異基因造血干細胞移植患者T 淋巴細胞亞群與EB 病毒感染的相關性分析

陳希，金宏飛，吳青，劉靜

淋巴瘤等惡性血液病嚴重威脅著人們的健康與生存，隨著醫療技術的發展，異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation， allo-HSCT）逐漸成為治療惡性血液病的有效手段［1］。而移植后的免疫功能重建（immune reconstitution， IR）是影響allo-HSCT 療效的主要因素之一［1-2］，延遲的IR 會導致移植后感染、疾病復發和死亡率增加［3］。Berger 等［4］、Kim 等［5］均報道過allo-HSCT 3 個月后，CD4+T 淋巴細胞水平升高與患者總體生存率相關，CD4+T 淋巴細胞恢復正常水平的患者非復發死亡率降低，機會性感染發生概率下降，提示CD3+CD4+T 淋巴細胞計數是移植后IR 的重要指標。EB 病毒（Epstein-Barr virus， EBV）屬γ皰疹病毒亞科，是唯一能引起人類感染的淋巴濾泡病毒，與多種腫瘤的發生、發展有密切的聯系，被認為是免疫失調的觸發點［6-8］。巨細胞病毒（cytomegalovirus， CMV）屬β 皰疹病毒亞科，也是allo-HSCT患者發生并發癥及死亡的主要原因［9］。EBV 和人巨細胞病毒（human cytomegalovirus， HCMV）都與機體的免疫功能相關，病毒感染陽性的allo-HSCT 患者大多存在淋巴細胞亞群分布不平衡，并且與患者的康復程度、生存率都密切相關［10］。最近有研究探討了allo-HSCT 患者的IR 中T 淋巴細胞亞群的分布和γ 皰疹病毒的感染情況［11］，然而allo-HSCT 患者的T 淋巴細胞亞群與病毒感染相關性的研究并不深入。本研究主要分析了allo-HSCT 患者T 淋巴細胞亞群和病毒感染的相關性，探討T 淋巴細胞亞群的變化對預測allo-HSCT 后EBV 感染的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇北部戰區總醫院2015 年5 月至2021 年12 月行allo-HSCT 的67 例患者作為研究組，同時選取54 例造血干細胞移植供者作為對照組，納入標準：（1）診斷均符合《血液病診斷療效與標準》［12］；（2）EBV DNA＞4.0×102copies/ml；（3）HCMV DNA＞4.0×102copies/ml。排除標準：（1）合并心肌炎、肝炎等的危急病情；（2）合并自身免疫病等免疫系統疾病。研究組患者年齡（25.00 ± 7.00）歲，其中男性患者43 例，女性患者24 例，原發病包括急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia， AML）28 例，急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）28 例，骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes， MDS）11 例。對照組患者年齡（30.00 ±10.00）歲，男性患者34 例，女性患者20 例，各項體檢指標均無明顯異常。2 組患者年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過北部戰區總醫院醫學倫理委員會批準（倫理批號：Y2022215），并通過免除知情同意申請。

1.2 方法

1.2.1 外周血中性粒細胞（neutrophil， NEU）與淋巴細胞（lymphocyte， LYM）的檢測 將DIFF 溶血劑與樣本混合后，使用全自動血液細胞分析儀（BC-6900；邁瑞公司）進行檢測。取患者EDTA-K2抗凝的全血，根據操作步驟，上機檢測。

1.2.2 外周血中EBV-DNA 拷貝數的檢測 采用圣湘生物科技股份有限公司提供的EBV 熒光定量檢測試劑盒（PCR 熒光探針法），取患者EDTA-K2抗凝的全血800 μl，加入紅細胞裂解液，震蕩混勻至透明，12 000 r/min（離心半徑為8 cm）離心3 min，加入生理鹽水混勻，12 000 r/min 離心3 min，沉淀液中加入400 μl 核酸釋放劑，75 ℃加熱10 min 后備用擴增。另外，每批次標本同時擴增試劑盒中4 個病毒陽性定量參考品（4×104～4×107），以及陰性、弱陽性和強陽性質控品，根據其結果對擴增效率進行質控，并分析得出所測樣品中病毒DNA 總含量（用基因copies/ml 表示）。

1.2.3 外周血中HCMV-DNA 拷貝數的檢測 采用圣湘生物科技股份有限公司提供的HCMV 熒光定量檢測試劑盒（PCR 熒光探針法），取患者生化采血管中血清100 μl，加入等體積濃縮液，12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入50 μl 核酸釋放劑，與沉淀震蕩或移液槍吹打混勻，室溫靜置10 min，作為待測樣本備用擴增。另外，每批次標本同時擴增試劑盒中4 個病毒陽性定量參考品（4×104～4×107），以及陰性、弱陽性和強陽性質控品，根據其結果對擴增效率進行質控，并分析得出所測樣品中病毒DNA 總含量（用基因copies/ml 表示）。

1.2.4 T 淋巴細胞亞群檢測 取患者EDTA-K2抗凝的全血，T 淋巴細胞亞群應用免疫熒光單克隆抗體標記，采用流式細胞儀檢測細胞百分比并進行數據分析。使用CD3+-FITC、CD4+-APC、CD8+-PE、CD16+-PE、CD56+-PE 熒光抗體，檢測包括CD3+CD4+T 淋巴細胞、CD3+CD8+T 淋巴細胞和CD4+/CD8+比值及CD16+CD56+自然殺傷（natural killer， NK）細胞。CD3+CD4+T 淋巴細胞正常參考值范圍為31%～60%，CD3+CD8+T 淋巴細胞正常參考值范圍為13%～41%，CD4+/CD8+比值正常參考值范圍為0.71～2.78，CD16+CD56+NK 細胞正常參考值范圍為5%～27%。

1.2.5 檢測試劑 CFX ConnectTMReal-Time PCR Detection System 購自Bio-Rad Laboratories， BD MultiTEST IMK Kit 購自美國Becton Dickinson 公司，FACS Calibur 購自美國Becton Dickinson 公司，溶血素購自美國Becton Dickinson 公司。

1.3 統計學處理

應用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析。計數資料用例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料用±s 表示，2 組間比較采用t檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血病毒載量的檢測

54 例對照組EBV 感染率為12.96%（7/54），67 例研究組患者EBV 感染率為43.28%（29/67），2 組比較差異有統計學意義（P＜0.001）。54 例對照組HCMV 感染率為1.85%（1/54），67 例研究組患者HCMV 感染率為11.94%（8/67），2 組比較差異有統計學意義（P=0.035）。研究組EBV-DNA 載量高于對照組，差異具有統計學意義（P=0.003）。研究組HCMV-DNA 載量與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 研究組與對照組研究對象一般資料及外周血病毒載量比較

2.2 研究組EBV 感染者與非感染者的免疫激活功能比較

檢測研究組合并EBV 感染者與非感染者的免疫激活功能的差異性。將研究組患者根據EBVDNA 檢測結果分為EBV 陽性組和EBV 陰性組，比較其NEU、LYM 及T 淋巴細胞亞群水平。研究組EBV 陽性組和EBV 陰性組患者外周血NEU 與LYM 水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)。研究組EBV 陰性組與EBV 陽性組患者外周血CD3+CD4+T 淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值比較，差異有統計學意義（t=2.440，P=0.010；t=3.070，P=0.005）。研究組EBV 陰性組與EBV 陽性組患者外周血CD3+CD8+T 淋巴細胞百分率與CD16+CD56+NK 細胞百分比比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 研究組EBV 陽性組與EBV 陰性組患者NEU、LYM 及T 淋巴細胞亞群水平比較（±s）

表2 研究組EBV 陽性組與EBV 陰性組患者NEU、LYM 及T 淋巴細胞亞群水平比較（±s）

注：EBV 為EB 病毒，NEU 為中性粒細胞，LYM 為淋巴細胞，NK 細胞為自然殺傷細胞

組別EBV 陽性組EBV 陰性組t 值P 值CD16+CD56+ NK 細胞百分比(%)25.07 ± 5.90 18.30 ± 5.30 0.940 0.350例數29 38 NEU（%）47.92 ± 16.33 52.72 ± 16.95 1.080 0.351 LYM（%）39.91 ± 13.95 36.02 ± 18.30 0.790 0.627 CD3+CD4+ T 淋巴細胞百分比(%)16.67 ± 4.40 34.90 ± 5.20 2.440 0.010 CD3+CD8+ T 淋巴細胞百分比(%)33.33 ± 7.80 30.10 ± 3.60 0.450 0.650 CD4+/CD8+比值0.49 ± 0.29 0.93 ± 0.41 3.070 0.005

2.3 研究組EBV 陽性組與EBV 陰性組患者T 淋巴細胞亞群分布差異

研究組剔除明顯免疫抑制數據后（EBV 陽性組8 例），分別將CD3+CD4+T 淋巴細胞百分比與CD3+CD8+T 淋巴細胞百分比、CD4+/CD8+比值按分布等比分群，再將患者按各分群數值計量。外周血CD3+CD4+T 淋巴細胞百分比分為0～＜20%、20%～＜40%和40%～65%，研究組EBV 陰性組與EBV 陽性組CD3+CD4+淋巴細胞百分比均主要分布在20%～＜40%，2 組分布差異有統計學意義(χ2=9.269，P=0.010）。外周血CD3+CD8+T 淋巴細胞百分比分為0～＜30%、30%～＜60% 和60%～90%，研究組EBV陰性組與EBV 陽性組組間CD3+CD8+T 淋巴細胞百分比分布差異無統計學意義(χ2=0.279，P=0.870）。外周血CD4+/CD8+比值分為0～＜0.6、0.6～＜1.2 和1.2～1.8，EBV 陽性組CD4+/CD8+比值主要分布在0.6～＜1.2，差異有統計學意義(χ2=10.367，P=0.006)。見表3。

表3 研究組EBV 陰性組與EBV 陽性組患者的T 淋巴細胞亞群分布情況［例（%）］

2.4 研究組感染EBV 的病毒載量與T 淋巴細胞亞群的相關性分析

研究組感染EBV 的病毒載量與CD3+CD4+T 淋巴細胞水平無相關性（r=0.065，P＞0.05）；研究組感染EBV 的病毒載量與CD3+CD8+T 淋巴細胞水平呈正相關（r=0.399，P＜0.05）；研究組感染EBV 的病毒載量與CD4+/CD8+呈負相關（r=-0.626，P＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 EBV 病毒載量與T 淋巴細胞亞群的線性關系

表4 研究組EBV 陽性組患者EBV 病毒載量與T 淋巴細胞的相關性分析（n=21a）

3 討論

Allo-HSCT 后的IR 是影響移植相關死亡率的重要因素。免疫功能失衡將會使患者的死亡率和復發率明顯升高。據報道，一般固有免疫功能會最先恢復，而獲得性免疫功能包括細胞免疫（T 淋巴細胞）、體液免疫（B 淋巴細胞）功能的恢復，需要l～2 年的時間［13］。一般認為，移植后T 淋巴細胞功能的重建主要分如下2 個作用機制：（1）供者成熟T 淋巴細胞的短期生存及擴增；（2）供者造血早期細胞經受者胸腺重新發育出來的T 淋巴細胞［14-15］。因此T 淋巴細胞重建的過程與其本身因素有關，而胸腺發育產生的T 淋巴細胞與移植后CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞的重建密切相關。

EBV 和HCMV 是2 種常見的人類皰疹病毒。EBV 屬于γ 皰疹病毒科，病毒基因組的全部序列是一全長172 282 bp 的DNA［14］。人是EBV 的自然宿主，EBV 感染與宿主免疫狀態密切相關。EBV 通常作為一種潛伏性和亞臨床感染的狀態存在于宿主細胞中，當宿主免疫功能受到抑制時，EBV 被激活并復制。EBV 感染可引起宿主免疫狀態的一系列持續改變，直至出現嚴重的疾?。?6-17］，同樣免疫受損的宿主EBV 激活風險比普通人更高。而值得注意的是，接受allo-HSCT 術后患者的免疫功能重建與EBV 的重新激活或原發感染均有密切的關系［11］。HCMV 屬β 皰疹病毒科亞科的雙股線性DNA 病毒，是免疫受損患者的重要病原體，其感染是血液病患者的常見并發癥，也是導致患者死亡的主要原因之一［18-20］。

T 淋巴細胞亞群是預測移植后IR 程度的一個重要指標，同時大量allo-HSCT 相關報道證實［21-22］，其與人類免疫缺陷病毒感染患者相似，CD3+CD4+T淋巴細胞數目與移植后人類皰疹病毒感染率明顯相關［23-25］。本研究發現，allo-HSCT 患者感染EBV與HCMV 的陽性率高于對照組，且allo-HSCT 患者感染后EBV-DNA 的拷貝數更高，說明allo-HSCT 患者更容易感染或重新激活HCMV 和EBV。隨后對比allo-HSCT 患者中EBV 陽性與EBV 陰性的NEU和LYM 水平，差異無統計學意義，可能與allo-HSCT患者IR 過程相關。隨后對T 淋巴細胞亞群與EBV感染的相關性進行分析，發現CD3+CD4+T 淋巴細胞與CD4+/CD8+比值在allo-HSCT 的EBV 陽性患者中更低。模擬免疫功能恢復過程，研究組EBV 陰性組與EBV 陽性組CD3+CD4+淋巴細胞百分比均主要分布在20%～＜40%，差異有統計學意義(χ2=9.269，P=0.010）。EBV 陽性組CD4+/CD8+主要分布在0.6～＜1.2，差異有統計學意義(χ2=10.367，P=0.006)。惡性血液病allo-HSCT 患者感染EBV 的風險與CD3+CD4+T 淋巴細胞含量與CD4+/CD8+比值具有相關性。隨后，EBV-DNA 的載量分析發現，CD3+CD8+T 淋巴細胞與EBV-DNA 載量呈正相關，CD4+/CD8+比值與EBV-DNA 載量呈負相關，原因可能是EBV 的感染導致了CD3+CD8+T 淋巴細胞的水平升高，也是allo-HSCT 患者病毒感染后免疫失衡的表現。

本研究分析了T 淋巴細胞亞群變化來反映免疫功能的變化，探討了T 淋巴細胞亞群變化與allo-HSCT 患者EBV 感染的相關性，CD3+CD4+T 淋巴細胞為allo-HSCT 患者EBV 感染的一個重要危險因素，而allo-HSCT EBV 感染患者CD3+CD8+T 淋巴細胞含量的增多影響了allo-HSCT 患者免疫系統的重建，進一步加重病毒感染的allo-HSCT 患者免疫功能失衡。同時CD4+/CD8+比值在預測EBV 感染和病毒載量中起著關鍵的作用。因此，建議allo-HSCT 患者在免疫功能恢復過程中，需要同時監測病毒感染狀態和免疫功能的變化。本研究仍有一些不確定因素的存在。檢測外周血單個核細胞中的EBV-DNA 比EBV 抗體的檢測更有助于診斷EBV 的感染，但部分EBV 攜帶者的外周血單個核細胞可以檢測到低拷貝數的EBV-DNA，因很難區分EBV 的感染狀態，所以低拷貝數的EBV-DNA 并沒有加入到EBV 陽性的分組中。此外，受本研究樣本量的限制，統計分析的偏差可能較大。且未進一步對HCMV 感染allo-HSCT 患者的T 淋巴細胞亞群進行分析，后續會對這一部分進行研究。