獼猴桃AcMYB88 的鑒定及功能研究

苑馨予 鐘彩虹 張龍 鄭浩 李吉濤 張瓊

（1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室（湖北民族大學），恩施 445000；2.中國科學院武漢植物園 中國科學院植物種質創新與特色農業重點實驗室 中國科學院獼猴桃產業技術工程實驗室，武漢 430074）

果肉色澤是影響果實品質的重要因素之一［1-3］，多年來一直是果實品質研究的熱門領域。其中，獼猴桃（Actinidia chinensis）因其果肉色澤不同，價格差異較大。優質紅肉獼猴桃的零售價是傳統綠肉獼猴桃的2-5 倍［4-5］。在過去幾十年中，綠肉品種獼猴桃主導了全球商業市場。但近年來，消費者對富含花青苷的紅心獼猴桃表現出較大興趣［6］。在日常生活中，大多數消費者會根據獼猴桃的果肉顏色來選擇購買［7-8］。紅心獼猴桃因其果心橫截面呈放射狀紅色條紋，形似太陽，日漸受到消費者的喜愛，其中‘東紅’已成為中國紅心獼猴桃的主栽品種［9］。

獼猴桃果肉顏色差異是由次生代謝物含量變化造成的，紅肉獼猴桃是由花青苷積累導致的，如矢車菊素等［10］。研究表明，花青苷代謝由結構基因和轉錄因子共同調控［11］。轉錄因子在植物的各種生命活動中均發揮重要作用［12］。擬南芥中至少發現有1 533 個轉錄因子，約占整個基因組序列的5%，雖比重不高，但卻能影響其整個生命進程［13］。獼猴桃中共發現58 類轉錄因子，其中，與紅肉獼猴桃果肉色澤相關的轉錄因子有MYB、bHLH 等［14］。在獼猴桃中，Acc10232（AcMYB110）可以促進花青苷的積累，并且在獼猴桃各組織中組成性表達［15］。而Acc00493（AcMYB10）既可單獨調控花青苷生物合成，也可與Acc19563（AcbHLH42）相互作用共同調控花青苷積累［16-17］。隨著分子生物學的發展，越來越多的MYB 家族成員被挖掘鑒定，其生物學功能的研究也不斷豐富。

花青素在著色過程中起著重要的作用，如植物的果實、葉子和花器等。已有研究人員注意到MYB轉錄因子家族參與調節植物花青素生物合成的作用，并確定MYB 的部分成員為主要調控因子，進行花青素生物合成。但是，調節花青素生物合成的因素很多，機理也比較復雜。在目前的研究中，關于獼猴桃花青素合成中MYB 轉錄因子的研究還相對較少。因此，對于這些獼猴桃MYB 轉錄因子成員在花青素生物合成中的確切功能和作用機制還存在著許多未知。

為了更好地理解獼猴桃花青素的合成過程，并挖掘出其他與獼猴桃果肉花青苷代謝調控相關的MYB 轉錄因子，研究果實不同發育時期的MYB 基因表達對果肉顏色的影響。本研究從plantTFDB 網站（https://planttfdb.gao-lab.org/index.php）下載97 個獼猴桃MYB 轉錄因子，選取12 個與AcMYB110 高度同源的MYB 轉錄因子，進行生物信息學分析，并研究它們在不同發育時期‘東紅’獼猴桃果實中的表達情況。挖掘到一個花青苷代謝相關基因Ac-MYB88，并對其功能進行初步驗證。為進一步解析MYB 轉錄因子參與獼猴桃果肉花青苷代謝的調控機制提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以國家獼猴桃資源圃內種植的‘東紅’為材料，分別對花后20 d（20DAF）、50 d（50DAF）、80 d（80DAF）、110 d（110DAF）、140 d（140DAF）的‘東紅’果實進行取樣，液氮速凍后，置于-80℃超低溫冰箱保存備用。每個樣品選取3 個生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 MYB 基因家族生物信息學分析 通過Plant-TFDB 在線網 站（https://planttfdb.gao-lab.org/index.php）下載獼猴桃MYB 蛋白序列［18］；利用EXpasy在線工 具（https://web.expasy.org/protparam）分 析MYB 蛋白的分子量、氨基酸殘基數、帶負電荷殘基數、帶正電荷殘基數、不穩定指數、脂肪指數、親疏水性、等電點（pI）等基本屬性［19］；利用Protscale 在線工 具（https://web.expasy.org/protscale/）對獼猴桃MYB 轉錄因子進行氨基酸親疏水性預測分析；通過CELLO 在線網站（https://cello.life.nctu.edu.tw）分析亞細胞定位情況［20］。采用SignalP4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分 析MYB蛋白的信號肽。利用SOMPA 在線網站進行蛋白質二級結果預測。使用軟件MEGA11.0，采用鄰接法（neighbor-joining）構建獼猴桃MYB 蛋白進化樹，并使用ITOL 在線網站（https://itol.embi.de）進行進化樹修飾［21］。采用NetPhos3.1 在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白質磷酸化位點。利用MEME 在線網站（http://meme-suit.org/tools/meme）對獼猴桃MYB 蛋白家族進行motif 分析，將參數中的模體值設置成為10，其他均為默認值［22］。通過Plant CARE 在線網站對獼猴桃12 個MYB 轉錄因子進行啟動子順式元件預測［23］。

1.2.2 獼猴桃果實RNA 提取及cDNA 合成 用植物總RNA 小提試劑盒（Magen）提取獼猴桃果肉RNA，-80℃保存備用。用SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）試劑盒將其反轉錄為cDNA，具體步驟參考說明書。

1.2.3 引物合成及RT-qPCR 分析 利用SnapGene軟件設計RT-qPCR 引物，以獼猴桃Actin 為內參，進行RT-qPCR 分析，所用引物見表1。反應體系為TB Green Premix II 5 μL、cDNA 模板1 μL、正反向引物 各0.5 μL、ROX Reference Dye II 1 μL 和ddH2O 2 μL；PCR 程序為95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，共40 個循環；72℃ 20 s。每個基因設3 個技術重復，基因相對表達量計算采用2-△△Ct方法。

表1 試驗用到的引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

1.2.4 過表達載體構建 通過SnapGene 軟件設計引物，使用高保真酶擴增Achn365361，將產物純化，從而得到產物1。雙酶切過表達載體pSAK277，同樣將產物進行純化，得到產物2。用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 將產物1 與產物2進行同源重組，轉化，進行菌液PCR 檢測陽性克隆，并測序。將測序正確的質粒轉化到農桿菌EHA105中，篩選陽性克隆，加入甘油-80℃保存備用。50 mL 離心管中加入20 mL LB+Kan+Rif 液體培養基，取上述菌液接種于50 mL 離心管，28℃、200 r/m 振蕩培養1 d，用于后續農桿菌侵染煙草實驗［17］。

1.2.5 農桿菌侵染煙草 選擇長勢良好的大葉煙草，將過表達載體pSAK-Achn365361（OE88）、pSAKAcMYB10（OE10）、pSAK-AcbHLH42（OE42）和空載（EV）分別轉入EHA105，均勻涂布于LB+Kan +Rif 的固體平板上，28℃倒置培養2-3 d。用50 mL離心管進行擴大培養，離心收集菌體后重懸菌液至OD 值1.2-1.5，避光靜置3 h 后，分別按表3 組合混合，將其注射煙草背面。避光處理24 h、培養7 d 后取樣，用于花青苷含量測定和RT-qPCR 分析。

為驗證AcMYB88 是否促進花青苷的積累，將AcMYB88 在大葉煙草葉片中進行瞬時過表達。將試驗分成3 組（表2）。第1 組，將攜帶重組質粒的OE10 和OE88（試驗組）分別注射到大葉煙草葉片右上側和右下側，左側注射空載體（EV）（對照組）；第2 組，將攜帶重組質粒的OE88+OE10+OE42（1∶1∶1）混合（試驗組）注射到大葉煙草葉片右側，左側注射對照組，即EV+OE10+OE42（1∶1∶1）；第3 組，將攜帶重組質粒的OE88+OE10（1∶1 ）混合（試驗組）注射到大葉煙草葉片右側，將攜帶重組質粒的EV+OE10（1∶1）混合（對照組）注射到左側。

表2 農桿菌瞬時轉化煙草組合Table 2 Agrobacterium combinations for tobacco transient transformation

1.2.6 花青苷含量測定 花青苷含量的測定采用pH示差法［24］。按照以下公式計算花青苷含量：

C=((A530-A620)-0.1(A650-A620))/ε×(V/m)×106×M×10-3

其中，C 表示花青苷濃度（μg/g）；A 表示相應波長的吸光度；V 表示提取液體積（mL）；m 表示樣品重量（g）；M 表示花青苷分子質量（287.24 g/mol）；ε表示花青苷消光系數（4.62×106）。

1.2.7 煙草RT-qPCR 分析 利用NCBI 設計RTqPCR 引物，以煙草Actin 為內參進行RT-qPCR 分析，所用引物見表1；反應體系為TB Green Premix II 5 μL、cDNA 1 μL（cDNA 純化方法同1.2.2）、引物各0.5 μL、ROX Reference Dye II 1 μL 和ddH2O 2 μL；PCR程序為95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，40 個循環；72℃ 20 s。每個基因設3 個技術重復，基因相對表達量計算采用2-△△Ct方法。

1.2.8 數據處理 采用SPSS、GraphPad 9、TBtools和Photoshop 軟件進行數據處理和作圖。

2 結果

2.1 獼猴桃MYB蛋白系統發育及理化性質分析

通過系統發育分析，篩選出12 條與AcMYB110高度同源的MYB 蛋白序列（圖1）。理化性質分析結果表明，12 個獼猴桃MYB 轉錄因子編碼的氨基酸數量為200（Achn207851）-423（Achn258201），平均284.58 個。分子量大小范圍為22 325.81-45 538.79 Da，分子量最大的是Achn258201，最小的是Achn207851。等電點分布在5.84（Achn258201）-9.22（Achn218481），其中，Achn033551、Achn145-641、Achn207851、Achn258201、Achn365361 的等電點均小于7，它們可能編碼弱酸性蛋白，在酸性亞細胞環境中發揮作用。不穩定指數介于42.43（Achn365361）-65.34（Achn172831）之 間，均大于40，為不穩定蛋白。脂肪指數在53.22（Achn218481）-71.18（Achn258201）范圍內，蛋白成員間熱穩定性差異較大。帶負電荷的氨基酸殘基數（Asp+Glu）介于26（Achn207851）-54（Achn258201）之間，帶正電荷的氨基酸殘基數（Arg+Lys）在22（Achn207851）-45（Achn258201）范圍內，其中，Achn172831 的正電荷的氨基酸殘基數等于負電荷氨基酸殘基數，Achn036201、Achn141271、Achn154591、Achn212251、Achn218481、Achn371351 這6 個成員的正電荷氨基酸殘基數大于負電荷氨基酸殘基數，其余5 個成員的負電荷氨基酸殘基數大于正電荷氨基酸殘基數。12 個MYB 蛋白的親水性質均為負值，表明它們是親水性蛋白，平均親水性為-0.71。亞細胞定位分析表明，12 個MYB 蛋白成員均定位于細胞核（表3）。

圖1 獼猴桃MYB 蛋白家族系統進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the MYB protein family in kiwifruit

表3 12 個獼猴桃MYB 轉錄因子理化性質分析Table 3 Analysis of the physicochemical properties of 12 kiwifruit MYB transcription factors

2.2 磷酸化位點預測分析

NetPhos 3.1 磷酸化位點分析表明，12 個MYB蛋白的磷酸化位點的總數：絲氨酸＞蘇氨酸＞酪氨酸；絲氨酸磷酸化位點（Ser）最少為11 個（Achn365361），最多為38 個（Achn258201）；蘇氨酸磷酸化位點（Thr）最少為7 個（Achn033551、Achn145641 和Achn207851），最多為15 個（Achn036201）；酪氨酸磷酸化位點（Tyr）最少為1 個（Achn033551、Achn036201、Achn141271、Achn145641、Achn154591 和Achn258201），最多為6 個（Achn218481）。Achn258201 有最多的絲氨酸和最少的酪氨酸磷酸化位點；Achn033551 潛在的蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點最少，相應的激活酶活力最弱（表4）。

表4 獼猴桃MYB 蛋白的磷酸化位點Table 4 Phosphorylation sites of MYB proteins in kiwifruit

2.3 二級結構預測分析

SOPMA 分析結果顯示，12 個MYB 蛋白中大部分成員的二級結構以無規則卷曲為主，其次為α-螺旋和延伸鏈，β-轉角含量最少（表5）。其中，12 個MYB 蛋白的二級結構含量大小均為無規則卷曲＞α-螺旋＞延伸鏈＞β-轉角。α-螺旋占比為19.80%-27.19%，Achn145641 中α 螺旋占比最低，Achn258201α 螺旋占比最高；延伸鏈占比為10.88%（Achn036201）-15.17%（Achn172831）；β-轉角含量為2.15%（Achn371351）-5.19%（Achn365361）；無規則卷曲占比介于54.37%（Achn258201）-63.80%（Achn371351），無規則卷曲占比最高，說明本研究中的12 個MYB 蛋白穩定性高（圖2）。

圖2 12 個MYB 蛋白二級結構預測Fig.2 Secondary structure prediction of 12 MYB proteins

2.4 獼猴桃MYB蛋白保守基序分析

對獼猴桃12 個MYB 基因進行motif 分析，共有10 個保守基序，motif 長度在11-50 個氨基酸不等（圖3）。保守motif 數量5-9 個不等，平均含有7.08 個；12 個MYB 蛋白均含有motif 1、2、3、5、6；除Achn207851 外，均含有motif4；6 個蛋白含有motif7；4 個蛋白含有motif8；Achn036201 和Achn154591 含有motif9；Achn033551 和Achn145641含有motif10；

圖3 12 個MYB 蛋白motif 分析和保守結構域分析Fig.3 Motif prediction and conserved domain analysis of 12 AcMYB proteins

12 個MYB 轉錄因子之間motif 的數目和結構差異不明顯，表明這些蛋白進化上較為保守。motif1 和motif3 總是相連出現，在位置關系上motif1 在motif3之 前；motif6 和motif2、motif5 和motif1 也總是 相鄰出現；motif8 出現在Achn036201、Achn154591、Achn172831 和Achn218481 這4 個AcMYB 蛋白中；motif9 出現在蛋白Achn036201 和Achn154591 中；motif10 出現在蛋白Achn033551 和Achn145641 中。不同MYB 蛋白的motif 數量與分布存在差異，多數motif 分布在N 端，而motif9 和motif10 出現在蛋白C 端。

2.5 獼猴桃MYB基因啟動子順式作用元件分析

12 個MYB 基因啟動子中除了含有大量的CAAT-box 和TATA-box 等核心元件外，還具有較多的響應脫落酸、水楊酸、赤霉素、茉莉酸甲酯、赤霉素、生長素等植物激素的順式元件；此外還有光響應元件和響應低溫、干旱、厭氧等脅迫的元件（圖4）。晝夜節律控制元件僅出現在Achn03351、Achn 212251 的啟動子中。Achn03351、Achn036201、Achn172831、Achn207851、Achn218481、Achn258201和Achn371351 啟動子中均含有干旱響應元件。除Achn141271、Achn207851 和Achn371351 外，其余9 個MYB 啟動子中均存在厭氧誘導所必需的順式作用調節元件。啟動子序列中含有低溫響應元件的轉錄因子包括Achn036201、Achn145641、Achn207851和Achn218481。Achn036201、Achn145641、Achn-172831、Achn207851、Achn258201 和Achn365361 的啟動子序列中含有防御和脅迫響應元件。此外，還有一些轉錄因子含有分生組織、胚乳表達、玉米素代謝調節等相關的響應元件。其中光響應與激素反應相關順式作用元件在12 個MYB 基因啟動子中數量最多。

圖4 12 AcMYBs 上游啟動子元件的種類和數量Fig.4 Types and numbers of promoter elements in the upstream regions of 12 AcMYBs

2.6 ‘東紅’果實不同發育時期MYB基因表達分析

對14 個MYB 基因進行RT-qPCR 定量分析（圖5），通過聚類分析可將這14 個基因分為5 組。其中，第1 組包括Achn 141271；第2 組包括Achn371351、AcMYB10、Achn212251 和Achn 218481；第3 組包括Achn172831、Achn365361、Achn258201 和AcMYB-110；第4 組包括Achn145641、Achn033351 和Achn- 207851；第5 組包括Achn036201 和Achn154591。在‘東紅’果實發育過程中，AcMYB110、Achn172831、Achn365361 的表達模式出現先增后降再增的趨勢。其中，Achn365361 表達模式與AcMYB110 相似。因此，將Achn365361 作為候選基因，進一步探究其是否與果肉花青苷的積累有關。

圖5 ‘東紅’果實不同發育時期14 個MYB 基因表達聚類熱圖Fig.5 Expression heatmap of 14 MYB genes during different development stage of ‘Donghong’

2.7 Achn365361系統進化分析

系統進化分析結果表明（圖6），Achn365361與AtMYB88 高度同源。因此，將Achn365361 命名為AcMYB88。然而，AtMYB88 是否促進擬南芥花青苷積累，目前尚未見相關報道。

圖6 Achn365361 轉錄因子的系統進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of Achn365361 transcription factor in Actinidia chinensis

2.8 煙草葉片瞬時表達

為進一步揭示AcMYB10 和AcMYB88 的功能，將重組載體pSAK-AcMYB88（OE88）、pSAKAcMYB10（OE10）和空載（EV）在大葉煙草葉片中進行瞬時過表達，結果如圖7-A 所示，侵染6 d 后，對照組（EV）葉片的顏色沒有明顯變化，而試驗組（OE10）和（OE88）的葉片顏色分別明顯變紅和變黃。葉片變黃可能由于大葉煙草葉綠素含量高，與花青苷的紅色疊加從而顯示出黃色。此外，試驗組OE10、OE88 葉片花青苷含量分別為對照組的2.81倍和7.05 倍，差異顯著（圖7-B）。OE10 葉片中結構基因NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCHS、NtF3H、NtLDOX、NtANR、NtANS 的表達量與對照相比，分別升 高99.89%、99.59%、85.55%、99.61%、99.92%、99.84%、99.63%和99.93%；試驗組OE88葉片中結構基因NtPAL、NtC4H、Nt4CL、NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtDFR、NtANR、NtANS 的表達量與對照相比，分別升高88.04%、99.19%、91.74%、92.65%、98.56%、91.64%、82.46%、96.13% 和99.63%，這與花青素含量一致（圖7-C），表明AcMYB88、AcMYB10 能促進花青苷的積累。

圖7 過表達AcMYB10 和AcMYB88 促進煙草花青苷積累及相關基因表達Fig.7 Overexpression of AcMYB10 and AcMYB88 promotes tobacco anthocyanin accumulation and related gene expression

如圖8-A 所示，利用EV+OE10+OE42（1∶1∶1，對照組）及OE88+OE10+OE42（1∶1∶1，試驗組）的農桿菌重懸液分別侵染大葉煙草。與對照組相比，試驗組色素顯著積累，花青苷含量升高2.64 倍（圖8-B）。如圖8-C 所示，試驗組中與花青苷合成相關的結構基因表達量顯著高于對照組。結果表明，AcMYB88 能與AcMYB10 和AcbHLH42 協同作用提高結構基因的表達量從而促進花青苷的積累。

圖8 過表達EV+OE10+OE42 和OE88+OE10+OE42 促進煙草花青苷積累及相關基因表達Fig.8 Overexpression of EV+OE10+OE42 and OE88+OE10+OE42 promotes tobacco anthocyanin accumulation and related gene expression

將EV+OE10（1∶1，對照組）及OE88+OE10（1∶1，試驗組）的農桿菌重懸液分別侵染大葉煙草（圖9-A）。結果表明，與對照相比，試驗組葉片色素顯著積累，與花青苷含量的測定結果一致（圖9-B）。同時與花青苷合成相關的結構基因的表達量也顯著升高（圖9-C）。其中，NtDFR 的表達量上升幅度最為明顯，升高98.89%。結果表明，AcMYB88 也能與AcMYB10 協同作用，促進煙草葉片中花青苷的積累。

圖9 過表達EV+10 和88+10 促進煙草花青苷積累及相關基因表達Fig.9 Overexpression of EV+10 and 88+10 promotes tobacco anthocyanin accumulation and related gene expression

3 討論

3.1 AcMYB結構特征分析

MYB 基因廣泛存在不同植物中，但家族成員數目差異很大。擬南芥［25］和辣椒［26］分別有192 和172 個MYB 家族成員，而在番茄［27］中鑒定到139個MYB 成員。在刺葡萄（Vitis davidii）［28］愈傷組織中僅鑒定到9 個MYB 成員。在本研究中，從轉錄因子網站中篩選到12 個與AcMYB110 高度同源MYB 基因。12 個MYB 基因所編碼的氨基酸數目為200-423。通過對基因結構和保守基序分析發現，12個成員之間具有相似的基因結構和保守基序，表明這些成員在進化過程和功能上具有高度相似性。

蛋白質二級結構是蛋白質分子內部結構動態性的重要組成部分，影響蛋白質的生物功能和穩定性。蛋白質二級結構預測是研究蛋白質的重要內容，蛋白質二級結構的主要形式包括無規則卷曲、α-螺旋、β-折疊和β-轉角。竹葉花椒MYB 家族的二級結構除ZaMYB21、ZaMYB24 和ZaMYB35 以α-螺旋為主外，其余36 個ZaMYBs 蛋白的無規則卷曲所占比例最高［14］。本研究中的12 個AcMYB 蛋白的二級結構均以無規則卷曲為主，其次為α-螺旋和延伸鏈，β-轉角含量最少。

3.2 MYB基因參與花青苷生物合成

花青苷生物合成由結構基因和轉錄因子共同調控。這些轉錄因子通過調控花青苷生物合成途徑中結構基因的表達，決定植物器官顏色的呈色部位和著色效果。研究表明，MYB 轉錄因子、bHLH轉錄因子和WD40 蛋白為花青苷生物合成途徑中的主要調控因子，可直接參與調控結構基因的轉錄［29-30］。在蘋果中已經分離得到很多MYB 基因，如MdMYB1、MdMYBA、MdMYB10 等，這些都屬于R2R3 類MYB 基因，且能夠調控花青苷的積累［31-32］。Cutanda-Perez 等［33］證 實VvMYBA1 和VvMYBA2 能調控葡萄花青苷合成途徑中UFGT 的表達，從而調節果實的著色。研究表明，MYB10 能與bHLH3 協同作用，促進梨果皮花青素的合成［34］。煙草瞬時表達實驗發現，與單獨注射SmMYB1 相比，當SmMYB35與SmMYB1 共同侵染煙草后，葉片花青素含量明顯增加［35］。本研究基于RT-qPCR 結果，從12 條MYB 基因中篩選出與AcMYB110 表達模式相似的基因AcMYB88，并通過瞬時轉化煙草實驗初步證實AcMYB88 參與花青苷的積累，且能與AcMYB10 和AcbHLH42 協同調控，進一步增加花青苷的積累，這為獼猴桃育種提供理論依據。

4 結論

從獼猴桃MYB 基因家族中篩選出與AcMYB110高度同源的12 個MYB 轉錄因子，篩選出與MYB110表達模式極為相似的候選基因AcMYB88，其表達可促進煙草葉片花青苷的積累，證明AcMYB88 為花青苷合成的正向調控因子。此外AcMYB88 能與AcMYB10 和AcbHLH42 協同作用進一步增加花青苷的積累。