LC-3、Beclin-1和P62表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的相關性

萬 瓊 薛春麗 李秀明 侯智亮

受吸煙、環境污染、遺傳等因素的影響,肺癌一直居于我國癌癥死亡原因的首位,也是全球癌癥相關死亡的最主要原因[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的類型,患者早期多起病隱匿,除偶有咳嗽、氣促外,多無典型臨床癥狀,待發現時多已錯過最佳治愈時機。近年來,有關肺癌發病機制的研究愈來愈多,雖尚未明確具體作用機制,但已有證據證實患者機體自噬系統異常與NSCLC的發病和轉移均有密切聯系,而在治療早期通過對微管相關蛋白1輕鏈3(LC-3)、自噬調控因子Beclin-1和P62等自噬系統相關蛋白表達情況的測定,也能進一步提升對肺癌發生發展情況評估的準確性,以為后續的治療方案選擇提供更多理論參考[2-3]?；诖?本院對93例NSCLC患者資料進行回顧性分析,探究LC-3、Beclin-1和P62表達情況與NSCLC臨床病理特征的相關性,為NSCLC的早期診斷評估提供更多輔助參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2020年1月至2022年12月本院收治的93例NSCLC患者資料。納入標準:①病理學確診為NSCLC[4];②臨床及隨訪資料完整。排除標準:①小細胞肺癌;②合并其他部位腫瘤等惡性疾病;③切除肺癌組織時接受過放化療或其他抗癌治療;④病理組織污染。所有研究樣本中男性57例,女性36例;年齡34～74歲,平均年齡(59.44±6.33)歲;肺鱗癌51例,肺腺癌42例;TNM分期Ⅰ期29例,Ⅱ期27例,Ⅲ期25例,Ⅳ期12例;高分化19例,中分化48例,低分化26例;淋巴結轉移25例。本研究為回顧性分析,已免去患者知情同意及醫學倫理審批。

1.2 方法

1.2.1 組織切片制作、染色及免疫組織化學檢測 切片制作、染色:取患者癌組織及癌旁組織(距離癌組織2～3 cm)標本進行研究。將所有樣本進行常規切片、烤片、脫蠟及水化處理后,采用蘇木精進行染色5 min,后以蒸餾水沖洗30 s,1%鹽酸乙醇進行分化2 s,再以蒸餾水沖洗30 s。用促藍液進行反藍20 s后用蒸餾水沖洗10 min,再以伊紅溶液浸泡2 min,再次脫水水化后通過中性樹脂進行封片。免疫組織化學檢測:將組織切片脫蠟水化后,配置抗原修復液以高溫水煮法進行抗原修復,置于沸水中30 min后冷卻至室溫,再以蒸餾水洗滌3次,單次洗滌時間為5 min。將切片置于3%的過氧化鈉溶液中30 min,再用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次,單次洗滌時間為5 min。先用LC-3、Beclin-1和P62進行一抗孵化,4 ℃孵化過夜。再于次日以生物素化二抗工作液進行二次孵化30 min,而后加入辣根酶標記鏈霉卵白素30 min,用含0.03%過氧化氫溶液0.05%二氨基聯苯胺進行顯色,通過顯微鏡觀察染色深度,至適合深度后用蒸餾水終止染色,再用蘇木精進行復染30 s后,以蒸餾水沖洗,而后進行清洗封片,完成免疫組織化學染色。

1.2.2 LC-3、Beclin-1和P62表達情況評估 由2位資深病理醫師共同對所有病例切片進行雙盲閱片對LC-3、Beclin-1和P62表達情況進行評估。每張切片選擇10個高倍視野(×400),統計視野中100個細胞中陽性細胞比例及染色強度。細胞陽性染色為細胞質呈褐色或棕黃色顆粒樣,陽性細胞比例評分標準:陽性細胞占比<5%記為0分,陽性細胞占比在5%～25%記為1分,陽性細胞占比在25%～50%記為2分,陽性細胞占比>50%記為3分。染色強度評分標準:細胞無染色記為0分,細胞染色呈淡黃色顆粒記為1分,細胞染色呈棕黃色顆粒記為2分,細胞染色呈棕褐色顆粒記為3分?？傇u分為兩項評分相乘,總評分≤3分提示相應蛋白陰性表達,總評分>3分提示相應蛋白陽性表達。

1.3 觀察指標

比較NSCLC患者癌組織和癌旁組織中LC-3、Beclin-1和P62表達情況;比較不同LC-3、Beclin-1和P62表達情況患者基礎、臨床及病理資料差異。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 癌組織與癌旁組織LC-3、Beclin-1和P62表達情況比較

癌組織LC-3、Beclin-1陽性率低于癌旁組織,P62表達陽性率高于癌旁組織(P<0.05),見表1。

表1 癌組織與癌旁組織LC-3、Beclin-1和P62表達情況比較(例,%)

2.2 LC-3、Beclin-1和P62不同表達情況患者基礎、臨床及病理資料差異比較

LC-3、Beclin-1和P62不同表達情況患者肺癌病理類型、TNM分期以及分化程度差異均有統計學意義(P<0.05),性別、年齡、吸煙飲酒史、腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移差異均無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 不同癌組織LC-3、Beclin-1、P62表達情況患者基礎、臨床及病理資料差異比較

3 討論

NSCLC為肺癌的最常見類型,相較于小細胞肺癌,NSCLC癌細胞增殖擴散速度相對較慢,早期多無典型癥狀,若及時診斷發現并通過手術及放療等規范治療后則有極大治愈可能[5]。若NSCLC未能及時發現治療,待中晚期診斷后,則需結合病情、病理類型和分期等多個因素綜合評估,以制定針對性的手術、放化療及靶向治療等綜合性治療方案[6]。因此,NSCLC患者癌腫發生發展及臨床病理特征的早期評估,對于患者后續病情控制及治療方案的選擇均有重要的指導意義。部分學者指出,肺癌的發病和病情發展可能與機體自噬功能異常相關,因而部分自噬相關蛋白表達變化對肺癌早期病情評估具有一定的參考價值[7]。

本次研究結果顯示,NSCLC患者癌組織LC-3、Beclin-1陽性率低于癌旁組織,P62表達陽性率高于癌旁組織,同時不同LC-3、Beclin-1和P62表達情況患者肺癌病理類型、TNM分期以及分化程度均存在較大差異,說明LC-3、Beclin-1和P62表達情況與NSCLC患者病理類型、TNM分期以及分化程度由密切聯系,其LC-3、Beclin-1表達降低及P62表達提升與肺癌的發生發展相關。LC-3主要存在于細胞質中,在細胞自噬過程中會定向結合到自噬囊泡膜上,其表達和定位與細胞自噬活性及水平均有密切關聯。相關研究表明LC-3在腫瘤、神經退行性疾病和感染等多種疾病中均扮演重要角色,主要通過調控LC3的表達和修飾狀態,影響細胞自噬的進程,從而對疾病的發生和發展產生影響[8];而在NSCLC的發生發展中,LC-3的表達下調使得自噬體生成減少,細胞自噬活性顯著下降,而癌細胞的易感性提升,進而促進癌腫的發展轉移,尤其在中晚期及低分化NSCLC中其活性降低更為明顯。同時,王璁等[9]關于LC-3在NSCLC中表達的相關研究中也證實,LC-3在肺鱗癌中的陽性表達率高于其在腺癌中的表達率,與本次研究結果一致。Beclin-1為自噬過程中關鍵的蛋白質,參與調控自噬囊泡的形成和自噬的啟動,低表達或缺失Beclin-1會導致自噬功能受損,從而可能影響細胞代謝、清除異常蛋白質和細胞器以及維持細胞穩態等重要生理過程;而在NSCLC患者中,機體Beclin-1表達減少或缺失導致其自噬功能顯著降低,自噬體生成顯著減少,癌細胞的自噬能力降低,異常細胞難以正常凋亡,導致癌細胞增殖失控,最終導致NSCLC的發展擴散,而隨著腫瘤的分化程度降低,其表達水平進一步下降,在癌腫晚期及低分化NSCLC中,Beclin-1甚至完全失活,抑癌功能完全喪失,導致癌細胞侵襲及轉移功能顯著提升[10-11];但其在肺腺癌和鱗癌中的差異目前相關研究結果尚存在較大區別,需進一步擴大研究樣本深入探討[12]。P62作為機體另一個重要的自噬調控因子,在細胞內主要起著橋梁的作用,連接了自噬過程和其他細胞信號通路,通過與聚集的異常蛋白質或細胞器結合,將它們定向到自噬囊泡中進行降解,同時還可以作為信號分子,參與調節細胞生長、炎癥反應和氧化應激等多種細胞過程,而異常的P62表達或功能可能導致自噬功能紊亂和細胞內廢棄物的積累,從而對NSCLC的發生和發展產生影響[13-14]。王璁等[9]的研究還證實,P62在肺腺癌中的表達遠高于肺鱗癌患者,同時其表達與NSCLC的病理類型、臨床分期及轉移情況均有密切關聯。因此,臨床可根據對于LC-3、Beclin-1和P62等自噬相關蛋白表達情況的測定,進一步明確NSCLC的發生發展情況。

綜上所述,LC-3、Beclin-1表達降低及P62表達升高與NSCLC的發生和進展有密切關聯,臨床可作為NSCLC評估的輔助指標,為后續治療方案的選擇提供理論參考。