基于分子模擬技術篩選牛乳清蛋白源抗氧化肽

馬寅龍，郭銳斌，于雁松，馬隆凱，許曉曦

（東北農業大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室 哈爾濱 150030）

生物活性肽是一種蛋白質降解成氨基酸的中間產物，它除了具有營養價值外，還會對機體健康產生有益的生理作用，與傳統藥物相比，它無毒、副作用小且利于機體利用，目前許多生物活性肽已被應用于醫學領域[1]。生物活性肽具有多種生物活性，主要包括抗氧化、抗菌、降血壓及降血糖等[2]。目前研究報道，生物活性肽主要來源于乳制品、動物和植物，這是因為它們含有特定生物活性片段的蛋白質前體[3]。乳源蛋白質被視為生物活性肽的重要來源，目前越來越多的生物活性肽在乳蛋白水解物和發酵乳制品中被發現。乳清蛋白來源于奶酪生產加工中的副產物乳清中，蛋白組成包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、蛋白胨和糖巨肽，含有大量必需氨基酸和支鏈氨基酸，如異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸，具有調節不同代謝通路、血糖穩態及含硫氨基酸平衡的功能[4]。它本身也具有優良的抗氧化性，可清除機體自由基，螯合金屬離子及修復體內蛋白質中的游離巰基[5]。研究表明，乳清蛋白在水解過程中會釋放出具有高抗氧化能力的抗氧化肽[6-7]。Peng 等[8]發現，與未水解的乳清分離蛋白相比，乳清分離蛋白的水解物具有更強的自由基清除能力、銅離子螯合能力和總還原能力。Daliri 等[9]研究表明，乳清蛋白經Corolase 酶或其它商業蛋白酶水解后得到的乳清蛋白肽具有較高的清除自由基能力。Corrochano 等[10]通過模擬胃腸道消化的方式研究乳清蛋白源抗氧化肽，發現乳清蛋白經消化后產生的多肽（ALMP、GDLE、TKIPA、VEELKPT、VGIN 和AVEGPK）通過Caco-2/HT-29 細胞中的腸屏障傳輸，從而抑制肌肉和肝細胞中自由基的形成。

人體產生氧自由基含量的多少，受機體內部和外部環境影響，比如自然生長發育的過程、外部環境接觸的過程及不良飲食習慣的影響。在代謝正常的條件下，機體產生的自由基會被其內部的抗氧化系統中和，如果機體代謝紊亂就會導致自由基和抗氧化系統之間的平衡紊亂，從而導致細胞內積累過量的自由基。氧自由基在生物體內過量往往與活性氧種類和抗氧化物質之間的不平衡有關，這種自由基的平衡紊亂稱為氧化應激[11]。自由基反應的加劇會引起強烈且持久的氧化應激，并可能導致DNA、蛋白質和脂質結構的永久性變化，這個過程會破壞細胞結構和基因，從而導致代謝紊亂和腫瘤轉化[12]。研究表明，許多現代非傳染性疾病與氧化應激有關，如腫瘤、神經退行性疾病、循環系統及神經系統的紊亂[13]。雖然合成藥物可用于治療這些疾病，但是其往往伴隨有不良副作用，因此天然食物來源的抗氧化成分受到科學界的廣泛關注。

傳統的抗氧化肽篩選方法是通過特定酶對蛋白進行水解，然后對產生的肽段進行鑒定、合成，并進行體外和體內的抗氧化驗證試驗，因此抗氧化肽序列的試驗研究往往既價格昂貴又耗費時間[14]。采用生物信息學對肽段進行電子分析來篩選抗氧化肽序列，可以克服這些缺點，對抗氧化肽的研究主要包括電子預測和分子模擬技術。生物活性肽的電子預測是基于機器學習方法創立的，在機器學習推理中通常需要正數據集和負數據集來訓練預測模型，通過這種方式可以訓練機器學習算法，從給定數據集中學習復雜的基本模式，并利用它們的物理化學性質和氨基酸組成預測生物活性肽的生物活性[15]。分子模擬技術是從生命科學中蛋白質、多肽等結構出發，在分子水平上解析生物反應過程，在分子作用機理上補充體外和體內試驗的理論，由于其可對模擬粒子進行原子細節分析，因此在分子相互作用方面提高了對試驗數據的理解和解釋的新水平[16-17]。

綜上所述，本研究利用虛擬酶解、電子預測、分子對接及分子動力學等生物信息學方法，以牛乳清蛋白為目標蛋白篩選抗氧化肽。旨在為篩選乳清蛋白源抗氧化肽提供一種高效、低成本的方法，為天然食源性抗氧化肽的快速篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳清蛋白氨基酸序列，來自Universal Protein數據庫（https：//www.uniprot.org/）；Keap1 蛋白的天然晶體結構，來自RCSB 蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）。

1.2 儀器與設備

Discovery studio（DS）V2019 軟件，美國BIOVIA 公司。

1.3 牛乳清蛋白序列的獲得

牛乳清蛋白主要包括β-乳球蛋白（1.3 g/L）、α-乳白蛋白（1.2 g/L）、免疫球蛋白（0.5～1.0 g/L）、牛血清白蛋白（0.4 g/L）、牛乳鐵蛋白（0.1 g/L）[18]，其蛋白序列來源于Universal Protein（https：//www.uniprot.org/），5 種蛋白的編號和氨基酸數目分別為：Beta-lactoglobulin，P02754，178；Alpha-lactalbumin，P00711，142；Polymeric immunoglobulin receptor，P81265，757；Albumin，P02769，607 和Lactotransferrin，P24627，708。

1.4 計算機虛擬消化

采用BIOPEP-UWM（http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）[19]中 的“enzyme（s）action”程序對5 種牛乳清蛋白源蛋白質進行虛擬消化，使用的水解酶為胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）和胰蛋白酶（EC 3.4.21.4），識別和切割位點分別為：（胃蛋白酶）、（胰蛋白酶），且2 種蛋白酶均可作用于C-末端。

1.5 抗氧化肽的篩選

將虛擬消化得到的牛乳清蛋白源肽段在PeptideRanker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）預測網站中進行潛在生物活性評分，生物活性評分越高代表預測肽的生物活性越大，通常選擇不小于0.5 或0.4 作為篩選生物活性肽的基準[20]。本研究為了擴大篩選抗氧化肽的范圍，因此選擇不小于0.4 的生物活性評分的肽作為后續研究對象。

通過BIOPEP-UWM 和SATPdb[21]（http：//crdd.osdd.net/raghava/satpdb/）數據庫，將上述篩選后的所有肽段與兩數據庫中已被報道的生物活性肽進行比對，篩選出未被報道過的肽進行后續研究。

1.6 毒性、過敏性及水溶性分析

通過ToxinPred[22]程序（http：//crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）預測肽的毒性，設定SVM 閾值為0.0，采用兩種預測方法：SVM（Swiss Prot）+Motif 和SVM（TrEMBL）+Motif 進行測定，只有當2 兩種方法預測結果均為無毒時才可被視為無毒的肽序列；通過AllerTOP v.2.0[23]程序（https：//www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/index.html）預測肽的過敏性；通過Innovagen 在線網站（http：//www.innovagen.com）預測肽的水溶性優劣，此網站可以將肽區分為“Good water solubility”和“Poor water solubility”。篩選出預測結果為無毒、無致敏性、良好水溶性的肽用于后續研究。

1.7 物理化學性質分析

通過Expasy-compute[24]程序（http：//web.expasy.org/compute_pi/）的pI/Mw tool 功能預測肽的相對分子質量和等電點；通過在線網站Pepdraw（http：//www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw）預測肽的凈電荷和疏水性。

1.8 藥物代謝動力學分析

通過Discovery studio（DS）V2019（Dassault Systemes Biovia，San Diego，CA，USA）軟件對多肽進行藥物代謝動力學（Absorption distribution metabolism excretion toxicity，ADMET）分析，分析多肽作為相關藥物的吸收與毒性，進一步篩選更加合理、健康的肽段。采用DS 軟件的ADMET Descriptors 程序，分析多肽的人體腸道吸收（Human intestinal absorption，HIA）[25]、25 ℃水溶性（Aqueous solubility）[26]、血腦屏障通透性（Blood brain barrier，BBB）[27]、細胞色素P450 2D6 抑制性（Cytochrome P4502D6 inhibition）[28-29]、肝毒性（Hepatotoxicity）[29-30]及血漿蛋白結合率（Plasma protein binding，PPB）[31]；采用DS 軟件的Toxicity Prediction 程序對多肽進行毒理性質的預測，依據乳清蛋白源多肽的應用功能選定9 個預測模型：1）埃姆斯致突變性模型、2）NTP 數據集下的嚙齒動物致癌性模型（NTP Rodent Carcinogenicity）、3）FDA 數據集下的嚙齒動物致癌性模型（FDA Rodent Carcinogenicity）、4）嚙齒動物致癌性證據權重（Weight-of-evidence rodent carcinogenicity）、5）致癌潛能TD50（Carcinogenic potency TD50）、6）潛在發育毒性（Developmental toxicity potential）、7）大鼠口服LD50（Rat oral LD50）、8）大鼠最大耐受劑量（Rat maximum tolerated dose）、9）大鼠長期口服最低毒副反應水平（Rat chronic oral lowest observed adverse effectlevel，LOAEL）。

1.9 分子對接

1.9.1 配體結構優化 使用DS 軟件的“Macromolecules” 模塊下的 “Build and Edit Protein”工具，將篩選出的多肽序列按照特定順序輸入到程序中；利用“Small Molecules”模塊下的“Minimize Ligands”和“Prepare Ligands”工具對肽的結構在CHARMm 力場下進行能量優化。

1.9.2 準備受體蛋白 從RCSB 蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）獲取Keap1 蛋白的天然晶體結構（PDB 代碼：2FLU）。使用DS 軟件打開PDB文件，刪除水分子、氫原子及原有受體所攜帶的配體，并對蛋白進行加氫處理，再使用“Macromolecules”模塊下的“Clean Protein”工具除去蛋白多構象，使Keap1 蛋白補充完整的氨基酸殘基。通過DS 軟件的“Receptor-Ligand Interactions”模塊下的“Define and Edit Binding site”工具定義受體靶標活性位點，活性中心坐標（X：5；Y：9；Z：1），對接半徑為15?[32]。

1.9.3 半柔性分子對接 使用DS 軟件的“Receptor-Ligand Interactions” 模塊下的“Dock Ligands（CDOCKER）”，在“Input Ligands”欄選擇全部優化后的配體，其余參數默認不變。將受體定義為剛性，配體定義為半柔性，進行半柔性分子對接，根據“-CDOCKER Energey”值評定分子對接效果。

1.10 分子動力學模擬

使用DS 軟件的“Simulation”模塊進行分子動力學模擬，將最終所篩選出的CDEF 肽序列-Keap1 最優結合復合物結構在“Macromolecules”模塊下的 “Prepare protein” 進行蛋白質預處理，在“Simulation”模塊下的“Apply forcefield”為蛋白復合物添加charmm36 力場，用“Solvation”對其進行溶劑化處理，在“Run simulation”中的“Standard Dynamics Cascade”進行分子動力學模擬，參數設置如下：升溫階段由50 K 逐漸加熱至300 K，模擬加熱時間4 ps，平衡階段模擬時間設置為20 ps，模擬采樣階段設置為0.2 ns[33]。

2 結果與分析

2.1 牛乳清蛋白的虛擬酶解及抗氧化肽的篩選

為了在人體內發揮生物效應，生物活性肽必須經過胃腸道消化，然后在胃腸道吸收后以活性分子形式到達其目標部位[34]。因此本研究將牛乳清蛋白源的主要5 種蛋白成分用胃蛋白酶（EC 3.4.23.1）和胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）虛擬消化，通過虛擬消化程序，計算出β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白及牛乳鐵蛋白的水解度分別為28.25%，24.82%，21.43%，29.87%及27.16%，結果表明牛血清白蛋白被兩種酶水解程度最大，可能會消化產生相對更多的肽段。然后將消化后得到的多肽用PeptideRanker 程序進行生物活性肽評分預測，并將PeptideRanker 評分＞0.4的生物活性肽篩選出來，最終與BIOPEP-UWM 和SATPdb 數據庫中已報道的活性肽序列進行對比，具體篩選評分結果見表1。

表1 虛擬酶解及數據庫分析得到的肽Table 1 Peptides obtained by virtual enzymatic hydrolysis and database analysis

研究表明抗氧化肽具有以下特征：1）抗氧化肽一般含有0～20 個氨基酸；2）肽序列中含有Pro、Gly、Ala、Val 和Leu 的蛋白肽具有潛在的抗氧化活性；3）帶有芳香環（Tyr、Trp、Phe）、咪唑基（His）和含硫基（Met、Cys）的肽鏈直接淬滅自由基[35]。由表1 可知，5 種蛋白質（β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清白蛋白及牛乳鐵蛋白）分別篩選出11，8，38，36，44 條生物活性評分大于0.4 的肽段，一共137 條多肽，大多數篩選出的多肽符合抗氧化肽的特征性。接下來對比BIOPEP-UWM 和SATPdb 數據庫，對未報道過的多肽進行毒性、過敏性及水溶性分析，通過3 項評價進一步篩選出無毒、無過敏性及水溶性良好的抗氧化肽，詳細結果見表2。

表2 肽的毒性、過敏性及水溶性分析Table 2 Toxicity，allergy and water solubility analysis of peptides

采用ToxinPred 程序對多肽進行毒性預測，結果顯示絕大多數肽在此程序設定的2 種模型下表現為無毒。乳蛋白的過敏性是乳制品中不可忽視的重要因素，乳清蛋白中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白是除酪蛋白外的嬰兒牛乳過敏癥的主要致敏因子[36]，因此需要對乳清蛋白源抗氧化肽進行過敏性預測。通過AllerTOP v.2.0 程序預測肽的過敏性，結果顯示大約50%的的多肽被預測為具有過敏性，說明牛乳清蛋白在經過胃腸道消化后依然會有許多過敏性多肽產生。多肽的水溶性是其在機體內轉運分布的基礎，也是應用食品、生物及材料化學研究時需要考慮的重要指標[37]。通過Innovagen 網站預測肽的水溶性，結果顯示有近一半多肽的水溶性被判定為差。綜合分析毒性、過敏性及水溶性3 項性質，可以發現α-乳白蛋白源的多肽沒有同時符合無毒、無過敏性及水溶性良好的抗氧化肽，而β-乳球蛋白源的多肽只有PMHIR和DAQSAPL 序列同時符合這3 個條件。將同時符合3 個條件下的多肽進行相關物理化學分析，詳細結果見表3。

表3 肽的分子質量、等電點及pH=7 時的凈電荷分析Table 3 Molecular weight，isoelectric point and net charge analysis at pH=7 of peptide

2.2 藥物代謝動力學分析

藥物代謝動力學是一門傳統上的生命科學學科，可以研究藥物或候選藥物在藥理過程中的可用性，并表征其進入機體體內吸收、轉移及代謝的生物轉化過程[38]。研究多肽的藥物代謝動力學行為可有效地指導多肽的結構優化與系統篩選，對藥物的深入開發及應用具有重大意義[39]。

2.2.1 多肽的ADMET 分析 ADMET 是一種基于機器學習的有助于預測和篩選良好候選藥物的方法，可以減少對藥物進行傳統試驗方法的篩選，同時減少應用于臨床治療時的失敗[40-41]。多肽的ADMET 分析如表4、5 所示，所有乳清蛋白源的多肽序列的人體腸道吸收（HIA）均很差，這是因為本研究選用的是生物體胃腸道中存在的胃蛋白酶和胰蛋白酶，獲得的抗氧化肽會抵御胃腸道的消化吸收，這并不意味著其抗氧化能力無法在機體中表現出來，一些抗氧化肽的抗氧化作用的表達往往需要能夠抵御胃腸道的消化作用[42]。除了免疫球蛋白源的YWCK 和牛血清白蛋白源的QNCDQF 肽序列在25 ℃水溶性表現為非常高，其余多肽在25 ℃水溶性都表現為極高，這說明所有多肽都具有良好的水溶性，同時也印證了前文通過Innovagen 網站預測肽的水溶性的準確性。多肽的血腦屏障通透性（BBB）均表現為未定義，通過打分數字的命名規律以及腸道吸收率可以預測出其對血腦屏障的穿透性也很低[43]。所有多肽均無細胞色素P450 2D6 抑制性。除β-乳球蛋白源的DAQSAPL、免疫球蛋白源的CPR 及牛乳鐵蛋白源的CAGDDQGL、AAPR 肽序列有肝毒性，其余多肽均無肝毒性。血漿蛋白與藥物分子的結合會影響藥物的效率，因為結合部分會暫時避免代謝，所有多肽的血漿蛋白結合率（PPB）均小于90%，表明其均不會影響藥物結合的效率。

表4 Admet 評分參考表Table 4 Reference table of ADMET score

表5 肽的ADMET 分析Table 5 ADMET analysis of peptides

2.2.2 多肽的TOPKAT 分析 TOPKAT 是根據其二維分子結構來準確、快速地評估化學品毒性的預測手段，DS 軟件中使用了一系列穩定的、交叉驗證的、定量的結構-毒性關系（QSTR）模型來評估化合物特定的毒理學性質。肽的Topkat 毒性分析詳情見表6、7。

表6 Topkat 評分參考表Table 6 Topkat scoring reference table

表7 肽的Topkat 毒性分析Table 7 Topkat toxicity analysis of peptides

埃姆斯致突變性模型是根據美國環保署基因毒素協議檢測的化合物開發出來的，結果顯示所有多肽序列均無致突變性。美國國家毒理學計劃（National toxicology program，NTP）和美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）數據集下的嚙齒動物致癌性模型均是具有統計學意義和交叉驗證的定量結構-毒性關系（QSTR）模型，結果顯示所有多肽在NTP 數據集下的嚙齒動物致癌性模型（包含雌性大小鼠和雄性大小鼠）中均無致癌性；在FDA 數據集下的嚙齒動物致癌性模型中，β-乳球蛋白源的PMHIR 肽序列在雌性小鼠模型中表現為單劑量致癌性，在雄性小鼠模型中表現為多劑量致癌性，其次免疫球蛋白源的CPR 和YWCK、牛乳鐵蛋白源SQSCAPGADPK 和AAPR 肽序列在雌性大鼠模型中表現為單劑量致癌性，而免疫球蛋白源（牛乳鐵蛋白源）的QGR 和GGK、牛血清白蛋白源的CCTK 及牛乳鐵蛋白源的肽序列在雄性小鼠模型中表現為多劑量致癌性，在雌性大鼠模型中表現為單劑量致癌性，最后牛乳鐵蛋白源的CAGDDQGL 肽序列在雄性小鼠模型中表現為多劑量致癌性。嚙齒動物致癌性證據權重模型是使用美國食品和藥物管理局藥物評估和研究中心證據權重協議所制定的QSTR 模型，結果顯示所有多肽在此模型下均無致癌性。潛在發育毒性模型是來源于374 篇開放文獻中開發得到的，此模型僅包括大鼠口服的數據，結果顯示免疫球蛋白源（牛乳鐵蛋白源）的QGR、牛血清白蛋白源的GEYGF 在此模型下表現為有毒，其余多肽均表現為無毒。

DS 軟件中關于大鼠耐受劑量預測主要包括致癌潛能TD50、大鼠口服LD50、大鼠最大耐受劑量及大鼠長期口服最低毒副反應水平，耐受劑量多少可為后續多肽應用于食品、生物及醫療方面提供理論數據支持，詳細結果見表8。

表8 Topkat 預測相關大鼠耐受劑量表Table 8 Tolerance dose table of Topkat prediction related rats

綜合分析以上藥物代謝動力學結果，將在所有ADMET 和TOPKAT 數據模型下無毒、無致突變性及無致癌性的多肽序列篩選出來用于分子對接分析，可以發現β-乳球蛋白源的序列在此環節中無符合全部條件的多肽。

2.3 分子對接

在生物活性肽研究領域，分子對接可以基于結構構象表征肽在受體蛋白結合位點的行為，分子對接過程包括預測受體內配體的分子方向，然后使用結合親和力評分函數計算受體-配體的互補相互作用[44-45]。雖然蛋白質水解物和肽的抗氧化作用的潛在機制尚未完全研究清楚，但據報道Keap1-Nrf2 通路是消除體內氧化應激的最可能機制，在Keap1-Nrf2 通路中，Nrf2 因子在遷移到細胞核后可與抗氧化反應元件ARE 序列結合，并啟動血紅素加氧酶1 的表達，從而激活抵抗氧化應激的防御系統[46]。當機體內細胞處于氧化應激條件下，外來的抗氧化劑會干擾Keap1-Nrf2 相互作用，從而最終激活ARE 序列調控細胞內一系列具有抗氧化功能的酶（如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等）的基因表達，從而促進機體的抗氧化能力[47]。為了進一步篩選乳清蛋白源抗氧化肽，并解釋抗氧化肽的在Keap1-Nrf2抗氧化通路的分子機制，對乳清蛋白源抗氧化肽進行分子對接分析。準備好的受體蛋白見圖1 所示。

圖1 原始蛋白（a）及準備好的受體蛋白（b）Fig. 1 Original protein（a）and prepared receptor protein（b）

2.3.1 分子對接評分 乳清蛋白源生物活性肽可以通過分子對接的方式研究其生物活性，如Li等[48]借助分子對接研究了乳清蛋白水解物中的4種多肽（PQVSTPTL、MPGP、PMHIR、PPLT）的ACE抑制機理，結果顯示乳清蛋白水解物可能是獲得新型ACE 抑制肽的合適來源。對接結果中“-CDOCKER Energy” 值是受體與配體相互作用力或結合親和力的評分，其值相對越高，表示受體與配體結合的越緊密、越容易[49]。本研究通過將前步篩選得到的13 條乳清蛋白源抗氧化肽與Keap1 受體進行分子對接，并選擇文獻中報道過的乳清蛋白源抗氧化肽WYSL[50]作為陽性對照也與Keap1 受體進行分子對接，具體對接結果見表9。

分子對接結果顯示，相較陽性對照抗氧化肽WYSL，本研究篩選出的乳清蛋白源抗氧化肽的“-CDOCKER Energy”大多數高于WYSL 序列，說明篩選出的抗氧化肽能夠較好地與Keap1 蛋白結合從而發揮抗氧化性，同時也印證了本研究前面篩選步驟的真實性與可靠性。選取“-CDOCKER Energy” 值排名前4 位的多肽以及陽性對照（WYSL 序列）與Keap1 受體進行相互作用分析。

2.3.2 分子對接相互作用分析 Keap1 的分子突變試驗證明，ETGE 基序是與Keap1 的Kelch 結構域結合時關鍵基序[51]。研究表明，接觸ETGE 基序相互作用的殘基分別是3 個Arg 殘基（Arg380、Arg415 和Arg483）、4 個Ser 殘基（Ser363、Ser508、Ser555 和Ser602），以及Kelch 結構域中Tyr334、Asn382 和Gln530 的殘基，此外Asn387、His436、Tyr525、Tyr572 和Phe577 的殘基在Keap1-Nrf2蛋白質-蛋白質相互作用中也起著關鍵作用[52]。圖2～6 表示的是陽性對照（WYSL 序列）、選定的4 個多肽分別與Keap1 活性位點分子對接相互作用的結果圖（包括3D 和2D 模式圖）。陽性對照（WYSL序列）為已報道過的乳清蛋白源抗氧化肽，在體外試驗驗證中表現出良好的抗氧化性[50]。圖2 對接結果顯示WYSL 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg415 和Arg483 之間形成鹽橋和電荷吸引力，與氨基酸Ser508、Arg483 之間形成常規氫鍵，與氨基酸殘基Tyr572 之間形成碳氫鍵和π-供體氫鍵，與氨基酸殘基Phe577、Tyr572 之間形成π-π相互作用，與氨基酸殘基Tyr525、Tyr572 之間疏水相互作用，與氨基酸殘基Tyr334、Arg380、Asn414、Ile461、Phe478、Ala556、Ser555、Gln530 之間形成范德華力。其中9 個氨基酸殘基Arg415、Arg483、Ser508、Tyr572、Tyr525、Tyr334、Arg380、Ser555、Gln530 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關鍵殘基，因此陽性對照（WYSL 序列）具有在體內發揮抗氧化性的潛力，驗證了前人的結論。圖3 對接結果顯示EDEGWYWCGVK 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg483、Arg380、Arg415 之間形成鹽橋、電荷吸引力及π-陽離子作用，與氨基酸殘基Arg415、Asn414 之間形成常規氫鍵，與氨基酸殘基Tyr334、Gly462、Gly511、Leu557、Ala366、Val418、Gly603 之間形成碳氫鍵和π-供體氫鍵，與氨基酸殘基 Gly574、Tyr572、Asn382、Phe577、Ser363、Gly509、Ile416、Ala510、Val463、Gly464、Gly558、Gly417、Gln530、Tyr525、Ser555、Ser602、Gly364、Ala556、Leu365、Gly605、Ile461、Ile559、Val604、Val606、Val512、Val465 之間形成范德華力。其中11 個氨基酸殘基Arg483、Arg380、Tyr334、Tyr572、Asn382、Phe577、Ser363、Gln530、Tyr525、Ser555、Ser602 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關鍵殘基，說明EDEGWYWCGVK 序列也具有在體內發揮抗氧化性的潛力。圖4 對接結果顯示QNCDQF 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg483、Arg415 之間形成鹽橋，與氨基酸殘基Arg380、Gln530 形成常規氫鍵，與氨基酸殘基Tyr334 形成π-π 相互作用，而同時也與氨基酸殘基Tyr334 之間形成不利的供體-供體相互作用，與氨基酸殘基Asn382、Ser602、Ser363、Gly603、Gly364、Tyr572、Phe577、Tyr525、Ala556、Asn414、Ser555 之間形成范德華力。其中11 個氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Tyr334、Asn382、Ser602、Ser363、Tyr572、Phe577、Tyr525、Ser555 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關鍵殘基，說明QNCDQF 序列也具有在體內發揮抗氧化性的潛力。圖5 對接結果顯示CDEF 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380 之間形成鹽橋、電荷吸引力及π-陰離子作用，氨基酸殘基Ser508、Asn414、Tyr334、Asn382、Arg483、Arg380 之間形成常規氫鍵，與氨基酸殘基Arg415 之間形成碳氫鍵，而與氨基酸殘基Arg415 之間形成不利的陽性-陽性相互作用，與氨基酸殘基Tyr525 之間形成π-π 相互作用，與氨基酸殘基Gln530、Ser555、Gly509、Ile461、Ala556、Ser602、Ser363、Gly364、Gly603、Tyr572 之間形成范德華力。其中12 個氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Ser508、Tyr334、Tyr334、Tyr525、Gln530、Ser555、Ser602、Ser363、Tyr572 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關鍵殘基，說明CDEF 序列也具有在體內發揮抗氧化性的潛力。圖6 對接結果顯示DEF 序列與Keap1 分子的氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Tyr334 之間形成鹽橋和電荷吸引力，與氨基酸殘基Ser508、Arg415、Asn414、Arg380、Asn382、Tyr334 之間形成常規氫鍵，與氨基酸殘基Arg415 之間形成碳氫鍵，而與氨基酸Arg380 之間形成不利的陽性-陽性相互作用，與氨基酸殘基Tyr572 之間形成π-π 相互作用，與氨基酸殘基Ala556 之間形成疏水相互作用，與氨基酸殘基Phe577、Ser602、Ser555、Tyr525、Gln530、Ile461 之間形成范德華力。其中11 個氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Tyr334、Ser508、Tyr334、Phe577、Ser602、Ser555、Tyr525、Gln530 是影響Keap1-Nrf2 相互作用的關鍵殘基，說明DEF序列也具有在體內發揮抗氧化性的潛力。

圖2 陽性對照（WYSL 序列）與Keap1 活性位點相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 2 3D（a）and 2D（b）pattern of interaction between positive control（WYSL sequence）and Keap1 active site

圖3 EDEGWYWCGVK 與Keap1 活性位點相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 3 3D（a）and 2D（b）mode diagram of the interaction between EDEGWYWCGVK and Keap1 active site

圖4 QNCDQF 與Keap1 活性位點相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 4 3D（a）and 2D（b）pattern of interaction between QNCDQF and Keap1 active site

圖5 CDEF 與Keap1 活性位點相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 5 3D（a）and 2D（b）pattern of interaction between CDEF and Keap1 active site

圖6 DEF 與Keap1 活性位點相互作用的3D（a）和2D（b）模式圖Fig. 6 3D（a）and 2D（b）pattern of interaction between DEF and Keap1 active site

綜合分析上述結果，4 種所選多肽相較陽性對照（WYSL 序列）均具有更多影響Keap1-Nrf2相互作用的重要殘基，說明本研究前期抗氧化肽篩選過程的合理性與嚴謹性。同時可以發現所選4 種多肽中的CDEF 序列與Keap1 分子間存在最多影響Keap1-Nrf2 相互作用的關鍵殘基（12 個），同時也存在最多的氫鍵作用力（6 個），因此CDEF序列可能是所選肽段中具有最高抗氧化活性的多肽序列，它可以與Keap1 分子競爭性結合并釋放Nrf2 因子，并通過激活Keap1-Nrf2-ARE 途徑在體內顯示抗氧化活性。與本研究結果相似的是，Wei 等[53]從發酵魯賓奶酪中獲得的YPFPGPIH 肽序列也可以激活Keap1-Nrf2 途徑激活抗氧化機制。

2.4 分子動力學模擬

分子對接是從結構的角度出發去評估對接結合的緊密程度，而藥物的設計不能單從結構出發，往往需要考慮溶劑、溫度及反應動力學的因素，分子動力學模擬是量化局部和全局蛋白質動力學的強大計算工具[54]。從分子對接中篩選出的最具抗氧化活性潛力的CDEF 序列，將其與Keap1 分子最優結合復合物進行分子動力學模擬，具體模擬結果見圖7。結果顯示，CDEF-Keap1 復合物在分子動力學模擬過程中，RSMD 在所產生的100 個構象中逐漸穩定，最終在200 ps 左右穩定時結合自由能約為210.87 kJ/mol，說明復合物在分子動力學模擬過程中結構變化相對平穩，氫鍵熱圖說明了復合物在模擬過程中與較多小分子形成氫鍵作用力，在前80 個構象氫鍵變化并不顯著，因此可判斷出復合物可能沒有經歷較大的構象變化[55]。進一步說明了篩選出的抗氧化肽CDEF 可以在人體中較好地發揮其抗氧化活性。

圖7 CDEF-Keap1 復合物的分子動力學模擬RMSD 圖（a）、能量變化圖（b）及氫鍵熱圖（c）Fig. 7 Molecular dynamics simulation RMSD diagram（a），energy change diagram（b）and hydrogen bond heat diagram（c）of CDEF-keap1 complex

3 結論

本研究通過虛擬消化牛乳清蛋白，將能夠抵御胃腸道消化的肽段進行初步酶解篩選，并通過相關活性預測及藥物代謝動力學對肽段進行細致篩選，將無毒、無致敏性、無致突變性、無致癌性及水溶性良好的肽段挑選出來，并對符合條件的肽段與Keap1 受體進行半柔性分子對接，通過分子對接評分和作用機理分析對肽段的抗氧化活性潛力進行評估，最終篩選出了最具抗氧化活性潛力的CDEF 肽序列，其與Keap1 受體的氨基酸殘基Arg483、Arg415、Arg380、Ser508、Tyr334、Tyr334、Tyr525、Gln530、Ser555、Ser602、Ser363、Tyr572 之間形成的鹽橋、電荷吸引力、π-陰離子作用、常規氫鍵、碳氫鍵、π-π 相互作用及范德華力，可能有助于激活Keap1-Nrf2-ARE 途徑使其在體內顯示抗氧化活性。分子動力學模擬分析表明CDEF 肽序列具有良好的結合能力與穩定性，可能成為抗氧化的候選藥物。本研究基于生物信息學的手段詳細闡述了如何從牛乳清蛋白源篩選出抗氧化肽，研究結果對進一步認識肽的抗氧化作用機制有一定的指導意義，為后續篩選天然食品源抗氧化肽提供了一定的理論基礎。