四川泡菜母水的微生物群落與理化特性分析

胡此海，楊 絮，郭全友*，鄭 堯，李保國，范逸文

（1 上海理工大學健康科學與工程學院 上海200093 2 中國水產科學研究院東海水產研究所 上海 200090）

泡菜是以新鮮蔬菜等為主要原料，添加或不添加輔料，經食用鹽或食鹽水泡漬發酵等工藝加工而成的蔬菜制品。蔬菜在高滲透壓的食鹽溶液中，利用乳酸菌產酸，共同抑制其它有害微生物的生長[1]。四川泡菜是我國最著名的發酵蔬菜之一，有“川菜之骨”的美稱[2]，其加工工藝簡單，原料成本低廉，成品鮮香味獨特，具有開胃理氣，降低膽固醇和促進腸道內菌群生態平衡等功效[3-4]。常見的泡菜發酵方式包括自然發酵、接種發酵和母水發酵。自然發酵存在周期較長和產品質量難以標準化等問題，而接種發酵的泡菜風味欠佳。母水是泡菜發酵成熟后取出泡菜剩下的液體，以母水作為發酵劑循環使用的方式稱為母水發酵。母水發酵泡菜中丙二醇、甘油、甘露醇、乳酸和草酸等含量較高，且氨基酸種類更豐富，比自然發酵和接種發酵具有更好的風味和口感[5]。然而，不同來源的泡菜母水微生物群落結構和理化特性均不同，目前主要用于小作坊式自制泡菜，尚未大規模工業化標準化生產。

泡菜發酵過程中的微生物群落影響成品的理化特性，并最終影響泡菜品質。目前，高通量測序技術為解析微生物群落提供一種高效、便捷的方法，其具有測序快捷、基因信息量大以及微生物分析全面等特點，已應用在白酒[6]、醋[7]和發酵魚[8]等食品中的微生物分析。研究發現乳酸菌（LAB）如明串珠菌、乳桿菌和魏斯氏菌被確定為泡菜發酵過程中微生物群落的主要微生物[9]。Rao 等[10]采用高通量測序揭示了不同發酵階段蘿卜泡菜的微生物群落，結果表明泡菜發酵成熟后期的微生物群落在屬水平主要是乳酸桿菌屬和畢赤酵母屬。Yang 等[11]對泡菜微生物與理化特性相關性進行研究，發現植物乳桿菌、醋酸乳桿菌、魏氏乳桿菌和假腸系膜明串珠菌與理化特性（pH 值、總酸、質構、有機酸和游離氨基酸）具有顯著相關性。An等[12]發現發酵蔬菜中醋桿菌和葡糖桿菌與總酸呈顯著正相關關系，與鹽濃度呈顯著負相關關系（P＜0.05）。

目前對母水發酵泡菜方式的研究大多針對泡菜成品，對泡菜母水的研究較少，且集中于發酵過程中微生物和風味物質的變化，忽視了不同來源泡菜母水中微生物群落的共有微生物，以及微生物群落與其理化特性間的關系。泡菜母水是發酵后期的產物，微生物群落較為穩定，是篩選母水發酵泡菜菌株的優良來源。本研究以優選傳統發酵泡菜母水為對象，分析其理化特性，采用高通量測序技術解析微生物的群落結構，并用相關性分析法探究傳統四川泡菜母水中微生物群落與理化特性的關系，為高效發酵菌株的選育和工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡菜母水：2021 年5 月從四川成都等地不同工廠采集1 年以上泡菜母水30 份，并通過感官評價泡菜?？偡?00 分，色澤和香氣各占30 分，滋味占40 分，選擇10 位專業人員進行評定，通過盲評計分，對泡菜色澤、香氣、滋味進行打分，具體評分標準見表1。篩選得分超過90 分的泡菜，取其液體分別編號為A、B、C、D、E，樣品信息見表2。無菌取樣，貯存于無菌三角瓶中，低溫運至實驗室。

表1 泡菜感官評分標準Table 1 Pickles sensory scoring criteria

表2 樣品信息Table 2 Sample information

氫氧化鈉、酚酞、鉻酸鉀、硝酸銀標準滴定溶液等化學試劑（均為分析純級），國藥集團化學試劑有限公司；乳酸、草酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、蘋果酸，德國LGC 公司；OMEGA 土壤DNA試劑盒，美國OMEGA 公司；MiSeq Reagent Kit v3 測序試劑盒，美國Illumina 公司。

1.2 儀器與設備

1260 型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；pHS-3C 型pH 計，上海雷磁儀器廠；ABI-2720 型聚合酶鏈式反應儀，美國ABI 公司；Bio-Red 電泳儀，美國Bio-Rad 公司；Illumina Miseq 測序儀，美國Illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標測定 取25 mL 樣品混勻，用pH計測定樣品pH 值[13]。參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法測定樣品總酸[14]。鹽含量的測定參照GB 5009.44-2016《食品安全國家標準 食品中氯化物的測定》中的銀量法測定[15]。

1.3.2 有機酸檢測 參照Liu 等[16]的方法稍作修改，吸取5 mL 泡菜母水于離心管中，于75 ℃超聲處理，在12 000 r/min 離心15 min，取1.5 mL 上清液用0.22 μm 濾膜過濾至進樣瓶中待測。

色譜條件：C18 色譜柱（Zorbax SB-AQ，250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測器波長為210 nm，流動相為0.02 mol/L 磷酸二氫鈉-乙腈（99∶1，體積比，pH 2），流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量為10 μL。

1.3.3 DNA 提取和聚合酶鏈式反應（PCR）擴增吸取20 mL 泡菜水，于400 r/min 離心10 min，取上清液，于8 000 r/min 離心10 min 取菌泥，使用OMEGA 土壤DNA 試劑盒（D5625-01）按照說明書提取總基因組DNA 樣品，儲存在-20 ℃。采用正向引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和反向引物806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），對細菌16S-RNA 的V3-V4 區域進行PCR 擴增。將PCR 反應所需的成分配置完后，在PCR 儀上于98℃預變性5 min，使模板DNA 充分變性，然后進入擴增循環。在每一個循環中，先于98 ℃保持30 s使模板變性，然后將溫度降到53 ℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72 ℃保持45 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環。重復循環25 次，使擴增的DNA 片段大量累積。最后，在72 ℃保持5 min，使產物延伸完整，4 ℃保存。同樣，使用正向引物ITS5F（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和反向引物 ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC），對真菌ITS-V1 區域進行PCR 擴增。

1.3.4 基因測序 擴增結果進行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen 凝膠回收試劑盒回收目的片段。采用Illlumina MiSeq 平臺和MiSeq Reagent Kit v3 進行雙端2×250 bp 測序，測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.3.5 生物信息學分析 細菌16S rDNA 基因序列基于Silva 數據庫[17]，真菌ITS 基因序列基于U nite 數據庫[18]。使用QIIME2 2019.4 進行，使用DADA2 插件對序列進行質量過濾、去噪、合并和去除嵌合體。進行擴增子序列變異體（Amplicon sequence variants，ASV）與mafft 對比，并用于構建具有fasttree2 的系統發育。采用RDP Classifier貝葉斯算法對100%相似水平的ASV 代表序列進行分類學分析、α 多樣性和分類學地位注釋。

1.4 統計分析

試驗重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示。通過統計軟件SPSS 26 中進行方差分析及顯著性分析（置信區間為95%），利用Origin 2021 b軟件和派森諾基因云平臺繪圖。微生物群落與理化特性采用采用斯皮爾曼相關分析方法，利用R語言繪圖（置信區間為99%和95%）。

2 結果與分析

2.1 泡菜母水理化特性

2.1.1 pH 值、總酸含量和鹽含量的測定 總酸（Total acid，TTA）和pH 值影響泡菜發酵過程中微生物生長和代謝產物，是泡菜成熟度的評判指標[19-20]。由表3 可知，泡菜母水pH 值在3.27～4.71之間，B 樣品pH 值（4.71±0.01）顯著（P＜0.05）高于其余4 份樣品pH 值（3.27～3.65）。云琳等[21]研究發現鹵水泡菜的pH 值穩定在3.7 左右，與本試驗研究一致。5 份樣品總酸含量在3.00～18.90 g/kg 均具有顯著性差異（P＜0.05）。傳統發酵泡菜母水的pH 值和總酸含量存在差異性，可能與微生物群落、發酵工藝、發酵時間有關。

表3 泡菜母水的理化指標Table 3 Physicochemical index of pickle brine

鹽含量使泡菜母水具有較高的滲透壓，高滲透壓會抑制腐敗菌的生長，有利于泡菜的保存，因此泡菜母水發酵的泡菜具有較長的貨架期。表3可見，5 份樣品鹽含量為11.00～15.50 g/100 g，其中A 樣品的鹽含量（15.50±0.71 g/100 g）顯著高于其余樣品（P＜0.05），而B、C、D 和E 樣品的鹽含量無顯著差異（P＞0.05），總體顯示泡菜母水的鹽含量較為一致。鄧維琴等[22]發現所有代數泡菜母水中鹽度無顯著性差異（P＞0.05），說明泡菜母水中鹽度是穩定的，與本試驗研究較為一致。

2.1.2 有機酸含量測定 由表4 可見，樣品中檢測出草酸（Oxalic acid）、酒石酸（Tartaric acid）、蘋果酸（Malic acid）、乙酸（Acetic acid）、檸檬酸（Citric acid）、琥珀酸（Succinic acid）和乳酸（Lactic acid）7 種有機酸。乳酸在不同泡菜母水中的含量差異較大，其中A 樣品含量最低為（0.30±0.01）mg/mL，C 樣品含量最高為（3.10±0.43）mg/mL，其它樣品的含量在1.02～1.76 mg/mL 之間。乳酸主要是乳酸菌通過糖類物質代謝產生，主要有同型發酵和異型發酵，其酸味柔和爽口，賦予泡菜獨特的風味。草酸含量為2.62～5.37 mg/mL，其中D 和E樣品草酸含量顯著高于其它樣品（P＜0.05）。琥珀酸含量為5.35～7.42 mg/mL，其中E 樣品琥珀酸含量【（7.42±0.18）mg/mL】顯著高于其它樣品（P＜0.05）。草酸和琥珀酸也是泡菜中重要的風味物質，主要來源是泡菜原料，因此泡菜母水中的含量普遍較高。鄧維琴等[22]發現琥珀酸含量在泡菜母水中逐漸上升，后期泡菜母水含量差異較小，與本試驗研究一致。酒石酸含量為0.09～1.35 mg/mL，其中C 樣品中含量顯著高于其余樣品（P＜0.05），A樣品中未檢出。C 樣品乙酸含量【（2.89±0.04）mg/mL】和B 樣品中乙酸含量【（2.50±0.05）mg/mL】顯著高于其余樣品（P＜0.05）。檸檬酸含量為0.59～2.14 mg/mL，樣品之間存在顯著差異（P＜0.05）。酒石酸、乙酸和檸檬酸的產生和積累主要取決糖類物質的代謝和原料提供的底物，對泡菜獨特的風味形成具有重要作用。黃巖等[23]研究表明酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸等味道柔和、刺激性小，可顯著改善泡菜風味，比例協調、多種有機酸共同作用可使泡菜風味更加醇和與豐富。研究發現樣品中草酸隨著發酵時間的增長而減少，而乳酸含量與發酵時間成正比。樣品中有機酸含量不相同的原因，可能是原料不同和微生物組成差異導致[11，24]。

表4 泡菜母水有機酸含量Table 4 Organic acid content of pickle brine

2.2 泡菜母水微生物群落

2.2.1 Alpha 多樣性分析 利用MiSeq 測序方法對5 種來源泡菜母水樣品進行分析，根據樣品的擴增子序列變異體（Amplicon sequence variants，ASV）數據結果作圖。如圖1 所示。隨著樣品的測序深度增加，香農指數（Shannon）逐漸增加，曲線逐漸從上升趨于平坦，提示所測序的深度可以囊括泡菜母水樣品中大多數的菌落，并且能夠較完整地反映樣品微生物群落多樣性[25]。

圖1 細菌（a）和真菌（b）稀疏曲線分析Fig. 1 Rarefaction curve analysis of bacteria（a）and fungi（b）

Alpha 多樣性是指局部均勻生境下的物種在豐富度（Richness）、多樣性（Diversity）和均勻 度（Evenness）等方面的指標。為能較全面評估微生物群落的alpha 多樣性，以Chao 1 和可觀察物種指數表征豐富度，以香農指數和辛普森指數表征多樣性。表5 可知，A 的細菌Chao 1 指數（3 445.56±104.77）和可觀察物種指數（3 199.30±194.40）顯著高于其它樣品（P＜0.05）；A 的細菌香農指數（7.90±0.24）和辛普森指數（0.97±0.00）顯著高于其它樣品（P＜0.05）。A 的細菌多樣性最高，B 和D 的真菌Chao 1 指數和可觀察物種指數顯著高于其它樣品（P＜0.05）；E 的真菌香農指數（1.51±0.08）和辛普森指數（0.50±0.02）顯著高于其它樣品（P＜0.05）。在真菌方面，B 和D 具有較高的豐富度，而E 的真菌多樣性高于其余樣品。綜合考慮豐富度和多樣性的指標，A 樣品泡菜母水中的細菌微生物豐度和Alpha 多樣性較為突出，而D 樣品的真菌豐度和Alpha 多樣性較為突出?？赡苁窃虾桶l酵工藝不同導致不同泡菜母水具有不同的豐富度和多樣性。

表5 泡菜母水中微生物Alpha 豐富度指數和多樣性指數Table 5 Microbial Alpha richness index and diversity index in pickle brine

為研究不同樣本間共有物種，根據各處理組在100%序列相似水平下的ASV 生物信息統計，繪制泡菜母水樣品的韋恩圖[26]。圖2a 為不同樣品的細菌群落韋恩圖，A 樣品含有細菌ASV 7 513個，B 樣品含有細菌ASV 217 個，C 樣品含有細菌ASV 150 個，D 樣品含有細菌ASV 150 個，E 樣品214 個，其中5 種樣品共有細菌ASV 4 個。A 樣品含有的細菌ASV 數目最多，遠大于其它組樣品，與Alpha 多樣性結果一致。圖2b 為不同樣品得真菌群落韋恩圖，A 樣品含有真菌ASV 9 個，B 樣品含有真菌ASV 37 個，C 樣品含有真菌ASV 12個，D 樣品含有真菌ASV 53 個，E 樣品含有真菌ASV 21 個，其中5 種樣品共有真菌ASV 2 個。D樣品的真菌ASV 數目最多，與Alpha 多樣性結果一致。

圖2 泡菜母水樣品細菌群落（a）和真菌群落（b）韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of bacterial community（a）and fungal community（b）of pickle brine

2.2.2 細菌群落結構分析 5 種泡菜母水樣品序列通過RDP Classifier 貝葉斯算法對100%相似水平的ASV 代表序列進行分類，并對樣本中的相對豐度前10 進行分類學分析。在群落組成分析中，將相對豐度大于1%的物種歸為優勢菌。在門水平上，其樣品群落組成如表6 所示，發現樣品B、C、D、E 中主要由厚壁菌門（Firmicutes）組成，均超過99%，而A 樣品與其它4 種差異較大，厚壁菌門相對豐度為為22.64%，優勢門還有擬桿菌門、變形菌門、放線菌門，分別占比為71.27%，2.08%和2.17%。郭壯等[27]利用高通量技術對泡菜水進行研究，發現厚壁菌門是泡菜水的優勢門，與本文研究結果相同。

表6 不同樣品中細菌在門水平和屬水平的種類構成Table 6 The composition of bacteria at the level of phylum and genus in different samples

在屬分類水平上，樣品群落組成如表6 所示，泡菜母水中的細菌菌屬主要是乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）。B 和C 樣品的細菌菌屬組成較相似，其乳桿菌屬的占比分別是99.17%和99.95%；D 和E 樣品較相似，其中D 樣品中片球菌屬的占比為97.09%，乳桿菌屬的占比為2.27%，E 樣品中的片球菌屬的占比為78.29%，乳桿菌屬的占比為18.93%。A 樣品的細菌群落較為豐富，普氏菌屬（Prevotella_9）41.33%、擬桿菌屬（Bacteroides）15.98%、鼠桿菌屬（Muribaculaceae）9.94%、糞桿菌屬（Faecalibacterium）5.94%、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）3.67%、乳桿菌屬（Lactobacillus）2.81%、無桿菌屬（Agathobacter）1.70%、另枝菌屬（Alistipes）1.42%，這可能是其泡菜的原料和理化特性不同導致微生物群落不同。曹佳璐[28]對126 種老鹽水進行研究，發現乳桿菌屬是絕對優勢菌屬，耐酸乳桿菌、布氏乳桿菌、短乳桿菌 和耐乙醇片球菌4 種乳酸菌在所有樣品中的檢出率大于90%，是泡菜鹽水樣品的核心菌種。張安等[29]在解析四川泡菜發酵過程中的細菌多樣性發現乳桿菌屬在發酵的中期和后期都是絕對優勢菌。乳桿菌屬和片球菌屬也常見于各種發酵乳制品傳統發酵食品，在發酵過程中代謝產生大量乳酸、降低pH 值，抑制有害菌，并產生各種風味物質，最終使傳統發酵食品具有其特征風味[30-31]。

2.2.3 真菌群落結構分析 5 種來源泡菜母水樣品序列通過RDP Classifier 貝葉斯算法對100%相似水平的ASV 代表序列進行分類，并對樣本中的相對豐度前10 進行分類學分析。在門水平上，其樣品群落組成如表7 所示。發現5 種泡菜母水中的絕對優勢菌群為子囊菌門（Ascomycota），相對豐度分別為99.99%，99.91%，99.99%，99.92%及99.99%，還有極少量的擔子菌門（Basidiomycota）及其它的門類，而且菌群種類差別不大，表明在門水平上5 種泡菜母水樣品的真菌菌群豐富度差別不顯著。李恒等[32]四川地區泡菜研究結果表明，在泡菜發酵結束后真菌群落在子囊菌門占絕對優勢，所占比例達到99%以上，與本文的研究結果相同；呂嘉櫪等[33]傳統自然發酵老壇泡菜研究結果表明子囊菌門是優勢菌落，而其絕對優勢菌落占比達到77%以上，與本研究結果有一定差異，可能是發酵工藝、原輔料等不同所致。

表7 不同樣品中真菌在門水平和屬水平的種類構成Table 7 The composition of fungi at the level of phylum and genus in different samples

在屬分類水平上，其真菌群落組成如表7 所示，畢赤酵母屬（Pichia）在A、B、C 和E 樣品中相對豐度的占比均超過99%；而D 樣品與其余4 種差別極大，畢赤酵母屬的占比只有0.76%，遠低于其它樣品，優勢真菌屬為哈克斯坦酵母屬（Kazachstania）和德巴利酵母屬（Debaryomyces），占比為80.28%和18.44%，原因可能是原料的不同。唐麗等[34]在不同發酵時間工業蘿卜泡菜中發現畢赤酵母屬是其中的優勢真菌屬；Rao 等[10]在傳統發酵蘿卜泡菜中發現已鑒定的屬中，畢赤酵母屬表現出最高的優勢，豐度為96.23%，與本文結果相似。

2.3 優勢微生物和理化特性的相關性分析

泡菜母水的優勢菌屬與理化特性之間的相關性見圖3。乳桿菌與乳酸具有顯著正相關關系（P<0.05），與乙酸具有極顯著正相關關系（P<0.01），與檸檬酸呈現顯著負相關關系（P<0.05）。乳酸菌能將糖類代謝成風味物質，并且是乳酸產生的主要來源。Ye 等[35]研究微生物與腌制辣椒風味特性的關系，發現乳酸桿菌與有機酸（乙酸、琥珀酸、抗壞血酸和蘋果酸）具有高度相關性。鼠桿菌與鹽含量具有顯著正相關性（P<0.05），鼠桿菌是一種有益腸道菌，在代謝過程中主要產生丙酸[36]。片球菌屬與蘋果酸具有極顯著正相關關系（P<0.01），且與草酸、檸檬酸和琥珀酸呈正相關關系。畢赤酵母作為大多數樣品中的主要真菌屬，可能樣品畢赤酵母相對豐度差異性不顯著，導致與理化特性的相關性難以體現。結果表明，乳酸桿菌和片球菌與有機酸含量的相關性較高。

3 結論

對不同來源的泡菜母水中微生物群落和理化特性的分析，發現不同樣品中的微生物群落較為相似，而理化特性存在一定差異。選取的優良泡菜母水樣品pH 值和鹽含量較為穩定，總酸和有機酸含量不同，可能是由原料和微生物組成的不同以及循環使用代數不同所致。泡菜母水中主要存在的微生物在門水平為厚壁菌門和子囊菌門，在屬水平是乳桿菌屬、片球菌和畢赤酵母。通過對優勢微生物和理化特性進行相關性分析得出，乳酸桿菌與乳酸和乙酸具有顯著正相關關系，片球菌與蘋果酸具極顯著正相關關系，因此可以認為乳酸桿菌和片球菌是與有機酸相關的主要優勢菌株。本研究通過對不同來源的泡菜母水的研究，期望得到有利于泡菜產品的發酵菌株，為篩選優勢發酵菌株提供參考。