環狀RNA ciRS-7在結直腸癌中的表達變化及其與患者臨床病理特征和預后關系研究

王忠瑜,季艷霞,趙艷爭,張偉光,楊慧敏

(邯鄲市中心醫院,河北 邯鄲 056008)

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)全球病死率和發病率分別位居惡性腫瘤的第二位和第三位[1-2]。我國CRC病死率和發病率在惡性腫瘤中均位居第五位,且發病率逐年上升[3-5]。近年來,CRC的診治取得了很大進展,但CRC患者預后仍不理想。發達國家患者5年生存率約65%,欠發達國家5年生存率不足50%[6-8]。因此,尋找可以預測CRC患病風險、癌癥進展及預后的生物標志物對于CRC早期診斷、病情進展監測及治療方案調整具有非常重要的意義。環狀RNA是一類普遍存在于哺乳動物中的具有穩定閉合環狀結構的非編碼RNA,通過調控靶基因轉錄、沉默微小RNA(microRNA,miR)或直接與蛋白結合等方式來廣泛參與多種生理及病理活動[9-11]。環狀RNA ciRS-7因靶向結合miR-7而得名,通過與miR-7競爭性結合上調miR-7靶基因,如血管表皮生長因子受體和G1/S特異性細胞周期蛋白E1,從而廣泛參與多種癌癥的病理活動。已證實ciRS-7在食管癌、非小細胞肺癌、胃癌等患者中高表達且與患者預后呈顯著負相關[12-15]。然而,ciRS-7在CRC發生和發展中的作用鮮有研究報道。因此,本研究探討ciRS-7在CRC患者中的表達變化及其與患者臨床病理特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究前瞻性納入2019年1月至2020年12月接受手術治療的CRC患者120例。病例納入標準:經術后病理學檢查確診為原發性CRC;年齡≥18周歲;無遠端轉移;接受定期隨訪;患者及家屬對本研究知情同意。排除標準:接受新輔助治療;合并其他惡性腫瘤;孕婦或哺乳期婦女。入組患者中,男性66例,女性54例;平均年齡(66.04±11.87)歲;高分化18例,中分化84例,低分化18例;腫瘤直徑5.02[3.96,5.53] cm;T1期6例,T2期17例,T3期95例,T4期2例;N0期71例,N1期32例,N2期17例;TNM Ⅰ期18例,Ⅱ期52例,Ⅲ期50例。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 定量聚合酶鏈式反應(qPCR)檢測組織ciRS-7表達:通過手術獲取患者癌組織和癌旁組織,液氮急凍后于-80 ℃保存。取凍存的組織樣本在研缽中加液氮充分研磨,加入TRIzol 試劑依據說明書提取總RNA。使用Nanodrop檢測濃度和純度,RNase R消化線性RNA。采用反轉錄試劑盒(批號:RR047A,中國大連寶生物工程有限公司)將RNA反轉錄為cDNA,反應條件為42 ℃ 60 min、98 ℃ 5 min。隨后以反轉錄產物為模板,使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(批號:RR003A,中國大連寶生物工程有限公司)和ABI 7900熒光定量聚合酶鏈式反應儀進行實時熒光定量PCR,反應條件:95 ℃預變性10 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共循環40次。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法分析患者癌組織和癌旁組織中ciRS-7相對表達量。ciRS-7正向引物序列為5’-CTTGACACAGGTGCCATC-3’,反向引物序列為5’-ACGTCTC-CAGTGTGCTGA-3’。GAPDH正向引物序列為5’-TGACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,反向引物序列為5’-GCCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’。

1.2.2 隨訪:所有患者隨訪至2022年11月30日,中位隨訪時間30.5個月?？傮w生存期(OS)定義為患者從開始手術治療到最終病死的時間。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件分析數據。不符合正態分布的計量資料以M[P25,P75]表示,癌和癌旁組織ciRS-7相對表達量比較采用Wilcoxon符號秩檢驗;ciRS-7與患者臨床病理特征的關系采用Mann-WhitneyU或Kruskal-WallisH秩和檢驗;繪制Kaplan-Meier曲線并采用Log-Rank檢驗分析ciRS-7高低表達水平與患者OS的關系;采用Cox回歸分析CRC患者OS的影響因素;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 癌組織與癌旁組織ciRS-7表達水平比較 癌組織中ciRS-7表達水平為2.80[1.78,4.27],癌旁組織中為0.88[0.27,1.52]。癌組織中ciRS-7表達水平高于癌旁組織(Z=-5.073,P<0.001)。

2.2 ciRS-7表達水平與患者不同臨床病理特征的關系 見表1。ciRS-7表達水平與腫瘤直徑、T分期、N分期、TNM分期有關(均P<0.001)。

表1 ciRS-7表達水平與患者不同臨床病理特征比較

2.3 ciRS-7不同表達水平與患者OS的關系 見圖1。ciRS-7低表達患者中位OS為41.0個月(95%CI:39.0～43.0個月),ciRS-7高表達患者中位OS為37.0個月(95%CI:33.8～40.2個月)。Kaplan-Meier曲線和Log-Rank檢驗結果顯示,ciRS-7表達水平與患者OS呈負相關(P=0.001)。

圖1 ciRS-7相對表達量與患者OS的關系

2.4 影響患者OS的單因素Cox回歸分析 見表2。以患者OS為因變量(OS>41.0個月=0,OS≤41.0個月=1),以ciRS-7表達(高表達=1,低表達=0)、年齡(≥60歲=1,<60歲=0)、性別(男性=1,女性=0)、病理分化等級(低/中分化=1,高分化=0)、腫瘤直徑(≥5 cm=1,<5 cm=0)、T分期(T3、T4期=1,T1、T2期=0)、N分期(N1、N2期=1,N0期=0)、TNM分期(Ⅲ期=1,Ⅰ-Ⅱ期=0)為自變量行單因素Cox回歸分析。結果顯示,ciRS-7表達水平、病理分化等級、腫瘤直徑、T分期、N分期、TNM分期與患者OS有關。

表2 影響患者OS的單因素Cox回歸分析

2.5 影響患者OS的多因素Cox回歸分析 見表3。以單因素分析中具有統計學意義的指標作為自變量(賦值相同),以患者OS為因變量,進行多因素Cox回歸分析。結果顯示,ciRS-7高表達、病理低/中分化、T3和T4分期是患者OS的獨立危險因素(均P<0.05)。

表3 影響患者OS的多因素Cox回歸分析

3 討 論

ciRS-7在多種癌癥中高表達并通過各種機制參與癌癥病理過程,加重癌癥進展[16-20]。有研究[21]發現,ciRS-7在年齡小于40歲,甲胎蛋白水平高于400 ng/μl或出現微血管侵犯的肝細胞癌患者中的表達水平顯著升高,可以作為出現微血管侵犯的獨立預測因素,表明ciRS-7表達水平與肝細胞癌疾病進展顯著正相關;同時,在出現微血管侵犯的肝細胞癌組織中,ciRS-7表達水平與miR-7表達水平顯著負相關而與miR-7靶基因PIK3CD和p70S6K表達水平顯著正相關。ciRS-7也被發現在非小細胞肺癌患者癌組織中顯著高表達且與患者TNM分期和淋巴結轉移數成正比,表明ciRS-7與肺癌疾病進展正相關[13]。在另一個研究[12]中,ciRS-7在食管癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織,細胞實驗表明ciRS-7可以促進食管癌細胞(KYSE150細胞系和Eca9706細胞系)的轉移和侵襲,而加入核因子(NF)-κB拮抗劑BAY 11-7082可以抑制ciRS-7介導的食管癌細胞侵襲。此外,ciRS-7在乳腺癌細胞(MDA-MB-453細胞系)中表達顯著上調,而下調ciRS-7表達則抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲。進一步研究[22]表明乳腺癌組織中ciRS-7表達水平和miR-1299表達水平顯著負相關,且上調miR-1299表達可以抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。以上研究表明ciRS-7可能通過抑制miR-7功能、NF-κB通路或miR-1299功能來參與多種癌癥病理活動并和癌癥進展正相關,然而ciRS-7與CRC的關系鮮有報道。

本研究發現,ciRS-7表達水平在CRC患者癌組織中顯著升高并與患者腫瘤直徑,T分期,N分期和TNM分期有關,提示ciRS-7表達水平與CRC患者癌癥進展有關。分析可能原因,文獻報道miR-7可以通過調控表皮生長因子受體信號通路和NF-κB信號通路等來誘導包括CRC細胞在內的多種癌細胞凋亡。而ciRS-7作為miR-7的內源競爭RNA(ceRNA)能夠阻斷miR-7的抑癌功能從而促進多種癌細胞的增殖、轉移和侵襲。因此ciRS-7可能通過抑制miR-7促進CRC細胞的增殖、轉移和侵襲,促進癌癥的發生和發展。miR-1299能夠通過信號轉導與轉錄活化因子通路抑制CRC細胞的增殖,ciRS-7可能通過抑制CRC細胞中miR-1299的正常功能從而促進CRC細胞的增殖進而加重CRC癌癥進展[23]。ciRS-7還有可能通過其他機制如和下游mRNA的3’非翻譯區結合或直接和RNA結合蛋白相互作用從而參與CRC病理過程,然而這一假設需進一步深入研究[24]。

本研究發現,ciRS-7表達水平與CRC患者OS顯著負相關,ciRS-7高表達是患者OS的獨立危險因素。這與之前已報道的ciRS-7表達水平與其他癌癥患者OS相關的結果一致。在非小細胞肺癌患者中,ciRS-7表達水平與患者OS顯著負相關,且其可作為患者不良預后的獨立預測因素[12]。在胃癌患者中,ciRS-7高表達者其OS顯著低于ciRS-7低表達者,且ciRS-7高表達是胃癌患者不良預后的獨立預測因素[14]。在肝細胞癌患者中,ciRS-7表達水平與患者無病生存期(DFS)負相關[20]。在食管癌患者中,ciRS-7高表達患者其DFS和OS均顯著低于ciRS-7低表達患者[25]。ciRS-7表達水平和CRC患者OS顯著負相關并可以作為患者更短OS的獨立預測因素,可能與ciRS-7作為抗癌基因(如miR-7、miR-1299)的ceRNA來抑制其介導的抑癌作用,從而促進CRC細胞增殖、轉移和侵襲。因此,上調ciRS-7表達水平將促進癌癥進展,縮短患者OS。

綜上所述,ciRS-7在CRC患者中高表達,與癌癥進展和不良預后有關,ciRS-7高表達是患者OS的獨立危險因素。本研究仍存在不足:樣本量較少有可能降低統計效能;只探討了ciRS-7與CRC患者癌癥進展與預后的關系,而ciRS-7影響CRC患者癌癥進展與預后的分子生物學機制還有待進一步研究。