甘蔗CBL-CIPK 基因家族的鑒定和表達分析

辛奇 李壓凡 尹錚 張曉丹 陳霆 劉曉華

（魯東大學農林工程研究院 山東省高校作物高產抗逆分子模塊育種實驗室重點實驗室，煙臺 264025）

溫度、水分及滲透壓是制約植物生長的關鍵環境因素，在農業生產中，明確不同環境因子的影響，探究植物抵抗逆境的關鍵基因具有重要意義，在植物與環境的相互作用中，鈣離子（Ca2+）作為第二信使發揮著關鍵作用［1］。

CBLs 是一類Ca2+結合蛋白，是感知鈣離子濃度變化的鈣受體之一。CBLs 的C 端有一個保守的絲氨酸殘基，該殘基易被磷酸化，并與下游靶蛋白CBL-相互作用蛋白激酶 CIPKs［2］發生特異性相互作用［3］。在應激條件下，CIPK 蛋白質通過調節細胞膜上離子轉運體以恢復離子平衡［4］，CBL-CIPK 信號系統調控植物體內各種刺激或信號的關鍵成分以發揮功能［5］。通過前人研究得知，植物體內的鈣離子結合蛋白主要有三類，分別是鈣調蛋白（Ca2+-binding proteins including calmodulin,CaM）家族、鈣依賴蛋白激酶（Ca2+-dependent protein kinases,CDPKs）家族、類鈣調磷酸酶B 亞基蛋白CBL 家族［6］。CBL 蛋白依賴EFhand 蛋白基序結構與鈣離子結合，將信號傳導給下游蛋白［7］。CBL-CIPK 復合物在植物生長、發育和應激反應等多種生理過程中調節鈣信號發揮著重要作用［8］。

擬南芥AtCIPK23 是驅動根系對各種環境脅迫做出反應的主要樞紐［9］?？果}方面，復合物CBL10-CIPK8-SOS1 在調節擬南芥的鹽耐受性方面發揮重要作用［10］，AtCIPK16 可提高轉基因小麥的耐鹽性［11］，AvCIPK11 對獼猴桃的抗鹽性具有正向調節作用［12］，AtCIPK6 過度表達增強了擬南芥對鹽脅迫的耐受性［13］?？购捣矫?，TaCIPK23 超表達的小麥和擬南芥在干旱條件下表現出更高的存活率，并且對ABA敏感［14］。OsCBL8-OsCIPK17 組合可調控水稻幼苗生長并提高其耐熱性和耐旱性［15］，鴿豆CcCIPK14-CcCBL1 組合通過促進類黃酮的生物合成來積極調節耐旱性［16］，辣椒CaCIPK3 和馬鈴薯StCIPK18 在耐旱性方面都發揮了積極作用［17］，StCBL4-StCBL2 對耐旱性有正向調節作用［18］。此外，CBL-CIPK 信號系統在種子萌發、幼苗期發育［19］和抗病方面［20］也發揮重要作用。

目前，CBL-CIPK 基因家族成員研究主要集中在葡萄（Vitis vinifera）、菠蘿（Ananas comosus）、油菜（Brassica napus L.）、蘿 卜（Brassica rapa var.rapa）、白菜（Brassica rapa ssp.pekinensis）等植物中。在葡萄中發現8 個CBLs 和20 個CIPKs［21］，菠蘿中發現19 個CBLs 和51 個CIPKs［22］，油菜中 有7 個CBLs和23 個CIPKs［23］，蘿卜中 有10 個CBLs 和26 個CIPKs［24］，白菜中有18 個CBLs 和47 個CIPKs［25］。關于CBL-CIPK 信號系統調控甘蔗應對非生物脅迫尤其是低溫脅迫的研究卻鮮見報道。

本研究通過對甘蔗CBL-CIPK 基因家族成員低溫及鹽旱脅迫下的表現進行研究，篩選出優質候選基因，為后續揭示CBL-CIPK 信號系統的內在機制及其在非生物脅迫中的功能提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗（Saccharum officinarum）‘GT58’號由廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所提供，大腸桿菌DH5α、酵母pGADT7 和pGBKT7 菌株為魯東大學農林工程研究院保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗處理 選擇生長一致的甘蔗‘GT58’組培幼苗進行非生物脅迫處理。將幼苗移至裝有1 L三級水的水培箱中，每盆均勻放置3 株，預培養20 d。在此期間，每隔3 d 更換一次三級水。當幼苗長出約10 條不定根時，在水培過程中每隔2 h 讓根部通氣40 min。設置以下5 個處理：CK（普通培養液）、低溫（4℃）、高溫（45℃）、PEG-6000（25 mmol/L）和NaHCO3（170 mmol/L）。每種處理設3 個重復，分別在試驗實施的0、2、8、16、24、48 和72 h 整株取樣，液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2.2 甘蔗CBL、CIPK 家族成員的鑒定及特征分析 利用擬南芥數據庫Tair（https://www.arabidopsis.org/）和植物基因組數據庫Esamble Plant（http://plants.ensembl.org/index.html），進行全基因組序列比對、篩選，獲得甘蔗CBL 基因家族成員19 個。利用HUMMER 模型分析，去除冗余蛋白保留含有Pkinase（Pfam NO.PF00069）和NAF（Pfam No.PF03822）2 個 保守結構域的蛋白序列，獲得82 個甘蔗CIPK 家族成員。利用EXPASY ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）分析家族成員物理特征。利用在線工具WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）對家族成員的亞細胞定位信息進行預測。

1.2.3 SsCBLs、SsCIPKs 保守結構域及蛋白基序分析 通過DNAMAN 軟件驗證家族成員的結構域保守性及序列同源性。利用NCBI Web CD-Search Tool（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）分析其蛋白基序。引入進化樹數據，利用TBtools 軟件（Bio Sequence Structure IIIustrator 模塊）對保守結構域及蛋白基序進行統一可視化。

1.2.4 SsCBLs、SsCIPKs 基因結構及染色體定位分析 利用TBtools 軟件（Gene Structure Shower 模塊）分析并繪制基因結構圖，（Amazing Gene Location From GFF3/GTF File 模塊）分析并繪制染色體定位圖，并根據甘蔗CBL 和CIPK 基因家族成員在染色體上的位置為其命名。

1.2.5 SsCBLs、SsCIPKs 順式作用元件分析 通過TBtools 軟件（Gtf/Gff3 Sequences Extractor 模塊）和PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對順式作用元件進行預測，并使用TBtools 軟件（Simple BioSequence Viewer 模塊和HeatMap 模塊）將數量統計制成熱圖。

1.2.6 SsCBLs、SsCIPKs 系統進化發育關系及共線性分析 通過MEGA 軟件中的Clustal W 工具對擬南芥AtCBLs、水稻OsCBLs、小麥TaCBLs、甘蔗SsCBLs、擬南芥AtCIPKs、甘蔗SsCIPKs 蛋白序列進行比對，使用鄰接法（neighbor-joining,NJ）構建系統進化樹，并利用最大似然法（maximum-likelihood,ML）進行驗證。利用在線工具iTOL（https://itol.embl.de/login.cgi）對進化樹進行美化。利用TBtools軟件（File Merger For MCScanX 模塊和Circle Gene Viewer 模塊），分析共線性關系并可視化。

1.2.7 植物總RNA 提取及cDNA 合成 按照RNA提取試劑盒（美國OMEGA 公司）提取植物總RNA，并反轉錄合成cDNA（Thermo），步驟詳見產品說明書。

1.2.8 引物設計及RT-qPCR 試驗 選擇具有代表性的部分基因家族成員進行定量分析，利用Prime5 軟件設計熒光定量引物，以甘蔗GAPDH 為內參基因，引物序列詳見附表1。

使用RT-qPCR 測定各基因在非生物脅迫下的表達量，反應程序：95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，40 個循環。

1.2.9 數據處理 采用2-ΔΔCT方法分析基因表達量，利用SPSS 分析數據顯著性差異，小于0.05 為顯著，小于0.01 為極顯著，由Prism 軟件繪制基因表達直方圖。

1.2.10 重組載體的構建 選定SsCBL1、SsCBL8、SsCIPK47 和SsCIPK81 四個基因驗證蛋白互相作用。將SsCBLs 全長cDNA 與pGADT7 和pGBKT7 空載體連接，SsCIPKs 全長cDNA 與pGADT7 空載體連接，構建SsCBL1-AD、SsCBL1-BD、SsCBL8-AD、SsCBL8-BD、SsCIPK47-AD 和SsCIPK81-AD 重組載體，轉化DH5α，測序鑒定。所有SsCBL/SsCIPK 基因家族成員的Y2H 互作引物見附表2。

1.2.11 SsCBLs 與SsCIPKs 酵母雙雜交點對點驗證 將含有目的基因的重組質粒按照一定比例混合，共轉化Y2H 型酵母菌，同時，設置pGADT7/pGBKT7 空載體為陰性對照，pGADT7-T/pGBKT7-53為陽性對照。在SD/-Trp/-Leu 二缺固體培養基上篩選陽性克隆，挑選生長良好的陽性克隆接種至液體培養基中進一步培養，28℃搖床培養48 h，用ddH2O 將不同菌株分別稀釋至原濃度的1/10、1/100和1/1 000。將不同濃度的菌液點在SD/-Trp/-Leu 二缺固體培養基和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 四缺固體培養基上，28℃倒置培養48-72 h，觀察菌株生長情況。

2 結果

2.1 甘蔗CBL、CIPK基因家族的生物信息學分析

2.1.1 甘蔗CBL-CIPK 家族成員理化性質差異較大 利用蛋白序列BLAST 及HMM 模型鑒定，最終獲得19 個甘蔗CBL 基因家族成員（表1）和82個CIPK 基因家族成員（附表3），并按其在染色體上的位置分別命名為SsCBL1-SsCBL19 和SsCIPK1-SsCIPK82。從表1 可以看出，甘蔗CBL 家族基因長度差距較大，從3 124-4 758 bp 不等，編碼的氨基酸數目為193-294 個，等電點均小于7 為酸性蛋白，外顯子數目差別不大，范圍為7-10 個，分子量差距較大，范圍為22.27-33.94 kD。亞細胞定位預測顯示，大多數基因定位于細胞和葉綠體，少部分基因定位于內質網、細胞核、線粒體。從附表3 可以看出，甘蔗CIPK 家族基因長度差異較大，最短的為6 080 bp，最長為30 944 bp，編碼的氨基酸數目為393-2 025 個，等電點范圍為5.19-9.88，其中只有12 個基因等電點小于7 為酸性蛋白，絕大多數為堿性蛋白。外顯子數目差別較大，范圍為1-17 個，且分布極不均勻，分子量范圍為43.09-220.47 kD。亞細胞定位預測顯示，大部分基因定位于葉綠體和細胞膜，少部分基因定位于線粒體、內質網、細胞和細胞核。此外，甘蔗CBL、CIPK 基因家族成員蛋白序列（附圖1）與擬南芥相比具有相似性和一致性，結構域domain 及蛋白基序motif（圖1）分析表明家族內部成員間具有較強的保守性。

圖1 CBL-CIPK 基因家族的domain 與motif 分析Fig.1 Domain and motif analysis of CBL-CIPK gene family

2.1.2 SsCBLs、SsCIPKs 基因結構相似，并且在染色體上分散分布 CBL 家族成員具有相似的基因結構，內含子數目范圍為7-10 個，表明CBL 家族成員在進化過程中基因結構始終保持較好的一致性（圖2-A）；與CBL 家族明顯不同的是，CIPK 家族成員基因結構分為內含子富集和內含子缺失兩大類，其中有54 個成員無內含子，組成內含子缺失組，內含子富集組有28 個成員，分別含有1-4 個內含子，表明CIPK 家族在進化過程中具有鮮明的多樣性（圖2-B）。甘蔗CBL、CIPK 家族成員在染色體上的分布極不均勻。甘蔗CBL 家族成員僅分布在13 條染色體上，其中Chr.1B、Chr.1C、Chr.2A、Chr.2C、Chr.4B、Chr.7B、Chr.7C、Chr.7D 各包含1 個成員，Chr.1A、Chr.1D、Chr.3A、Chr.7A 各包含2 個成員，Chr.3B包含3 個成員（圖3-A），而甘蔗CIPK 家族成員分布在29 條染色體上，僅Chr.1C、Chr.4D、Chr.6B3條染色體上沒有CIPK 家族成員分布，值得注意的是，Chr.1D、Chr.2B、Chr.2C、Chr.2D、Chr.4C、Chr.7D 6 條染色體上形成了多個基因聚集的基因簇，這種結構的出現，可能與多個基因協同合作發揮功能有關（圖3-B）。

圖2 CBL-CIPK 基因家族的基因結構分析Fig.2 Analysis in the gene structures of CBL-CIPK gene family

圖3 CBL-CIPK 基因家族的染色體定位分析Fig.3 Analysis for their positions on the chromosomes in CBL-CIPK gene family

2.1.3 SsCBLs、SsCIPKs 順式作用元件分布的多樣性 通過順式作用元件分析發現，即使在同一進化樹分支上，甘蔗CBL 和CIPK 家族成員之間順式作用元件的數量、類型和順序也不盡相同，這表明順式作用元件出現的數量、類型和順序與進化樹分支并無顯著相關性，但一般來說，每個成員都包含上述3 種順式作用元件（圖4）。由于SsCBL9 上游2 000 bp 區域存在大量未測序堿基，所以預測出的順式作用元件較少。甘蔗CIPK 家族成員順式作用元件預測結果詳見附圖2。

圖4 甘蔗CBL 基因家族順式作用元件預測統計Fig.4 Predicted statistics for cis-acting elements of the sugarcane CBL gene family

2.1.4 SsCBLs、SsCIPKs 分布在不同的進化分支且存在基因復制現象 根據分支情況可將CBL 進化樹分為5 個亞族，4 個物種的CBLs 分布較為均勻，各亞族分別包含2-5 個SsCBLs，其中第II 亞族不包含AtCBLs（圖5-A）。CIPK 進化樹可分為6 個亞族，82 個SsCIPKs 在這5 個亞族中呈不均勻分布，第I-V 亞族分別包含6、15、6、27、28 個SsCIPKs，第VI 亞族不包含SsCIPKs（圖5-B）。根據進化支及蛋白序列比對情況，選定SsCBL7、SsCBL9、SsCBL12、SsCBL15、SsCIPK1、SsCIPK5、SsCIPK38和SsCIPK74 這8 個基因作為后續研究對象。共線性分析結果顯示，甘蔗全基因組內存在基因復制現象，由SsCBLs 和SsCIPKs 形成的重復基因共有10 對（紅色部分），在8 條染色體上分布很不均勻，有些基因在同一條染色體上形成基因連接簇，一個基因也可能與不同的基因相關聯，如SsCBL2 與SsCBL6、SsCBL7 和SsCBL8 形成了3 對重復基因，有趣的是，發生重復事件的基因都在進化樹的同一分支（圖5-C）。上述現象表明，基因重復事件的形成與染色體長度和基因位置無明顯關系，但與進化樹的分支有關，親緣關系越近，基因重復事件發生的可能性越大。

2.2 甘蔗CBL、CIPK基因家族部分成員非生物脅迫下定量分析

2.2.1 極端溫度下SsCIPKs 的誘導幅度較SsCBLs 更為明顯 SsCBLs 和SsCIPKs 在4℃低溫脅迫下有顯著表達（圖6-A-B），其中SsCIPK38 和SsCIPK74 的表達量在處理8 h 時達到最高點，SsCBL9、SsCBL15和SsCIPK1 的表達量在處理16 h 時達到最高點，SsCBL7 和SsCIPK5 的表達量在處理24 h 時達到最高點。從時間上看，SsCIPK38 和SsCIPK74 最早達到最高峰，基因反應也最敏感。從表達量來看，SsCBL7 的表達量最高，在15 h 左右達到峰值。值得注意的是，SsCIPKs 的誘導幅度更為明顯，峰值均高于對照。在45℃高溫脅迫下，SsCBL7、SsCBL12、SsCIPK5 和SsCIPK74 的表達量明顯高于對照，呈先增后減的趨勢，尤其是SsCBL7 在處理24 h 時表達量最高，峰值超過30，其次是SsCIPK5，峰值在7左右（圖6-C-D）。

圖6 參與不同溫度脅迫響應的SsCBLs、SsCIPKs 基因的RT-qPCR 分析Fig.6 RT-qPCR analysis of SsCBLs,SsCIPKs genes involved in different temperature stresses response

2.2.2 NaHCO3、PEG 脅迫下SsCBLs 和SsCIPKs 基因表達趨勢較為一致 NaHCO3脅迫下，下降基因的表達趨勢差異比較大（圖7-A-B），處理24 h 時，SsCBL7 和SsCBL12 的表達量達到最高點，其中SsCBL7 的表達量最高，峰值超過50，48 h 時，SsCIPK5的表達量達到最高點。PEG-6000 脅迫下，SsCBLs和SsCIPKs 的表達表現出一定的共性（圖7-C-D），PEG 處理2 h 后，所有基因都有明顯的反應，最明顯的是SsCBL7、SsCBL12、SsCIPK1 和SsCIPK5。SsCBL15 和SsCIPK5 呈下降趨勢，SsCBL9、SsCBL12和SsCIPK1 呈下降趨勢，SsCIPK38 和SsCIPK74 呈下降趨勢，值得注意的是，SsCBL7 的表達情況最為特殊，除8 和24 h 表達量較低外，其余時間均有超高表達。

圖7 參與NaHCO3/PEG 脅迫的SsCBLs、SsCIPKs 的RT-qPCR 分析Fig.7 RT-qPCR analysis of SsCBLs,SsCIPKs genes involved in NaHCO3/PEG stresses

2.3 SsCBLs與下游蛋白SsCIPKs存在互作關系

為了進一步驗證甘蔗SsCBLs 與下游蛋白Ss-CIPKs 的相互作用，篩選SsCBL1、SsCBL8、SsCIPK47 和SsCIPK81 進行酵母雙雜試驗。結果（圖8）顯 示，SsCBL1 與SsCIPK47、SsCBL1 與SsCIPK81、SsCBL8 與SsCIPK47 和SsCBL8 與SsCIPK81 相互作用。但是，SsCBLs 和SsCIPKs 蛋白之間的互作機制仍需進一步探討。

圖8 SsCBLs 和SsCIPKs 之間的相互作用分析Fig.8 Interaction between SsCBLs and SsCIPKs

3 討論

在生長發育過程中，低溫、高溫、鹽害、干旱等非生物脅迫成為限制植物優質高產的重要環境因素。CBL-CIPK 信號網絡是解碼環境脅迫引發的鈣信號［26］、調控植物生長發育和應對植物面臨的脅迫的重要調控機制之一［27］。

藜麥中有16 個CBLs 和41 個CIPKs［28］，紫花苜蓿中有68 個CBLs 和135 個CIPKs［29］。本研究通過對甘蔗進行全基因組分析，篩選出19 個CBL 基因家族成員和82 個CIPK 基因家族成員。家族成員基本理化性質分析表明，不同成員之間的理化性質差異很大，并且2 個家族之間存在顯著差異，這與亞洲梨（Pyrus bretschneideri）CIPK 家族成員具有巨大差異相似［30］。多序列比對、蛋白基序和結構域分析表明，19 個SsCBLs 都具有4 個EFhand 結構，其中17 個成員具有N 端豆蔻?；Y構域，這種結構有助于CBL 蛋白結合Ca2+，12 個成員具有C 端PFPF 結構域，該保守位點是增強CBL 與CIPK 結合和相互作用的關鍵因素［31］。82 個SsCIPKs 都具有一個N 端的結合結構域Pkinase 和一個C 端的激活結構域NAF［32］，2 個結構域同時存在使得CBL 蛋白與CIPK 蛋白順利結合進而激活CIPK 蛋白發揮相應功能［33］?；蚪Y構與染色體定位分析表明甘蔗CBL家族成員基因結構相似，保持較高的一致性。19 個SsCBLs 不均勻地分布在13 條染色體上。甘蔗CIPK家族成員基因結構差異較大，有54 個成員內含子缺失和28 個成員內含子富集，內含子缺失型基因表達可能與逆境脅迫有關，干旱可誘導內含子缺失型基因在大豆中的表達［34］，但在甘蔗中這一現象尚未發現。82 個SsCIPKs 不均勻地分布在29 條染色體上，與山核桃（Carya illinoinensis）相似，30 個CiCIPKs基因不均勻地映射在12 條山核桃染色體上［35］，在部分染色體上形成獨特的基因簇，多個基因聚集在一起協同發揮功能。順式作用元件分析表明，甘蔗CBL 和CIPK 家族成員基因上游2 000 bp 啟動子區域存在大量抗逆、激素反應和生長發育的相應反應元件，這些元件出現的順序、數量和類型各不相同，沒有明顯的規律。系統進化樹表明，兩棵進化樹分別分為5 個亞支系和6 個亞支系，每個亞支系都包含大量成員，且分支明顯，推測其進化方向較為獨立。甘蔗種內發生了10 對基因重復事件，并且發生重復事件的基因對屬于進化樹的同一分支，而這一現象在以往的研究中并未發現。

在不同非生物脅迫處理下，SsCBLs 和SsCIPKs的表達量顯著不同，這種差異主要體現在響應速度、表達量和表達趨勢3 個方面，造成這種差異的原因尚不清楚，但目前可以排除進化關系的可能，因為在進化樹中不同亞族、同一亞族、同一分支這3 種關系的基因表達譜均存在明顯差異。SsCIPK38 和SsCIPK74 對低溫脅迫的響應最為迅速，反應極靈敏。辣椒CaCIPK13 的過表達提高了辣椒的耐寒性［36］，柑橘CuCIPK16 的過度抑制增強了轉基因擬南芥的耐寒性［37］，紫雛菊SpCBL6 增強了轉基因擬南芥的耐寒性［38］。在45℃高溫脅迫下，SsCBL15 的表達量較低，且變化趨勢不大，與桃（Prunus persica）PprCBL1、PprCIPK18 的表達水平類似，在不同階段都比較穩定［39］。NaHCO3脅迫下，各成員在表達幅度和響應速度方面也表現出明顯差異，說明NaHCO3對于基因表達的誘導作用非常顯著，其中SsCBL7、SsCBL12、SsCIPK5 的表達最為敏感。丹參和金銀花（Lonicera japonica Thunb.）中也存在類似的基因，其中SmCIPK13 的表達水平在NaCl 脅迫處理后顯著增加［40］，LjCBL2/4、LjCIPK1/15/17 對鹽脅迫非常敏感［41］。PEG-6000 脅迫下，SsCBL7 的表達譜最值得注意，除PEG 脅迫的8 h 和24 h 低量表達外，其他時間均保持高度表達，且表達量遠高于對照組和其他基因，形成了獨特的表達譜。此外，在PEG 脅迫過程中，SsCIPK1 和SsCIPK5 也表現出大幅度、高表達量和快速響應的表達譜，這與CaCIPK20 在干旱脅迫下在辣椒中表達上調［42］相似，StCIPK10 增強了馬鈴薯對干旱和滲透脅迫的耐受性［43］，這些都可以為后續篩選優良的耐旱基因提供參考。有趣的是，酵母雙雜交試驗表明，SsCBL8 可分別與SsCIPK47 和SsCIPK81 相互作用，推測這種相互作用可增強SsCBL8 基因的功能。此外，SsCBL1 也能分別與SsCIPK47 和SsCIPK81 相互作用。在茶樹［44］和棉花［45］中也有類似的結果，多對CBL-CIPK 基因組合在應對低溫和干旱脅迫時發生相互作用，形成蛋白質復合物。后續工作可對CBL-CIPK 蛋白質互作網絡做進一步的研究和探索。

4 結論

從甘蔗中鑒定出19 個CBL 基因家族和82 個CIPK 基因家族，SsCBL7、SsCIPK5、SsCIPK38 對溫度變化敏感，SsCBL7、SsCBL12、SsCIPK5 對鹽脅迫敏感，SsCBL7、SsCBL12、SsCIPK1、SsCIPK5 對滲透脅迫敏感。同時，SsCBLs 和SsCIPKs 之間具有相互作用。SsCBL7、SsCBL12、SsCIPK1 和SsCIPK5是具有抗多重逆境能力的候選基因，SsCBL1-Ss-CIPK47、SsCBL1-SsCIPK81、SsCBL8-SsCIPK47 和Ss-CBL8-SsCIPK81 四對基因相互作用形成復雜的蛋白質復合物，在抵抗逆境過程中發揮重要作用。

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