SEMA4D修飾鈦表面通過巨噬細胞調控內皮細胞功能的研究

周潔儀,張建蘭,謝玲玲,柳 姚,邱 憬

鈦及鈦合金材料因其良好的化學穩定性和生物相容性,被視為“親生物金屬”之一,被廣泛應用于口腔醫學領域[1-3]。近年來,種植義齒逐漸成為許多缺牙患者的首選修復方案[4-5]。在種植治療中,種植體與周圍骨組織之間形成良好的骨結合是治療成功的關鍵,但種植體周圍軟組織的修復和維持同樣具有不可忽視的關鍵作用。軟組織緊密附著在種植基臺表面,在種植體穿齦處形成良好的軟組織封閉,作為保護下方牙槽骨的生物屏障,防止細菌侵入,為骨改建提供良好的微環境,是種植體周圍組織保持長期健康和穩定的基礎[6-8]。種植手術后,種植體周圍軟組織是在局部軟硬組織發生創傷后開始愈合。在生物材料存在的條件下,多種細胞協作產生一系列的炎癥反應、血管生成以及新組織形成[9]。巨噬細胞在適當條件下可以轉化為M1型促進炎癥反應或轉化為M2型引導組織修復[10],而內皮細胞主導的血管生成能夠為組織再生提供必要的氧氣和營養物質[11]。在此過程中,種植體周圍的炎癥反應與血管生成相輔相成,共同構建有利于組織再生修復的生理微環境。

信號素家族第4組成員SEMA4D,其高親和力受體PlexinB1多表達于非淋巴細胞如神經細胞和內皮細胞,低親和力受體CD72多表達于淋巴細胞如T細胞、B細胞、DC細胞、巨噬細胞等,在上調血管生成和調節免疫反應中發揮重要作用[12-13]。在前期研究中,我們已成功采用堿熱處理和自組裝技術制備出SEMA4D修飾鈦表面,并通過構建內皮細胞-巨噬細胞間接共培養模型,證實其直接成血管及間接抗炎作用[14]?？紤]到內皮細胞和巨噬細胞表面均表達SEMA4D受體,并且細胞之間存在相互作用,故本研究擬以SEMA4D修飾鈦表面為基礎,構建巨噬細胞-內皮細胞間接共培養模型,探究其直接抗炎和間接成血管作用,更全面地分析SEMA4D修飾鈦表面內皮細胞和巨噬細胞間的交互作用,探索其促進軟組織愈合的潛力,為未來實現臨床轉化或新一代功能化種植體表面的研發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

純鈦片(99.5%,寶雞鈦業,中國),SiC砂紙(鷹牌,中國),氫氧化鈉(國藥,中國),PBS(Gibco,美國),多聚左旋賴氨酸(PLL,上海源葉,中國),牛血清白蛋白(BSA,廣州賽國,中國),SEMA4D(武漢華美生物,中國),小鼠源性巨噬細胞系RAW264.7、小鼠腦血管內皮瘤細胞系bEnd.3(中國科學院細胞庫,上海,中國),胎牛血清、DMEM培養基、青霉素-鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco,美國),CCK-8試劑盒(碧云天,中國),總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克,中國),引物(上海生工,中國),PrimeScript RT Master Mix(Takara,日本),SYBR Premix ExTaqⅡ(Takara,日本),恒溫水浴箱(國華電器,中國),場發射掃描電子顯微鏡(LEO,德國),JC2000D接觸角測量儀(Powereach,中國),細胞恒溫培養箱(Thermo,美國),超凈工作臺(Thermo,美國),多功能酶標儀(MD Spectramax 190,美國),QuantStudioTM7 Flex System(Applied Biosystem,美國),DM4000正置熒光顯微鏡(Leica,德國),DMILLED倒置顯微鏡(Leica,德國)。

1.2 樣品制備及表征

使用碳化硅砂紙將純鈦試件逐級打磨、拋光、洗滌和干燥。以光滑鈦表面為對照組,記為Ti。將光滑鈦浸入2 mol/L氫氧化鈉溶液,80 ℃條件下水浴加熱12 h,記為Ti-OH。將Ti-OH置于2.5 mg/mL多聚左旋賴氨酸(PLL)溶液中,于4 ℃避光過夜孵育,記為Ti-PLL。根據說明將SEMA4D稀釋成不同濃度(50、100、200 ng/mL),并與相同體積的10 mg/mL BSA溶液混合,于37 ℃孵育至少1 h。最后將Ti-PLL鈦片置入不同濃度的SEMA4D-BSA溶液中(25、50、100 ng/mL),于37 ℃下孵育至少3 h,分別記為Ti-4D25、Ti-4D50和Ti-4D100。每組隨機選擇3個試件,采用場發射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察表面微形貌,使用JC2000D接觸角測量儀檢測材料表面能。

1.3 細胞培養

將RAW264.7細胞和bEnd.3細胞復蘇后,加入DMEM培養基(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素),靜置于37 ℃、5% CO2的恒溫加濕培養箱中。每2～3 d更換一次新鮮的培養基。當達到80%的細胞融合時,培養的細胞傳代。RAW264.7每3 d傳代一次,bEnd.3每5 d傳代一次。

1.4 試件表面巨噬細胞的增殖活性檢測

將RAW264.7(2×103個/孔)接種到96孔板中4組試件表面。培養1、2、3 d后,棄培養液,PBS清洗,每孔加入110 μL含有10% CCK-8試劑的完全培養基,置于37 ℃恒溫培養箱孵育2 h,多功能酶標儀測定各孔吸光度值(波長=450 nm)。每組隨機檢測3個樣本并計算平均值。

1.5 RT-qPCR檢測巨噬細胞的炎癥基因和VEGF表達水平

將RAW264.7(4×105個/孔)接種到6孔板中4組試件表面,培養48 h后,棄培養液,PBS清洗,采用試劑盒提取巨噬細胞的總RNA,加入PrimeScript RT Master Mix逆轉錄為cDNA,將cDNA與相應的引物和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ混合后,以GAPDH為內參,檢測TNF-α、IL-6和IL-1β炎癥基因的表達水平和VEGF表達水平,基因引物序列見表1。通過2-ΔΔCt法計算基因表達的相對量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.6 巨噬細胞/內皮細胞間接共培養模型的構建

將RAW264.7(4×105個/孔)接種到6孔板中4組試件表面,培養48 h后,取培養液,4 ℃,1 000 r/min,10 min離心至少3次,將部分上清液以1∶1的比例與完全培養基混合,配制成條件培養基,分別記為Ti-CM、4D25-CM、4D50-CM和4D100-CM。將另一部分上清液1∶1與無血清培養基混合配制條件培養基,分別記為Ti-CM0、4D25-CM0、4D50-CM0和4D100-CM0。

1.7 內皮細胞增殖活性檢測

將bEnd.3(3×103個/孔)接種到96孔板。用條件培養基Ti-CM、4D25-CM、4D50-CM和4D100-CM分別培養1、3、5 d后,棄培養液,PBS清洗,每孔加入110 μL含有10% CCK-8試劑的完全培養基,置于37 ℃恒溫培養箱孵育2 h,多功能酶標儀測定各孔吸光度值(波長=450 nm)。每組隨機檢測3個樣本并計算平均值。

1.8 內皮細胞黏附觀察

將bEnd.3(1×104個/孔)接種到置于12孔板內的細胞爬片上,條件培養基Ti-CM、4D25-CM、4D50-CM和4D100-CM分別培養8 h后,4%多聚甲醛室溫固定30 min,鬼筆環肽染色30 min,DAPI染色3 min后,通過倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞黏附鋪展情況。

1.9 內皮細胞劃痕實驗

用Marker筆在6孔板背后劃好均勻的橫線作標記,將bEnd.3(4×105個/孔)接種到此6孔板中。保證細胞密度達到90%后用200 μL槍頭盡量垂直于細胞平面沿線劃痕,PBS清洗后,分別加入條件培養基Ti-CM0、4D25-CM0、4D50-CM0和4D100-CM0進行培養。選取0、12、24 h進行顯微鏡觀察細胞遷移并拍照。

1.10 統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件對各組試件的檢測結果進行方差齊性檢驗,顯示數據方差齊,進行單因素方差分析和SNK多重比較,當P<0.05時,認為具有統計學差異。采用GraphPad Prism 5軟件繪制圖表,使用字母標記法進行標注。

2 結 果

2.1 表面微形貌

圖1為掃描電子顯微鏡觀察4組試件的表面微形貌。對照組鈦表面相對光滑,高倍鏡下可見在處理過程中產生的機械摩擦痕跡。堿熱處理后鈦表面表現出疏松的多孔結構,經過SEMA4D溶液處理后試件表面形成一層有機薄膜,并且隨著SEMA4D濃度的增加,覆蓋的薄膜越來越致密。

圖1 掃描電子顯微鏡觀察4組試件的表面微形貌( ×40 000)Fig.1 Scanning electron microscope images of surface morphology of four specimens( ×40 000)

2.2 表面親水性

表面親水性檢測包括水接觸角和表面能,結果見圖2。結果顯示,Ti、Ti-4D25、Ti-4D50和Ti-4D100 4組試件的水接觸角逐漸減小,其表面能平均值分別為35.6、54.9、62.3、64.9 mN/m,呈逐漸增大趨勢。由此可見,與光滑鈦相比,改性后的鈦表面具有更好的親水性,并且隨著SEMA4D濃度的增加,表面親水性逐漸不斷增強。

2.3 試件表面巨噬細胞的增殖活性

RAW264.7細胞在4組試件表面增殖活性的CCK-8檢測結果如圖3所示。第1天未見明顯差異,第2天實驗組RAW264.7細胞的增殖活性高于對照組,并具有顯著性差異,尤其是Ti-4D50組和Ti-4D100組,第3天Ti-4D100組RAW264.7細胞的增殖活性最佳。

標注不同字母表示有統計學差異(P<0.05)。

2.4 試件表面巨噬細胞的炎性表達和VEGF表達

RT-qPCR檢測4組試件表面RAW264.7細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β的基因表達水平,結果如圖4所示。與光滑鈦對照組相比,SEMA4D處理組RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達量均呈下降趨勢,尤其是Ti-4D100組。同時,SEMA4D處理組的VEGF表達均優于光滑鈦對照組,且Ti-4D100組的表達量最多。

標注不同字母表示有統計學差異(P<0.05)。

2.5 內皮細胞的增殖活性

Ti-CM、4D25-CM、4D50-CM和4D100-CM培養bEnd.3細胞的CCK-8檢測結果如圖5所示。每組細胞數量均隨時間變化而增長,第1、3、5天各組間均未見明顯差異。

標注相同字母表示無統計學差異(P>0.05)。

2.6 內皮細胞的黏附能力

4組條件培養基培養8 h后bEnd.3細胞的黏附形態如圖6所示。鏡下可見SEMA4D處理組試件表面細胞的鋪展面積更大,并且顯示出更清晰的細長肌動蛋白絲。

圖6 條件培養基培養 8 h后的bEnd.3細胞黏附鋪展形態Fig.6 Adhesion and spreading of bEnd.3 cells after 8 hours of conditional medium culture

2.7 內皮細胞的遷移能力

4組條件培養基培養的bEnd.3細胞遷移能力檢測結果如圖7所示。12 h時,Ti、Ti-4D25和Ti-4D50三組的愈合率未見明顯差異,但Ti-4D100組具有顯著優勢。24 h后,相較于光滑鈦對照組,SEMA4D處理組均表現出優勢,且Ti-4D100組的愈合率仍為最高。

標注不同字母表示有統計學差異(P<0.05)。

3 討 論

基于本課題組的前期研究結果[14],本實驗通過堿熱法+自組裝技術將SEMA4D固定在純鈦表面,初步證實其具有一定的促進血管生成和免疫調節作用。生物材料的表面親水性是蛋白吸附和細胞黏附的決定性因素之一[15-16]。接觸角測量結果表明,與光滑鈦相比,SEMA4D修飾鈦表面具有更好的親水性,這有利于組織愈合初期蛋白質的吸附和細胞反應。隨著SEMA4D濃度的增加,親水性也隨之增強,這可能歸因于表面改性后負載的BSA[17]。掃描電鏡觀察顯示,SEMA4D修飾鈦表面組呈現出多孔結構且表面被有機薄膜覆蓋。隨著更多SEMA4D-BSA復合物組裝至堿化鈦表面,覆蓋的薄膜變得更加致密,表面負載的BSA不斷增加,故而親水性也隨之改善。

生物材料表面的理化特性可參與調控細胞中基因表達的級聯激活,進而影響細胞的生物學行為[18-19]。大量研究證實,中度親水性的生物材料表面可促進細胞生長,表現出優良的生物相容性[15,20]。CD72作為SEMA4D的低親和力受體,多表達于巨噬細胞等免疫細胞[21-22]。本研究在SEMA4D修飾鈦表面直接接種巨噬細胞,力圖探索此改性鈦表面的理化特性對巨噬細胞生物學行為的影響。根據CCK-8結果,SEMA4D修飾鈦表面可以顯著提高RAW264.7巨噬細胞的增殖能力,并且以Ti-4D100組為最佳。通過PCR檢測各組試件表面巨噬細胞的炎性表達顯示,與光滑鈦相比,SEMA4D修飾鈦表面巨噬細胞的促炎因子基因表達降低,但降低程度并未呈現出嚴格的SEMA4D劑量依賴性。據研究報道,SEMA4D能夠抑制單核細胞遷移,也可促進外周血單核細胞極化為M2表型[23-25]。SEMA4D通過與受體CD72相互作用參與免疫調節,且SEMA4D的免疫調節作用依賴于生物學環境[26]。本實驗中,SEMA4D與BSA自組裝后傾向于發揮積極的免疫調節作用,SEMA4D濃度為100 ng/mL時最佳。PCR檢測巨噬細胞的VEGF表達結果顯示,SEMA4D組對其分泌具有促進作用。SEMA4D與受體CD72結合后通過其尾部的ITIM基序募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP1,通過誘導酪氨酸去磷酸化和信號蛋白失活來抑制免疫細胞活化[27]。同時,酪氨酸磷酸酶SHP1在缺氧條件下可以調控HIF-1α的表達,進而影響VEGF的生成[28]。巨噬細胞分泌的血管內皮生長因子可以作用于內皮細胞表面的VEGF受體,促進內皮細胞存活、遷移和血管形成等,以發揮免疫調節和組織修復的重要作用。

本課題組在前期通過構建內皮/巨噬細胞間接共培養模型,驗證了SEMA4D修飾鈦表面可以通過內皮細胞間接促進巨噬細胞的抗炎表達。由于生理環境下生物材料與細胞、細胞與細胞之間都是相互作用的[29],間接共培養模型可以更好地模擬體內情況?；谶@一點,前述研究結果已表明SEMA4D修飾鈦表面具有直接的正向免疫調控作用和間接促進巨噬細胞分泌VEGF的效應,本實驗則進一步構建巨噬/內皮細胞間接共培養模型,以完善SEMA4D修飾鈦表面促血管-抗炎雙重作用的表型研究。CCK-8結果顯示,各組條件培養基培養的內皮細胞隨時間推移均呈現出細胞數量的顯著增長,表明無細胞毒性作用。文獻證據表明,當巨噬細胞炎癥表達降低并分泌內皮血管生長因子時,可以促進內皮細胞的遷移、黏附,從而改善受損血管的再內皮化[30]。鬼筆環肽染色實驗顯示,條件培養基培養8 h后SEMA4D處理組的內皮細胞鋪展更充分,而劃痕實驗結果顯示,24 h后SEMA4D處理組較對照組呈現顯著優勢,且SEMA4D濃度為100 ng/mL時內皮細胞的遷移黏附能力最佳,該現象與文獻證據保持一致。

本研究通過體外實驗證實,SEMA4D修飾鈦表面不僅可直接改善巨噬細胞的炎性表達,還可通過巨噬細胞間接促進內皮細胞的運動能力。與本課題組的前期研究結果相結合,能初步解析SEMA4D修飾鈦表面內皮細胞和巨噬細胞間的交互作用表型,但其內在分子機制仍有待進一步探究。此外,關于種植體基臺的另一重要考量為細菌黏附。堿熱處理后鈦表面的粗糙化不可避免,但大量研究表明,材料表面的理化特征均會影響細菌的黏附及成膜行為,這些特征包括:形貌模式、粗糙度、親水性和表面功能性化學基團修飾等[31]。Singh等[32]研究認為,粗糙度的增大并非一定導致細菌黏附的增加,通常會存在一個臨界值。Whitehead等[33]則研究發現,細菌形態也會影響其在不同粗糙度表面的黏附。因此,關于SEMA4D修飾鈦表面的細菌黏附及成膜行為亦有待后續的進一步探索。