA法進行蛋白定量。SDS-PAGE電泳后,濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上,50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗(VEGF-A稀釋比11 000,sFlt-1稀釋比150,MMP-2稀釋比1500,MMP-9稀釋比11 000,GAPDH稀釋比11 000),4 ℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗(稀釋比110 000),室溫孵育2 h。加入化學發光試劑,于暗室中顯影曝光,分析蛋白條帶灰度值,目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 Gen對高糖誘導下hRVECs增殖活性的影響

CCK-8檢測結果顯示,與0 mg·L-1Gen比較,1、5、10、20、40、80 mg·L-1Gen對 hRVECs增殖活性的影響差異均無統計學意義(均為P>0.05)(圖1A)。與對照組比較,高糖組hRVECs增殖活性差異有統計學意義(P<0.01)。與高糖組比較,Gen低、中、高濃度組hRVECs增殖活性差異均有統計學意義(均為P<0.05)(圖1B)。提示Gen可以抑制高糖條件下hRVECs增殖活性。

A:CCK-8檢測不同濃度Gen干預后的hRVECs增殖活性。B:CCK-8檢測不同濃度Gen干預后高糖條件下hRVECs增殖活性;1:對照組;2:高糖組;3:Gen低濃度組;4:Gen中濃度組;5:Gen高濃度組。與對照組比較,**P<0.01;與高糖組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。

2.2 Gen對高糖誘導下hRVECs遷移及血管形成能力的影響

劃痕實驗結果顯示,對照組、高糖組、Gen低濃度組、Gen中濃度組和Gen高濃度組細胞劃痕愈合率分別為(74.15±5.75)%、(90.39±6.93)%、(65.46±6.46)%、(56.97±8.40)%、(36.51±9.53)%。與對照組比較,高糖組hRVECs遷移能力增強,劃痕愈合率差異有統計學意義(P<0.05)。與高糖組比較,Gen低、中、高濃度組hRVECs細胞遷移能力減弱,劃痕愈合率差異均有統計學意義(均為P<0.05),呈Gen濃度依賴性(圖2)。細胞成管實驗結果顯示,與對照組比較,高糖組hRVECs環行管狀結構增多。與高糖組比較,Gen低、中、高濃度組hRVECs環行管狀結構逐漸減少(圖3)。

圖2 Gen對高糖條件下hRVECs遷移能力的影響

圖3 Gen對高糖條件下hRVECs血管形成能力的影響

2.3 Gen對高糖誘導下hRVECs中VEGF/sFlt-1軸相關蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示,與對照組比較,高糖組hRVECs中VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均升高,差異均有統計學意義(均為P<0.05),而sFlt-1蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。與高糖組比較,Gen低、中、高濃度組hRVECs中VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平逐漸降低,差異均有統計學意義(均為P<0.05),而sFlt-1蛋白表達水平逐漸升高(均為P<0.05),呈濃度依賴性(圖4)。

1:對照組;2:高糖組;3:Gen低濃度組;4:Gen中濃度組;5:Gen高濃度組。與對照組比較,**P<0.01,***P<0.001;與高糖組比較,#P<0.05,###P<0.001。

2.4 Gen通過調控VEGF/sFlt-1軸抑制高糖誘導的hRVECs增殖和血管生成

CCK-8檢測結果顯示,高糖組、Gen高濃度組、BEV組和Gen高濃度+BEV組hRVECs增殖活性分別為(100.00±6.93)%、(65.84±6.38)%、(55.23±10.36)%、(39.16±6.72)%。與高糖組比較,Gen高濃度組和BEV組hRVECs增殖活性均降低(均為P<0.05);與Gen高濃度組比較,Gen高濃度+BEV組hRVECs增殖活性降低(P<0.05)。與高糖組比較,Gen高濃度組和BEV組hRVECs 中VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平均顯著降低,sFlt-1蛋白表達水平均增加,差異均有統計學意義(均為P<0.05);與Gen高濃度組比較,Gen高濃度+BEV組hRVECs中VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平進一步降低,sFlt-1蛋白表達水平進一步升高,差異均有統計學意義(均為P<0.05,圖5)。與高糖組比較,Gen高濃度組和BEV組hRVECs環形管狀結構均減少;與Gen高濃度組比較,Gen高濃度+BEV組hRVECs中幾乎沒有環形管狀結構的細胞簇(圖6)。

1:高糖組;2:Gen高濃度組;3:BEV組;4:Gen高濃度+BEV組。與高糖組比較,***P<0.001;與Gen高濃度組比較,###P<0.001。

圖6 體外成管實驗檢測各組細胞成管能力

3 討論

視網膜是一種由視桿和視錐感光感受器細胞組成的多層網絡,與雙極細胞和神經節細胞結合,通過將從光中獲得的信息編碼為神經脈沖來實現視覺[12]。視網膜由廣泛的血管系統提供氧氣和營養,當機體出現高血糖水平時,會增加血-視網膜屏障的通透性,導致血液滲漏至視網膜中,且高血糖也會阻塞視網膜毛細血管,阻礙營養物質的輸送,造成視網膜的進一步損傷[13-14]。DR發病過程中,主要表現有視網膜血管通透性增加,毛細血管閉塞,視網膜缺血、缺氧,血管生成因子釋放和新生血管形成等[15]。視網膜血管內皮細胞被認為是糖尿病誘導血管損傷的主要細胞靶點,高血糖通過不同的機制致使視網膜內皮細胞遷移、增殖等生物學行為加強,引起微血管功能障礙或最終導致新生血管生成[16-17]。與上述研究結果相似,在本研究中,高糖誘導下的hRVECs增殖活性、遷移能力和血管形成能力增強。大量研究[18-20]顯示,多種天然產物可抑制hRVECs增殖、遷移和血管生成,在治療DR方面具有很大的潛在價值。Gen具有抗炎、抗血管生成等藥理作用,研究發現,Gen可抑制血管內皮細胞的生物學功能、基底膜形成、血管通透性,減輕VEGF誘導的血管生成[9]。本研究采用Gen干預高糖誘導后的細胞,發現細胞增殖活性、遷移能力和血管形成能力減弱,且高濃度Gen的抑制作用更明顯,提示Gen對高糖誘導的hRVECs增殖、遷移和血管形成具有抑制作用,與上述研究結果一致。

糖尿病環境刺激多種MMPs的分泌,MMP-2和MMP-9在DR早期可能通過破壞線粒體促進視網膜毛細血管細胞凋亡,在DR晚期,誘導新生血管形成,因此,MMP具有成為DR治療靶標的潛在價值[21-23]。VEGF與MMPs之間存在作用關系,VEGF能誘導MMPs表達以促進視網膜新生血管形成[24]。VEGF有很多亞型,VEGF-A是DR最重要的致病因子之一[4]。VEGF-A在DR中表達上調,被確定為DR發病機制的關鍵驅動因素。sFlt-1是一種可溶性的VEGF拮抗劑,與VEGF之間的動態平衡狀態對維持血管生長平衡具有重要作用[25]。sFlt-1可抑制細胞增殖、侵襲、遷移和血管形成,抑制VEGF/MMP-2/MMP-9軸的表達[26]。BEV是一種完全人源化的免疫球蛋白G1分子,是VEGF特異性抗體,可與VEGF-A亞型結合并抑制其表達,阻斷VEGF-A對新生血管形成和血管通透性增加的誘導作用,可用于治療DR[4,27-28]。本研究采用BEV作為VEGF-A抑制劑與Gen聯合使用,探討Gen是否通過調控VEGF-A表達而發揮作用,結果顯示,BEV與Gen均對高糖誘導的hRVECs增殖和血管形成產生抑制作用,下調VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表達,上調sFlt-1表達水平,且Gen與BEV聯合作用效果更顯著,提示Gen可能與BEV的作用機制相似,對VEGF/sFlt-1軸平衡具有調控作用。

4 結論

Gen可通過調控VEGF/sFlt-1軸平衡,對高糖誘導的hRVECs增殖、遷移與血管形成發揮抑制作用,本研究結果提示,Gen對DR治療具有一定的藥用價值,值得深入研究與應用,且VEGF/sFlt-1軸可能是Gen在DR治療中的一個有前途的靶點。