甜菜BvBADH 基因家族全基因組鑒定及其高鹽脅迫下的表達分析

李昊 伍國強 魏明 韓悅欣

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730050）

鹽脅迫是影響全球植物生長和作物產量的最主要環境因子［1］。世界上約有20%的土地受到鹽漬化的危害［2］，隨著全球氣候變暖鹽漬化程度呈逐年加劇趨勢［3］。到2050 年，超過50%的耕地受到鹽漬化的影響［4］。植物在長期進化過程中，逐漸形成了各種各樣的鹽漬適應機制。在鹽脅迫下，植物可通過積累脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等有機滲透物，降低細胞滲透勢，保護細胞免受或減輕鹽脅迫造成的傷害。其中，甜菜堿是一種季胺型水溶性生物堿，在自然界中廣泛存在，因其最初從甜菜（Beta vulgaris）中提取而得名。植物中發現的甜菜堿有12種，其中化學結構最簡單且發現最早的是甘氨酸甜菜堿（glycine betaine,GB）。高等植物的28 個科中，均存在著甜菜堿，尤其是在藜科和禾本科植物中鹽和干旱脅迫能促進 GB 合成和積累［5-7］。由此可見，GB 在植物逆境脅迫響應中發揮著重要作用。

甜菜堿在植物體內的合成過程由兩步反應催化生成［8］。在催化反應中，第一步的催化酶為膽堿單加氧酶（choline monooxygensase,CMO），其將膽堿轉化為甜菜堿醛，甜菜堿醛是一種有毒物質［9-10］。第二步由甜菜醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）將甜菜堿醛轉化為無毒的甘氨酸甜菜堿［11］。CMO 和BADH 均分布在葉綠體基質中，它們的活性受鹽堿、干旱等條件的誘導［12］。研究表明，過表達CMO 并不能引起GB 的積累，但BADH 對GB 生物合成途徑至關重要［13］。過表達BADH 使轉基因植物GB 含量顯著增加，表明BADH是調節甜菜堿合成并維持植物體內滲透平衡的耐鹽關鍵基因［14］。

Weretilnyk 和Hanson［15］在菠菜（Spinacia oleracea）中鑒定到第一個高等植物BADH 編碼基因BoBADH。隨后，人們相繼在大麥（Hordeum vulgare）［16］、高 粱（Sorghum bicolor）［17］、水 稻（Oryza sativa）［18］、千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）［19］、海欖雌（Avicennia marina）［20］、中亞濱藜（Atriplex cemrolasiotica）［21］、遼寧堿蓬（Suaeda liaotungensis）［22］等植物中鑒定到BADH 基因家族成員。不同植物BADH 長度差別較大，在1 482-1 581 bp之間；但其編碼的氨基酸數目卻大致相近，在494-502 aa 之間。大量研究表明，BADH 過表達可顯著提高植物的耐鹽性［23］。異苞濱藜（Atriplex micrantha）AmBADH 在玉米（Zea mays）中過表達后，轉基因植株丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量下降，相對電導率降低，葉綠素含量升高，使其產量得以提升［24］。過表達煙草（Nicotiana tabacum）NtBADH 使得轉基因胡蘿卜（Daucus carota）積累大量GB，在400 mmol/L NaCl 脅迫下能夠正常存活［5］。在馬鈴薯（Solanum tuberosum）中過表達四翅濱藜（Atriplex canescens）AcBADH 后，與野生型植株相比，轉基因植株中H2O2和MDA 含量降低，脯氨酸和葉綠素含量升高，耐鹽性顯著增強［25］。在紫花苜蓿（Medicago sativa）中過量表達大豆（Glycine max）GmBADH 可提高轉基因植株過氧化物酶（peroxidase,POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性，從而清除氧自由基，使轉基因植株的滲透能力得以增強，在鹽脅迫下能夠正常生長［26］。在鹽處理72 h 后，水稻中耐鹽品系BADH 活性是鹽敏感品系的2.5 倍［27］。轉BADH 基因的核桃（Juglans regia）能在高鹽環境下旺盛生長，而野生型植物的生長幾乎停滯［23］。過表達 BADH 的轉基因煙草植株GB 含量增加了6-30 倍，這也是導致其耐鹽性增強的關鍵原因［6］。將大麥HvBADH1 轉到小麥（Triticum aestivum）中，鹽脅迫下轉基因植株GB 含量顯著增加，幼苗成活率得到提高，降低鹽脅迫對植株的影響［28］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達角果堿蓬（Suaeda corniculata）ScBADH 和小麥TaBADH，均可使轉基因植株積累更多GB，從而提高其耐鹽性［29-30］。過表達菠菜SoBADH 使得轉基因煙草植株的耐鹽性顯著提高［8］。這些結果表明，BADH 在植物GB 的生物合成途徑及其在耐鹽性中扮演重要角色，在農作物抗逆性遺傳改良中具有廣闊的應用前景。

甜菜（Beta vulgaris）是石竹目（Caryophyllales）藜科（Chenopodiacdiaceae）二年生草本植物，主要分布在我國西北、華北、東北等干旱半干旱地區。作為我國的第二大糖料作物，甜菜擁有較高的經濟價值，用其制糖不僅可滿足人們對食物的直接需求，還可為化工、醫藥、食品加工等多個行業提供配料。另外，甜菜屬于典型的嗜鹽作物，具有很強的抗鹽堿能力和出眾的耐貧瘠性，是鹽堿地改良和大田輪作的重要經濟作物［31］。甜菜基因組序列于2014 年完成并公布［32］，為甜菜抗性基因挖掘和抗性基因表達調控網絡研究提供便利。鑒于此，本研究擬采用生物信息學手段，從基因組水平挖掘和鑒定甜菜BADH 基因家族，對其理化性質、系統發育、染色體定位、基因結構、順式作用調控元件、保守基序及其在鹽脅迫下的表達模式進行分析。以期為我國北方地區農作抗逆性遺傳改良提供理論依據和優異基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜菜（B.vulgaris）品種為‘甘糖七號’，種子購自武威三農種業科技有限公司。選用Hoagland 營養液對該甜菜進行培養。

1.2 方法

1.2.1 甜菜BvBADH 基因家族鑒定 將從擬南芥基因組數據庫TAIR（http://www.arabidopsis.org）獲得的AtBADH 氨基酸序列作為參考，利用NCBI 基因組數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和甜菜基因組數據 庫（http://bvseq.boku.ac.at/index.shtml），通過BLAST 在線搜索 BvBADH 基因家族成員序列。BvBADHs 預選蛋白的所有同源蛋白序列均滿足期望值（expected value,E）＜10-40。擬南芥AtBADH 蛋白質序列從NCBI 網站下載。通過在線軟件（http://web.expasy.org/protparam/）預測BvBADH 蛋白質等電點（isoelectric point,pI）和理論分子量（molecular weight,Mw）［33］。蛋白質 疏水性（grand average of hydropathicity,GRAVY）、不穩定指數（instability index）和脂肪指數（aliphatic index）利用在線軟件ExPASy（http://web.expasy.org/tools/protparam）進 行預測。

1.2.2 甜菜BvBADH 染色體定位分析 根據甜菜基因組數據庫信息，在甜菜9 對染色體上找出BvBADHs 位置，利用MapInspect 1.0 軟件對BvBADHs家族成員進行染色體定位。

1.2.3 甜菜BvBADH 系統發育、基因結構和保守基序分析 從NCBI 網站下載擬南芥、菠菜、大豆、高粱、藜麥（Chenopodium quinoa）、水稻、煙草、玉米BADH 基因序列，系統發育樹利用 MEGA 11.0 軟件（https://www.megasoftware.net/）使用鄰接比對法（neighbor joining,NJ）以 1 000 次重復構建［34］。根據BvBADH 編碼區序列（coding domain sequence,CDS）及基因組序列，通過在線工具 GSDS 2.0（https://gsds.cbi.pku.edu.cn/）預測BvBADH 外顯子/ 內含子結構［35］。利用在線軟件MEME 5.0（https://meme.suite.org/tools/meme）預測 BvBADH 保守基序，其中設定的參數調整如下：基序值=12，其他數據使用默認數值［36］。

1.2.4 甜菜BvBADHs 蛋白結構分析 采用MEGA 11.0 軟件將BvBADH 家族成員的CDS 翻譯成氨基酸序列，利用在線軟件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）分析二級結構，采用SWISS-MODEL（https://beta.swissmodel.expasy.org/）預測三級結構。

1.2.5 甜菜BvBADH 啟動子區域順式作用元件預測 BvBADH 翻譯起始位點上游2.5 kb 鑒定為啟動子區域，利用PlantCARE 數據庫分析BvBADH 啟動子區域可能存在的各種順式作用元件［37］。

1.2.6 植物材料的培養和處理 挑選籽粒飽滿的甜菜種子，用75%乙醇處理2-3 min，然后用無菌水漂洗3 次，最后用無菌水浸泡24 h［38］。將浸泡的種子播在含有蛭石的營養缽中，然后置于培養室內進行培養。培養室的條件：溫度25℃/20℃（晝/夜），光照周期16 h/8 h（晝/夜），相對濕度為 65%-70%，光密度550-600 μmol/（m2·s）。每2 d 澆灌一次蒸餾水，待種子萌發子葉露出蛭石后，用Hoagland 營養液澆灌培養。待長至4 周齡時，選取大小、長勢一致甜菜幼苗，分別用含有0、100 和150 mmol/L NaCl 的Hoagland 溶液處理，在處理12和24 h 收集甜菜幼苗葉片，立即放入液氮中冷凍，然后放置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.7 甜菜BvBADH 表達模式分析 為探究BvBADH家族成員在鹽脅迫響應中的作用，采用 RT-qPCR 方法分析其表達模式?？俁NA 提取采用UNIQ-10 柱式Trizol 試劑盒（生工，上海）。第一鏈cDNA 合成用Prime ScriptTMRT Master Mix Kit（TaKaRa，大連）。RT-qPCR 反應體系按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII Kit（TaKaRa，大連）說明書進行。所用BvBADHs 及內參基因BvACTIN（GenBank accession No.XM_010673076）引物序列見表1。BvBADH 相對表達水平采用2-ΔΔCt方法進行計算。所有結果均以3 次生物學重復的平均值±SE 表示，每個生物學重復由3 次技術重復組成。使用SPSS 22.0 軟件，在P＜0.05 水平上通過多重檢驗評估各均值之間的顯著差異。

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表1 本研究所用RT-qPCR 引物序列Table 1 Sequences of primers used for RT-qPCR in this study

2 結果

2.1 甜菜BvBADH基因家族成員的鑒定

在甜菜基因組序列中共檢索出 11 條 BADH 候選基因序列，除去不完整序列后，最終確定 9 條序列為甜菜BADH 基因。根據 BADH 在甜菜基因組序列中的順序將其命名為 BvBADH1-BvBADH9。序列分析表明（表2），BvBADH 基因家族成員的CDS 為1 500 bp（BvBADH1）-1 608 bp（BvBADH8），蛋白質長度在 500-535 aa，平均約516 aa。Mw 為54.25 kD（BvBADH4）-58.71 kD（BvBADH8）。pI 為5.24（Bv-BADH3）-6.98（BvBADH9）?？?見BvBADHs 是 一類偏酸性的蛋白質。GRAVY 為-0.111（BvBADH6）-0.066（BvBADH9）。其中，BvBADH1-8 的GRAVY為負值，屬于親水性蛋白，而BvBADH9 的GRAVY為正值，屬于疏水性蛋白。脂肪指數是蛋白質中脂肪族側鏈氨基酸（Ala、Val、Leu 和Ile）含量的相對值，其中最高的是BvBADH9，為95.72；最低的是BvBADH8，為85.74，平均值為88.74。蛋白質不穩定指數最低的是BvBADH4，為22.07；最高的是BvBADH9，為38.12，均小于40，表明BvBADHs 較為穩定。

表2 甜菜BvBADH 基因家族成員鑒定Table 2 Identification of BvBADH gene family members in sugar beet

根據甜菜每對染色體長度以及BvBADH 基因家族成員的起始位置，利用MapInspect 1.0 進行染色體定位并繪圖。結果（圖1）表明，BvBADH9 在2 號染色體，BvBADH8 和BvBADH7 定位在6 號條染色體，5 號（BvBADH1、BvBADH2 和BvBADH6）和8號（BvBADH3、BvBADH4 和BvBADH5）染色體均有3 個基因。

圖1 甜菜BvBADH 基因家族染色體定位分析Fig.1 Analysis of chromosome location of the BvBADH gene family in sugar beet

2.2 甜菜BvBADHs多序列比對和系統發育分析

為研究BvBADH 與其他植物BADH 家族成員的系統發育關系，本研究選用甜菜、菠菜、擬南芥、玉米、水稻、大豆、高粱、煙草和藜麥等9 個物種69 個BADH 基因編碼氨基酸序列，采用MAGA11.0 軟件構建系統發育樹。結果（圖2）表明，BADHs 基因家族可分為3 個簇，即簇I、II 和III，其中簇III 又分為2 個亞簇，簇IIIa 和IIIb。BvBADH1、BvBADH2、BvBADH3 和BvBADH5 屬于簇IIIb，BvBADH4屬于簇IIIa，BvBADH9 屬于簇II，而BvBADH6、BvBADH7 和BvBADH8 屬于簇I。進一步發現，BvBADHs 與十字花科植物擬南芥AtBADHs 和藜科植物菠菜SoBADHs 進化關系較近，而與禾本科植物玉米ZmBADHs 和水稻OsBADHs 進化關系較遠（圖2）。

圖2 植物BADH 基因家族系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of BADH gene family in plants

為進一步分析BvBADH 基因家族的保守結構域，采用DNAMAN 10.0 對其蛋白質序列進行多重比對。結果（圖3）表明，BvBADH 家族成員的氨基酸相似性為81.72%。BvBADH 具有保守十肽序列。由此表明，甜菜BvBADHs 是一類高度保守的蛋白，其家族成員可能發揮相同的功能。

圖3 甜菜BvBADH 基因家族氨基酸序列多重比對Fig.3 Amino acid sequence multiple alignment of the BvBADH gene family in sugar beet

2.3 甜菜BvBADHs基因結構和蛋白基序

為確定BvBADHs 基因結構多樣性，本研究對其內含子和外顯子分布進行分析和比較。結果（圖4）表明，BvBADHs 外顯子數量為9 個（BvBADH3、BvBADH4 和BvBADH5）-15 個（BvBADH1 和BvBADH2）不等。為進一步探究BvBADH 結構特征，通過MEME 預測其編碼蛋白質的保守基序。結果（圖5）表明，不同成員的保守基序的數量也各不相同，7-12 個不等。其中，基序1 是BvBADH 編碼氨基酸的高度保守序列。

圖4 甜菜BvBADH 基因家族基因結構分析Fig.4 Analysis of the gene structure of BvBADH gene family members in sugar beet

圖5 甜菜BvBADH 基因家族蛋白保守基序分布及特征分析Fig.5 Distribution and characteristics of conserved motifs in BvBADH gene family of sugar beet

2.4 BvBADHs啟動子區域的順式作用調控元件

2.5 BvBADHs二級和三級結構分析

如表4 和圖6 所示，BvBADHs 二級結構的主要組分為α 螺旋，在9 個成員中除了BvBADH5為39.44%，其余均超過40%，其中含量最高的是BvBADH9，為48.22%。在BvBADH1-BvBADH5 中前50 aa 并沒有形成α 螺旋，而BvBADH6-BvBADH9則恰恰相反。另外，起連接其他結構作用的無規卷曲，伸展主鏈主要分布在C 端的各個區域（圖6）。

圖6 BvBADHs 蛋白質二級結構Fig.6 Secondary structure of BvBADHs protein

表4 BvBADHs 蛋白二級結構組成Table 4 Secondary structure composition of BvBADHs proteins%

將BvBADHs 基因編碼的蛋白序列輸入SWISSMODEL 在線工具，運行各自的三維結構發現，BvBADH1-BvBADH9 擁有較多的α 螺旋（圖7），與二級結構預測的結果一致。所有預測的BvBADHs 模型的GMQE（global model quality estimation）均在0.93（BvBADH2）-0.98（BvBADH7）之間，均接近于1，表明模型預測的準確性較高。

圖7 甜菜BvBADH 蛋白質三維結構Fig.7 Three-dimensional structure of BvBADH proteins in sugar beet

2.6 鹽處理下甜菜BvBADHs基因表達模式分析

與對照（0 mmol/L NaCl）相比，在100 和150 mmol/L NaCl 處理下，9 個BvBADHs 成員在甜菜葉中的相對表達水平均有所上調（圖8）。在100 mmol/L NaCl 處理12 h 后，BvBADH8 的相對表達水平最高，為對照的3.3 倍；在脅迫24 h 后，它們的相對表達水平均明顯下降，但仍高于對照，其中BvBADH7 下降最為顯著，相對表達水平較12 h 降低了1.7 倍。相比之下，除BvBADH1 外，在150 mmol/L NaCl 處理下，BvBADHs 相對表達水平低于100 mmol/L 處理。這些結果表明，BvBADH 基因家族在鹽脅迫響應中具有潛在的功能。

圖8 不同濃度 NaCl 處理下甜菜葉片BvBADHs 相對表達水平Fig.8 Relative expressions of BvBADHs in sugar beet leaves under various concentrations of NaCl

3 討論

BADH 在高等植物菠菜中首次分離得到后［39］，人們利用活性染色和柱層析方法證實了BADH 含有兩個同工酶BADH I 和 BADH II［40］，其中BADH I占總活性的 60%，占總蛋白含量的70% 左右。BADH II 已被證明調節多種植物香味的產生，如水稻［41］、羯布羅香（Dipterocarpus turbinatus）［42］、椰子［43］、扁豆（Lablab purpureus）［44］、南國梨（Pyrus ussuriensis ‘Nanguo Pear’）［45］和絲瓜（Luffa aegyptiaca Miller）［46］。然而，BADH I 則參與植物的逆境脅迫響應［47］；其可在滲透脅迫下形成甜菜堿，從而降低細胞滲透勢，提高植物對逆境脅迫的耐受性［48］。目前在不同植物中鑒定到BADH 家族成員，如菠菜16 個、玉米11 個、大豆6 個、三角葉濱藜（Atriplex triangularis）5 個［49］、藜麥3 個［50］、甘菊（Dendranthema lavandulifolium）2 個［51］。在本研究中，共鑒定出9 個BvBADH 基因，與其他物種的BADH 基因家族成員數量不盡相同，可能是因為不同物種在進化的過程中，特定基因的復制和缺失造成的這種現象。

根據不同物種BADH 氨基酸序列構建出系統發育樹，將高等植物BADH 分為三簇，即簇I、簇II 和 簇III（簇IIIa 和 簇IIIb）。在本研 究中，甜菜BvBADH 九個成員在3 簇中均有分布。另外，BvBADHs 具有一個高度保守的十肽序列VTLELGGKSP，與香蕉（Musa nana）［52］高度保守的十肽序列VSLELGGKSP 相似，但略有不同。因此，推斷BvBADH 基因家族9 個成員可能具有相似的生物學功能。

順式作用元件是轉錄調控的關鍵，在基因活性調控中扮演重要的角色［53］。啟動子區域的差異可能會影響一個基因的表達模式，從而進一步影響一些基因的功能［54］。在植物中，ABA、水楊酸等激素在植物生長發育與逆境脅迫響應過程中起重要作用［55］。在 BvBADH 基因家族成員中，鑒定出 11 個順式作用調控元件，基因上游不但包含激素相關的順式作用元件，還包含一些光響應元件（G-box）和低溫響應元件（LTR）等環境響應元件。這些結果表明，BvBADH 基因的表達不但會受一些激素調節，可能還會受到外界環境變化的影響。

研究表明，BADH 在植物響應各種非生物脅迫過程中起重要作用［56-60］。在鹽脅迫下，BvBADHs 基因的相對表達水平均有上調，在100 mmol/L NaCl下部分基因家族成員的表達量要高于150 mmol/L NaCl，這可能是由于高鹽濃度（150 mmol/L NaCl）影響了植物正常生長代謝所導致的。其中相對表達水平上調最高的是150 mmol/L NaCl 處理24 h 的BvBADH1。值得注意的是，BvBADH1 在高鹽濃度處理下，其相對表達水平隨時間的延長而升高，在24 h 時達到最高，顯著高于其他基因。然而，在同一處理時間內，BvBADH2 在150 mmol/L NaCl 下的相對表達水平大于100 mmol/L NaCl。由此可見，BvBADH1 和BvBADH2 受高鹽條件的誘導和上調。另外，BvBADH1 和BvBADH2 與擬南芥AtBADH9 與AtBADH10 同源性較高，這兩個基因在擬南芥抗逆性方面起著重要作用［61］。這些結果表明，BvBADHs 在嗜鹽作物甜菜響應鹽脅迫過程發揮重要作用，可為我國北方地區農作物抗逆性遺傳改良提供優異基因資源。

4 結論

在甜菜中共鑒定9 個BvBADH 基因家族成員，每個成員蛋白質的理化性質各不相同。高等植物BADH 家族可分為3 簇，BvBADH 家族成員在3 個簇中均有分布。100 和150 mmol/L NaCl 均顯著地誘導BvBADH 基因家族成員的表達，但在100 mmol/L NaCl 處理下的表達量高于150 mmol/L NaCl，表明BvBADH 基因家族在甜菜響應鹽脅迫過程中扮演著重要角色。