EP300對口腔鱗癌細胞增殖和遷移的影響

王亞培,羅玉春,劉 為,劉 暢,唐婉容

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是世界上八大惡性腫瘤之一,也是最常見的頭頸部鱗狀細胞癌[1],目前全球口腔鱗癌的發病率約占頭頸部鱗癌的60%[2]。流行病學研究揭示OSCC的發病機制主要與基因、煙草[3]、酒精、炎癥、檳榔和人類乳頭瘤病毒感染相關[4],發病機制并不明確?，F階段對OSCC的治療通常是根據癌癥的類型、位置、疾病的階段采取以外科手術治療作為首選并輔助放化療的綜合性治療方法。術后咀嚼、吞咽以及言語等口腔功能的缺陷不同程度地影響了患者的身心健康,且頭頸部鱗癌患者5年生存率徘徊在50%～60%[5-6]。EP300是一種組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)[7],作為轉錄復合體的一部分,在細胞增殖、細胞周期調控、細胞凋亡、DNA損傷修復等多方面具有重要的生物學功能[8]。EP300基因突變與人類多種疾病(如腫瘤[9]、炎癥[10]、魯賓斯坦-泰比綜合征[11]等)的發病機制密不可分。越來越多的研究表明,EP300的表達和突變與腫瘤的發生發展密切相關。但其與腫瘤的關系復雜,存在雙重作用,即在不同的腫瘤類型或者腫瘤的不同階段存在抑癌或者促癌作用,且其背后的作用機制與網絡尚不明確。本實驗旨在探討EP300在口腔鱗癌細胞的表達水平及其生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株及細胞培養

口腔鱗狀細胞癌細胞株HSC3和UM1以及口腔黏膜上皮細胞株NOK,細胞已通過 STR 檢測,細胞接種于DMEM高糖培養基,內含10%的胎牛血清和1%的青、鏈霉素,培養于 37 ℃、5%CO2的飽和濕度孵箱。

1.2 主要試劑

LipofectamineTM3000 轉染試劑(Oriscience,中國);BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio,中國);ECL發光試劑盒(雅酶,中國);抗體:EP300(1∶1 000),β-tubulin(1∶2 000),羊抗兔/鼠二抗(1∶2 000)(Affinity,美國);CCK-8試劑盒(APExBio,美國);4%多聚甲醛(Biosharp,中國);結晶紫(碧云天,中國)。

1.3 生物信息學分析

通過UCSC(https://xenabrowser.net/)在線下載了泛癌數據集,從中提取EP300基因的表達數據,每個腫瘤中癌旁樣本和腫瘤樣本的表達差異是通過R軟件(version 3.6.4)計算的,使用非配對的秩和檢驗進行差異顯著性分析。又通過UALCA(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)在線數據庫分析了EP300在人頭頸鱗癌細胞(HNSCC)不同臨床分期、腫瘤分級及淋巴結轉移狀態和正常組織中差異表達。

1.4 qRT-PCR

檢測EP300的mRNA表達使用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA,使用Nanodrop儀器(Thermo,美國)檢測RNA純度和濃度。RNA經逆轉錄為cDNA,引物序列如下表所示(表1),PCR擴增EP300,以GAPDH作為內參。采用2-ΔΔCt法進行數據分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 Western blot檢測EP300的蛋白表達

接種細胞至10 cm培養皿并培養,用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞并提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,制作蛋白樣本。SDS-PAGE凝膠電泳分離并電轉蛋白至PVDF膜?？焖俜忾]液常溫封閉30 min。分別加入一抗EP300(1∶1 000),β-tubulin(1∶2 000),4 ℃孵育過夜,TBST沖洗3次,加入羊抗兔/鼠常溫孵育1 h,ECL化學發光法曝光顯色,使用Image J軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.6 細胞轉染

EP300基因沉默及空載質粒合成自北京擎科生物科技有限公司,質粒中均具有嘌呤霉素抗性序列。當HSC3、UM1細胞株生長密度為70%～80%時進行細胞轉染。采用LipofectamineTM3000 轉染試劑將低表達EP300的質粒轉染至HSC3、UM1細胞內,分別加入轉染試劑。細胞篩選:每孔加入含適量濃度的嘌呤霉素培養基篩選7 d,獲得穩轉細胞株,后續使細胞一直處于含有嘌呤霉素的培養基中增殖。用嘌呤霉素篩選目標細胞,提取細胞株的總RNA,qRT-PCR和Western blot法分別檢測細胞EP300基因和蛋白表達情況,以驗證shRNA轉染是否成功。

1.7 CCK-8法測定細胞增殖

按1 000個/孔的細胞量重復接種至96孔板中,分別在12、24、48、72、96 h更換10 μL CCK-8+100 μL新鮮培養基的混合液,酶標儀檢測450 nm處的光密度值(optical density,OD),并繪制細胞生長曲線。

1.8 細胞平板克隆實驗

將處于對數生長期的轉染成功的細胞和對照組細胞以500個/孔接種于6孔板中,培養14 d左右(直至顯微鏡下觀察絕大多數單個克隆細胞數≥50個),用4%多聚甲醛固定15 min,用0.1%結晶紫染色30 min,即可算每孔細胞克隆數,計算克隆形成率=克隆形成數/接種細胞×100%。

1.9 細胞劃痕實驗

將處于對數生長期的轉染成功的細胞和對照組細胞以5×106個/孔接種至6孔板中,待匯合度達80%～90%時,用滅菌的1 mL槍尖在細胞生長中心區域進行劃線,之后用PBS洗滌細胞兩次,加入2 mL DMEM基礎培養基,于倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.10 統計學分析

使用GraphPad Prism 9.4.1、Image J以及Adobe PhotoShop 23.0.0對本實驗數據進行統計分析和繪圖。兩組數據之間的統計學差異采用t檢驗或非參數檢驗分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EP300基因在泛癌組織及OSCC細胞株中的表達

通過在線數據庫UCSC(https://xenabrowser.net/)下載并分析,最終獲得了33個癌種的表達數據,結果顯示在全身多系統惡性腫瘤組織及其正常組織中EP300基因均有表達,體內不同腫瘤組織中EP300的表達水平有顯著差異,說明其在不同腫瘤中所發揮的作用也不盡相同。其中EP300在頭頸部鱗癌HNSCC中的表達水平明顯高于正常組織,(P<0.05)(圖1A)。進一步應用在線數據庫UALCAN分析腫瘤組織(n=520)及癌旁(正常)組織(n=44)中EP300的轉錄本數據發現,EP300在HNSCC組織中表達水平確實顯著高于癌旁組織(P<0.05)(圖1B),且EP300在臨床分期Ⅰ～Ⅳ期,腫瘤分級GⅡ～Ⅳ級,無淋巴結轉移及有淋巴結轉移分期N1～N2期的HNSCC組織中表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)(圖1C～E),表明在HNSCC中EP300可能發揮促癌基因的作用。

A:人體泛癌及正常組織中EP300的轉錄水平圖;B:EP300在HNSCC中的表達;C:EP300在不同臨床分期的HNSCC中的表達;D:EP300在不同病理分級的HNSCC中的表達;E:EP300在有無淋巴結轉移的HNSCC中的表達。

2.2 口腔鱗癌細胞和正?？谇火つど掀ぜ毎鸈P300表達水平分析比較

qRT-PCR檢測正?？谇火つど掀ぜ毎闚OK及兩種OSCC細胞株HSC3和UM1細胞株中EP300基因的表達,發現OSCC細胞株EP300的表達均高于NOK細胞(P<0.05)(圖2A)。進一步通過Western blot檢測EP300蛋白表達,發現EP300在蛋白水平的表達情況和基因水平的表達情況一致,均為OSCC細胞表達高于正常細胞(P<0.05)(圖2B)。

A:NOK、HSC3和UM1細胞株中EP300轉錄水平統計圖;B:NOK、HSC3和UM1細胞株中EP300、β-tubulin蛋白的灰度值統計分析圖(柱狀圖)及Western blot條帶;*:P<0.05;***:P<0.001。

2.3 低表達EP300細胞系的構建與驗證

通過shRNA轉染以及嘌呤霉素篩選目的細胞的方法,構建低表達EP300的HSC3和UM1細胞株,用于后續研究。用Western blot、qRT-PCR法檢測各組細胞中EP300的表達水平,如結果所示,HSC3和UM1細胞株的EP300低表達組和對照組相比,EP300 mRNA和蛋白表達水平顯著下降,差異具有統計學意義(P<0.05)(圖3)。表明EP300基因已被沉默,成功構建低表達EP300的HSC3和UM1細胞株。

A:qPCR驗證沉默HSC3和UM1細胞中EP300模型的構建;B:蛋白免疫印跡驗證沉默HSC3和UM1細胞中EP300模型的構建;**:P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.000 1。

A:HSC3、UM1細胞對照組和EP300低表達組在0、12、24、48、72、96 h的細胞活力;B:HSC3、UM1細胞對照組file:///C:/Users/Administrator/Desktop/%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%8A%A0%E5%B7%A5/2024.03/KQYX202402/KQYX202402/KQYX202402.ebook/images/0c29daeed3dee8e8cf7894a74903cb7e.jpg和EP300低表達組在培養14 d后平板克隆圖(左)和克隆數量統計分析圖(右);**:P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.000 1。

2.4 EP300表達水平對口腔鱗癌細胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測細胞12、24、48、72、96 h的細胞活力發現,與對照組相比,低表達EP300的HSC3和UM1組細胞增殖能力顯著下降,差異具有統計學意義(P<0.05)(圖 4A)。進一步通過平板克隆實驗證明,低表達EP300的HSC3和UM1組細胞的集落形成能力顯著下降(P<0.05)(圖 4B),說明沉默EP300能明顯抑制HSC3、UM1細胞的增殖能力。

2.5 EP300表達水平對口腔鱗癌細胞遷移能力的影響

劃痕實驗表明,HSC3、UM1細胞株的實驗組和對照組相比,低表達EP300的HSC3和UM1組細胞的遷移能力顯著下降(P<0.05)(圖5)。

HSC3、UM1細胞對照組和EP300低表達組遷移0 h和24 h圖片(上)以及遷移率的統計學分析圖(下);**:P<0.01;***:P<0.001。

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌顯著相關的危險因素包括煙草、酒精、病毒感染(如EBV、HPV和單純皰疹)等[12],其發病機制尚未明確。由于其存在轉移性和侵襲性,即使在醫學不斷進步的背景下,患者5年生存率仍然較低[13]。目前口腔鱗癌的治療重點已經轉移到靶向治療,尤其是在基因水平上靶向腫瘤細胞的增殖和凋亡作用。

EP300屬于KAT3家族的組蛋白乙酰轉移酶,分子量約為300 ku,是一種多功能多效大分子蛋白。EP300功能失調與人類多種疾病有關[14]。例如在人膠質母細胞瘤中的組蛋白H2B的高度乙?；椭饕怯葿RD、CREBBP和EP300所驅動[15]。EP300還能增強β-catenin激活TCF的轉錄能力,并且對于β-catenin介導的腫瘤轉化至關重要[16]。在不同類型的腫瘤中,EP300可作為促癌因子發揮作用,也能作為抑癌因子發揮作用[17-18]。其背后的作用機制主要包括:①乙?；M蛋白促進轉錄[19];②乙?；墙M蛋白,從而增強其活性[20];③作為轉錄輔助因子[21],將轉錄因子募集到目標基因的啟動子區域促轉錄。

EP300在口腔鱗癌中的具體作用還尚不清楚。研究前期生物信息學分析EP300基因在泛癌組織以及癌旁組織的表達水平發現,EP300基因在頭頸部鱗癌的表達水平顯著上調,因此,本課題組推測EP300基因可能作為一個促癌基因參與調控OSCC的進展。Cho等[22]已經用免疫組織化學染色證明證實了EP300在OSCC組織中過表達。我們進一步在細胞水平上進行驗證,通過培養NOK、HSC3、UM1三種細胞系,分別檢測了EP300在正?？谇火つど掀ぜ毎约翱谇击[癌細胞中的表達水平,結果發現OSCC細胞株中EP300蛋白和mRNA表達水平均顯著高于NOK。為了進一步研究EP300對OSCC細胞多種生物學行為的影響,構建了沉默EP300基因的HSC3、UM1細胞株,通過相關實驗證明EP300敲低后使OSCC細胞的增殖能力、遷移能力以及集落形成能力得到了顯著抑制,表明EP300對口腔鱗癌的生長可能存在促進作用。

綜上所述,口腔鱗癌中高表達的EP300作為促癌因子顯著促進了腫瘤細胞的增殖和遷移。但其對腫瘤影響的具體作用機制尚不明確。有學者通過芯片模型分析發現EP300能使腫瘤對機體產生免疫抑制功能,且對腫瘤糖代謝也會產生影響[23]。因此本課題下一步將初步探索EP300基因對OSCC細胞糖代謝的影響,以挖掘EP300基因敲低后其胞內環境以及生物學行為改變的發生機制。