葡萄CYP707A 基因家族的鑒定及對果實成熟的功能驗證

龔麗麗 余花 楊杰 陳天池 趙雙瀅 吳月燕

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 200120；2.浙江萬里學院，寧波 315100）

葡萄（Vitis vinifera L.）是一種具有較高營養價值和經濟價值的非呼吸躍變型水果。水果的成熟期是其營養品質和適口性的關鍵影響因素［1］。中國南方葡萄成熟期往往伴隨著高溫、臺風和強降水等不利環境的影響。如何有效的避開不利生長季節對于葡萄生長和產業發展具有重要意義。

脫落酸（ABA）是一類在非呼吸躍變型果實起著重要作用的植物激素［2］。研究表明ABA 的積累可以通過激活上游NCED 酶或抑制下游ABA 8'-羥基化酶活性來調控植物生長［3］。有3 種不同的ABA 羥化途徑可以導致ABA 失活，通過氧化環結構不同的甲基（C-7'、C-8'和C-9'）影響內源ABA 的積累［4］。但ABA 8'-羥化酶編碼基因CYP707A，通常被認為是主要的ABA 分解代謝途徑。ABA 經CYP707A可被分解為相酸（PA），最終代謝產物為二氫相酸（DPA）［5］。研究表明，ABA 分解代謝的產物PA 在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的特定組織中可以激活ABA 受體PYL，在ABH2-1 突變體與過表達AtCYP707A3 雜交植株中，由于PA 降解途徑被阻斷和過量分解ABA，造成高PA 和低ABA 內源環境，這種植株并沒有表現出一些ABA 生物合成突變體所觀察到的生長遲緩，意味著8'-羥基化的途徑不僅是ABA 一個失活反應，同時在某些方面如低ABA 條件下具有補償作用［6-7］。另一項研究表明，ABA 9'-羥基化也被CYP707As 催化，這是ABA 8'-羥基化的一個副反應［8］。研究表明CYP707As 是獨腳金內酯信號通路的效應物［9］。CYP707As不僅調控ABA穩態，還參與信號通路過程。

近年來，ABA 8'-羥基化反應的關鍵酶已從許多植物中分離出來，并被證明在植物發育中發揮重要作用。從擬南芥中分離到4 個CYP707A 基因，其中AtCYP707A2 在種子萌發中起著至關重要的作用［10］。蘋果（Malus domestica Borkh）中鑒定出的MdCYP707A2.3 對蘋果樹延遲開花和解除休眠起到關鍵作用［11］。然而，關于CYP707A 在非呼吸躍變型水果中的作用卻知之甚少。在草莓（Fragaria ananassa Dchesne）中鑒定出4 個FaCYP707A 基因，這些基因可能在草莓果實發育過程中發揮組織特異性作用，FaCYP707A3 可以讓植株適應鹽脅迫［12］。櫻桃（Prunus avium L.）CYP707A1 和PacCYP707A3在水分脅迫和ABA 處理下受到正調控［13］。這些結果表明，CYP707A 基因家族在植物代謝中發揮著不同的作用，可以在各種脅迫下通過轉錄調控內源性ABA 水平，使植物更好地適應環境。

闡明果實成熟的調控機理對提升果實品質和提高經濟效益具有重要的指導意義，近年來，ABA合成和信號傳遞在葡萄果實成熟中的調控機制已被廣泛關注［14］，但ABA 分解代謝酶在葡萄果實成熟中鮮有報道。本研究采用生物信息學方法鑒定VvCYP707A 基因家族成員，并分析其家族成員的理化性質、系統進化、基因結構、蛋白保守結構域和順式作用元件；通過qPCR 對VvCYP707As 的時空表達和組織表達特異性進行分析，并結合瞬時表達驗證，揭示VvCYP707As 的功能特征。旨在通過對VvCYP707As 的鑒定和功能分析，進一步了解葡萄果實成熟的調控機制，以期為生物育種提供有效的理論依據，從而促進地區葡萄產業健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料葡萄品種‘鄞紅’和‘甬早紅’采摘自中國浙江寧波鎮海（121°32'E，29°59'N）。ABA脅迫以果園內初始生長狀況一致的五年生‘鄞紅’葡萄植株9 株為材料。瞬時表達實驗以‘鄞紅’轉色期果實為材料。

1.2 方法

1.2.1 VvCYP707A 家族鑒定 為了從葡萄基因組數據庫（http://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-55/gff3/vitis_vinifera/）中鑒定 出VvCYP707A 基 因，使用NCBI 中的蘋果和擬南芥等物種的36 個CYP707A 蛋白作為查詢序列，利用Blastp，篩選出相似度超過50%的序列，刪除序列過短的蛋白。使用circos 繪制基因共線性圖。

1.2.2 VvCYP707A 蛋白分析 利用ExPASy software（http://web.expasy.org/protparam/）預測VvCYP707 蛋白的等電點和分子量。利用葡萄數據庫中的定位信息，使用TBtools 對VvCYP707A 基因在葡萄染色體上的位置進行可視化。使用在線網站ProtComp（ProtComp -Predict the sub-cellular localization for Plant proteins（softberry.com））對5 個CYP707A 蛋白進行亞細胞定位預測分析。

1.2.3 VvCYP707 家族的系統進化分析 使用默認參數的ClustalW 對27 個CYP707A 蛋白質進行多序列比對。采用MEGA 7.0 軟件，根據鄰接法構建無根系統發育樹，自展值為1 000。使用MEME（MEME-MEME Suite（meme-suite.org））分析motif 結構，使用GSDS（Gene Structure Display Server 2.0（gao-lab.org））分析基因結構。

1.2.4 VvCYP707A 基因啟動子順式元件的鑒定 提取AtCYP07A 和VvCYP707A 轉錄起始位點上游1.5 kb 序列，通過PlantCARE 網站（PlantCARE,a database of plant promoters and their cis-acting regulatory elements（ugent.be））分析順式元件。

1.2.5 VvCYP707A 基因表達模式分析 ‘鄞紅’為葡萄中熟品種，自開花到果實成熟約為90 d，‘甬早紅’由‘鄞紅’輻射突變而來，轉色時間較‘鄞紅’短，上色快，自開花到果實成熟約為75 d，為葡萄早熟品種［15］。分別采摘‘甬早紅’和‘鄞紅’不同發育時期果實、‘鄞紅’葉片和‘鄞紅’莖。其中，‘甬早紅’自開花后每隔15 d 采取樣品一次，‘鄞紅’自開花后每隔15 d 采取樣品一次，第5 次采樣與第4 次間隔30 d。共5 個時期，S1-S2 為幼果期，S3-S5 分別為膨大期、轉色期和成熟期。每個發育階段至少收集3 個樣本，果實一部分用來測定果實的理化性質，另一部分放入液氮中速凍，用于 RNA提取。

1.2.6 ABA 脅迫處理 選取果園內初始生長狀況一致的五年生‘鄞紅’葡萄植株9 株為材料，以施加清水組別為對照組，在轉色期的‘鄞紅’果實表面施加500 mg/L的外源ABA進行激素處理，在5 min，2、4、6、8 h 五個時間點隨機采集3 串果實樣本。所有樣品用液氮冷凍，并在80℃保存，用于RNA 提取。

1.2.7 VvCYP707A 過表達載體的構建與瞬時表達 采用雙酶切技術構建過表達載體，首先擴增Vitvi07g01751 基因的全長編碼序列，并將其插入到35S-3xFLAG-1300 載體中構建過表達載體35S:VvCYP707A，相關引物序列見表1，分別將攜帶空載體和目的基因的重組質粒轉化農桿菌GV3101，并注射到葡萄轉色期果實中，注射后的果實在正常條件下暗培養48 h 后，測定果實基因表達量和糖含量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2.8 果實品質理化指標測定 隨機挑選不同發育時期的果實各20 顆，電子天平（賽恩施，蘇州）測定果實重量，計算平均單果質量。指針式水果硬度計（艾德堡，中國）測定果實硬度，10 次重復并記錄。蒽酮硫酸比色法測定可溶性糖含量［16］，3 次重復。

1.2.9 RNA 提取與RT-qPCR 檢測 采用南京諾唯贊公司的RNA 提取試劑盒提取總RNA，使用上海近岸公司反轉錄試劑盒獲得cDNA 第一條鏈，上海近岸公司的SYBR qPCR Super Mix Plus 在Bio-Rad CFX96（Bio-Rad，美國）儀器上測定VvCYP707As的Ct 值，并以葡萄Actin 基因為內參基因［17］，使用2-ΔΔCt法計算相對基因表達量［18］。其中，表達模式分析以S1 為對照組；外源ABA 處理下以施加清水的組別為對照組。RT-qPCR 所用引物見表2。

表2 RT-qPCR 所用引物Table 2 Primers for RT-qPCR

1.2.10 數據統計 使用SPSS、Origin、GraphPad 和TBtools 等軟件對數據進行處理和繪圖。

2 結果

2.1 葡萄VvCYP707A基因家族的鑒定及其蛋白分析

葡萄CYP707A 家族含有5 個成員，分別位于第2、3、6、7 和18 號染色體上（圖1-C）；蛋白分析如表3 所示，它們編碼氨基酸序列一致性達70.60%，且氨基酸長度和分子量相近（447-488 aa，50 689.3-55 496.0 kD），為堿性蛋白（pI＞9）；亞細胞定位預測位于內質網；均含有血紅素鐵配位半胱氨酸殘基（PFGNGVHSCPG；圖1-A），說明葡萄CYP707A 家族高度保守。此外，共線性分析發現，Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792 發 生了片段復制（圖1-B）。

圖1 葡萄CYP707A 基因家族氨基酸比對（A）、共線性分析（B）與染色體定位（C）Fig.1 Amino acid alignment（A）,collinearity analysis（B）and chromosome localization（C）of grape CYP707A gene family

表3 葡萄CYP707A 蛋白相關信息Table 3 Information of CYP707A proteins in grape

2.2 葡萄VvCYP707A家族系統發育、基因結構和保守motif分析

從8 個物種中篩選出24 條同源性較高的CYP707A 序列，通過MEGA X 建立系統發育樹（圖2）。24 條蛋白可分為4 組，其中Vitvi02g01269 屬于 第1 組，Vitvi06g00498 屬于第2 組，其他3 個蛋白均屬于第4 組。每組都含有單子葉和雙子葉的CYP707A 蛋白，這表明該基因家族的起源先于單子葉和雙子葉植物的分化。

圖2 CYP707A 蛋白的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis of CYP707A protein

為了更好地分析葡萄CYP707A 蛋白的進化關 系，進一步 分析了4 個AtCYP707As 和5 個VvCYP707As 的系統發育樹、基因結構和保守基序（圖3）。將結果分為3 個分支，分別命名為Clade I、Clade II 和Clade III（圖3-A）。Clade III 包含了3 個片段復制的VvCYP707A 蛋白（Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792）。系統發育分析也顯示Vitvi06g00498 與AtCYP707A2 蛋白具有較高的同源性。從葡萄和擬南芥CYP707As 的基因結構可以發現，AtCYP707A 和VvCYP707A 基因的外顯子數量保守，在6-9 個之間（圖3-B）。Clade I 和Clade II 具有相同的基因結構，均含有兩個UTR 區域。Clade III 成員有0-2 個UTR 區域。各種內含子和外顯子的多樣性表明，VvCYP707As 中可能的替代剪接，對發育和應激反應至關重要。

圖3 擬南芥和葡萄CYP707As 的系統發育關系（A）、基因結構（B）及保守基序分析（C）Fig.3 Phylogenetic relationships (A),gene structure (B)and conserved motif analyses (C) of CYP707As from Arabidopsis and V.vinifera

為了進一步分析CYP707A 蛋白結構多樣性，利用MEME 分析motif（圖3-C）。有些motif 特異性存在于某些演化之中。例如，motif 9 只出現在Clade II中，motif 10 出現在Clade I 中?？傊?，進化樹中進化關系密切的CYP707A 蛋白的基因結構基本相似，motif 保守，說明兩個不同物種中每個亞家族的進化相對保守。

2.3 葡萄中VvCYP707A基因啟動子的順式元件鑒定

利用PlantCARE 在AtCYP707A 和VvCYP707A 基因上游1.5 kb 啟動子區域鑒定了潛在的順式元件。已鑒定的順式調控元件可分為3 個功能群，即生長發育相關、應激和激素元件。結果（圖4）顯示，在所有的VvCYP707As 基因啟動子中都發現了與應激和激素反應相關的順式元件；與應激相關的元件主要集中于MYB 和MYC；與激素相關的元件主要集中于參與ABA 反應的ABRE、MeJA 反應的CGTCAmotif 和乙烯反應的ERE。葡萄的CYP707A 啟動子比擬南芥CYP707A 啟動子擁有更多的與生長發育相關的順式作用元件，這可能與VvCYP707A 長期進化形成特有功能相關。其中，Vitvi06g00498 基因啟動子中與激素反應相關的順式元件數量最多，ABRE元件數量擁有8 個，可能該基因對ABA 反應較為敏感；Vitvi03g00508 基因啟動子中與激素反應相關的順式元件數量較少，只有一個ERE 順式元件。

圖4 擬南芥和葡萄CYP707As 基因啟動子順式作用元件Fig.4 Cis-acting elements of AtCYP707As and VvCYP707As gene promotors in Arabidopsis and V.vinifera

2.4 葡萄VvCYP707A在不同葡萄品種果實中的表達模式

采取‘鄞紅’和‘甬早紅’兩個品種5 個時期的果實，測定其理化性質（圖5-A-D），從中可以觀察到‘甬早紅’的單果重、硬度和可溶性糖發育模式與‘鄞紅’基本一致，‘甬早紅’果實單重和可溶性糖含量都低于‘鄞紅’；硬度在轉色期時差異顯著。

圖5 兩種葡萄果實發育的生理參數及VvCYP707As 基因相對表達量Fig.5 Physiological parameters and VvCYP707As related expression related to fruit development in two kinds of V.vinifera

5 個VvCYP707As 基因在兩個品種的果實的相對表達量如圖5-E 所示。除Vitvi18g00792 在兩個品種表達量無明顯差異外，其余的4 個VvCYP707As 基因在‘甬早紅’表達量均高于 ‘鄞紅’；Vitvi02g01269、Vitvi06g00498 和Vitvi18g00792 在兩個品種中各自具有相似的表達趨勢，即表達量與時期緊密相關。Vitvi07g01751 在‘甬早紅’和‘鄞紅’中表達量差異極為顯著，在S3 時期表達量差異甚至高達77.93倍。推測Vitvi07g01751 的高表達是導致 ‘甬早紅’成熟期提前的關鍵基因，同時導致其可溶性糖含量下降和硬度增加。

2.5 葡萄VvCYP707As在‘鄞紅’不同組織與不同時期的表達模式

VvCYP707As 在‘鄞紅’葡萄發育時的組織特異性如圖6 所示，以各個組織的S1 期為對照組。在果肉中（圖6-A），表達模式可以分為兩類，Vitvi07g01751和Vitvi18g00792具有相似的表達模式，幾乎在果實發育整個時期都發揮作用，在S5 時期表達下降；同樣身為片段復制的Vitvi02g01269 卻屬于第二類，隨著果實發育而增加，在S4 轉色期表達下調。在果皮中（圖6-B），VvCYP707As 基因在幼果期與膨大期均較高表達，在S4 轉色期同樣的表達下調。在轉色期不同組織中（圖6-C），Vitvi02g01269和Vitvi07g01751 在莖和葉中表達顯著大于果肉和果皮組織，其余VvCYP707As 在4 個組織中無顯著差異。VvCYP707As 主要在莖和葉組織中高表達。

圖6 VvCYP707As 在‘鄞紅’不同組織不同時期表達模式Fig.6 VvCYP707As expression patterns in different tissues and different periods in ‘Yin Hong’

2.6 葡萄VvCYP707As在外源ABA處理下的表達特性

為探究VvCYP707As 是否受外源ABA 誘導影響，采用外源ABA 噴施葡萄果實表面。VvCYP707As對外源ABA 在果皮和果肉中表現出不同的反應模式，與施加清水的對照組相比，ABA 處理后5 min內，葡萄果皮中Vitvi18g00792 表達量上升，其余VvCYP707As 基因表達量下降，說明ABA 處理顯著抑制了果皮中 VvCYP707As 的表達，隨后趨于穩定（圖7-A）。然而，在ABA 處理的漿果肉中（圖7-B），VvCYP707As 會受到ABA 的強烈誘導，在處理后2-4 h 后波動較大，尤其是Vitvi02g01269和Vitvi03g00508，在ABA 處理后2 h 分別被誘導上調表達28.36 倍和45.46 倍，但在4 h 時顯著下降；而Vitvi07g01751 在2 h 和4 h 持續高表達；Vitvi18g00792反應敏感，在ABA處理1 h后達到峰值，2-4 h 表達下降，與對照組漿果肉表達量無顯著差異。

圖7 葡萄果皮（A）和果肉（B）VvCYP707As 基因在ABA 處理下相對表達量Fig.7 Relative expressions of VvCYP707As gene in grape pericarp（A）and grape flesh（B）under ABA treatment

2.7 葡萄VvCYP707As基因瞬時表達分析

Vitvi07g01751 基因表達量在‘鄞紅’和‘甬早紅’葡萄果實中差異顯著，推測其在葡萄成熟過程中發揮關鍵作用。將構建好的攜帶Vitvi07g01751 基因的重組質粒注射到轉色期的‘鄞紅’果實進行瞬時表達，48 h 后測定基因表達量和HPLC 法測定葡萄糖和果糖。結果（圖8-A）顯示，對Vitvi07g01751 基因瞬時表達量進行RT-qPCR 分析，Vitvi07g01751 基因在35S:VvCYP707A 果實中表達量最高，并且與其他3 組具有顯著差異。過表達Vitvi07g01751 的果糖與對照組和空載35S 無顯著差異；35S:VvCYP707A葡萄糖顯著小于對照和35S 組，與2 d 前對照無顯著差異，影響了葡萄糖的積累；對葡萄6 個PYL 基因進行RT-qPCR 檢測（圖8-B）。對照組、35S 和35S:VvCYP707A 組的VvPYL3/5/6 都與2 d 前對照組具有顯著差異，推測是葡萄自然發育影響了基因的表達量；35S 和35S:VvCYP707A 組的VvPYL1 較對照組有顯著差異可能是注射創口影響；VvPYL2 在4 個組別中無顯著差異；VvPYL4 在過表達Vitvi07g01751表達量變化極其顯著，說明Vitvi07g01751 的變化能影響VvPYL4 的表達。

圖8 瞬時表達相關基因RT-qPCR 檢測與理化測定Fig.8 Transient expression related genes were detected by RT-qPCR and determination of fruit sugar

3 討論

CYP707A 基因參與調控植物激素信號轉導和生長發育等過程［14,19］。在大多數的實驗中，過表達CYP707A 會造成植株生長緩慢［20］，而桃CYP707A轉入擬南芥中，在低溫環境下卻促進植株生長［21］。目前，葡萄CYP707A 的相關研究較少，本研究通過多物種CYP707A 蛋白結構域分析比對共鑒定出5 個葡萄CYP707A 家族成員。研究基因結構和保守motif 的差異，是分析基因家族進化關系的重要參考。CYP 家族是一個保守的大家族［22］，在本研究中，對VvCYP707A 多序列比對分析顯示，5 個CYP707A 基因都含有保守的P450 半胱氨酸血紅素鐵配位體，這是8'羥化酶催化活性的必須結構［10］。系統發育樹分析表明，CYP707A 蛋白在不同物種間具有高度的序列保守性，并且Vitvi18g00792 與CsCYP707A4 蛋白親緣關系較近，Vitvi03g00508 和Vitvi06g00498 與MdCYP707A 蛋白親緣關系較近，意味著葡萄的VvCYP707A 蛋白與蘋果和柑橘的親緣關系更近。通過對VvCYP707A 的基因結構分析，除Vitvi03g00508 和Vitvi07g01751 外，都含有2 個UTR區，且蛋白motif 保守。VvCYP707A 基因啟動子序列含有大量應激及激素相關的順式作用元件，且相較于AtCYP707A 有著更多的與生長發育相關的作用元件，可能這與VvCYP707A 參與果實成熟功能有關。

ABA8'羥化酶是催化ABA 降解的關鍵酶，參與了調節ABA 穩態的過程?；蛑貜褪腔蚣易瀹a生和擴張的主要原因，基因復制影響了植物物種間的基因功能的多樣性［23］，在本研究中，Vitvi02g01269、Vitvi07g01751 和Vitvi18g00792 三 個發生片段復制的CYP707A 基因均在葡萄不同組織中表達，但表達模式存在差異，具有組織特異性和時空特異性，表明了VvCYP707A 在葡萄不同組織中參與了ABA 積累的調控。在葡萄果實中，大部分的VvCYP707As 隨著果實發育呈現表達下降的趨勢，僅有Vitvi07g01751 在‘甬早紅’果實膨大期表達顯著上升，推測該基因的特異性高表達可能是影響葡萄成熟期提前的關鍵因素之一，獼猴桃（Actinidia chinensis）CYP707A3 也有類似的發現［24］。此外，研究表明施加外源ABA 會促進葡萄著色［25］，而內源ABA 含量隨著葡萄果實發育而不斷積累至轉色期達到峰值［26］。本實驗中，葡萄果皮中的CYP707As 在轉色期S4 下調表達，推測內源ABA 不斷積累從而促進了果實著色。

ABA 作為一種植物化學信號分子，已有報道表明植物受到外源ABA 處理后，與ABA 合成和分解的基因受其誘導調節［27］。其中，研究證實擬南芥和桃子CYP707A 基因家族可以被ABA 誘導［28-29］。本研究中，葡萄CYP707A 啟動子區域都含有ABA 響應元件，且ABA 處理下，5 個VvCYP707A 都能進行響應，驗證了順式作用元件預測的可靠性，并且反應迅速的VvCYP707A 都含有ERE 順式作用元件，可能是由于施加外源ABA 后果實通過上調乙烯合成相關基因導致反應敏感［30］。這些結果為進一步研究VvCYP707As 基因在果實成熟中的功能和闡明其機制提供了基礎。

轉色期是葡萄成熟并積累糖的關鍵時期［31］，在S4 時期，幾乎所有的VvCYP707As 都下調了表達，然而‘甬早紅’的可溶性糖含量在該時期并未增加太多且與‘鄞紅’的可溶性糖差異極為顯著，可能是由于‘甬早紅’的VvCYP707As 普遍表達量高所導致的。研究表明，CYP707A 會影響ABA 受體PYL 的表達［7］，將兩個品種中表達差異顯著的Vitvi07g01751 瞬時過表達后，葡萄的糖度積累減慢，同時也極大程度影響了VvPYL4 的表達。推測‘甬早紅’的早熟是由于在S3 時期Vitvi07g01751 的高表達，造成了PYL 的上升，當VvCYP707As 下調表達時，ABA 得到積累，受體的增加導致植株能更好地對ABA 做出變化，從而造成葡萄早熟的現象。然而時間有限，本文尚未對Vitvi07g01751 的穩態轉化做出研究。

4 結論

CYP707A 基因家族成員相對保守，但在進化中可能發生了功能分化。通過對比‘鄞紅’和‘甬早紅’的CYP707As 在果實發育時期的表達變化發現，Vitvi07g01751 在兩個品種中差異表達，將其瞬時表達后能極大程度影響VvPYL4 的表達，并減少糖的積累；在成熟過程中發揮著重大作用并影響葡萄果實品質，這對后續葡萄的成熟基因挖掘和性狀改良具有一定的意義。