生物3D 打印丹酚酸B-海藻酸鈉-明膠皮膚支架促進糖尿病大鼠創面愈合

秦立昊，李靜燕，張嘉偉，柏益飛，劉婷婷，唐蟄雨，薛同慶，賈中芝*

1南京醫科大學附屬常州第二人民醫院介入血管科，江蘇 常州 213003；2大連醫科大學研究生院，遼寧 大連 116044；3淮安市淮安醫院（淮安市腫瘤醫院）疼痛與介入血管外科，江蘇 淮安 223000

糖尿病潰瘍創面是臨床上常見的慢性病，其創面修復已經成為臨床棘手的難題［1-2］。丹酚酸B（salvianolic acid B，SAB）的化學式為C36H30O16，主要是從丹參的根及枝干中提取的活性物質，具有抗氧化、抗炎、抗細胞凋亡等功能［3］。研究證實SAB在糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變的防治中發揮著重要作用［4-5］。近年來，生物3D 打印技術逐漸用于制備人工皮膚［6-8］。目前，尚無使用SAB作為生物墨水制備人工皮膚支架的報道。

本研究首次使用SAB 作為生物墨水，與海藻酸鈉、明膠混合制備人工皮膚支架，并通過動物實驗，探討SAB-海藻酸鈉-明膠皮膚支架對糖尿病大鼠創面的治療作用，以期為糖尿病潰瘍創面的修復提供一種可供選擇的人工皮膚支架。

1 材料和方法

1.1 材料

SAB、明膠（100G強度）、海藻酸鈉（上海麥克林公司），SD大鼠（蘇州敬微宇生物科技公司），鏈脲佐菌素（MedChemExpress 公司，美國），高糖高脂大鼠飼料（南京協同生物公司），4%中性緩沖福爾馬林固定液（廣州維格斯生物公司），蘇木素染液、中性樹膠、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色試劑、組織自發熒光淬滅劑、抗熒光淬滅封片劑、HE 染液套裝、Masson 染液套裝、環保型脫蠟液、通用型組織固定液、雙硫鍵還原檢測法蛋白定量檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（武漢賽維爾公司），二甲苯（上海國藥集團化學試劑有限公司），活性氧（reactive oxygen species，ROS）染液（上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）測試盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒（南京建成有限公司）。

3D 生物打印機（RegenHU 公司，瑞士），透皮擴散儀（上海邦億公司），血糖儀（ContourTS 公司，德國），光學顯微鏡（Olympus公司，日本），自動組織脫水機、PBM-B 型包埋機和包埋冷臺（常州普瑞斯星醫療器械公司），徠卡輪轉切片機（Leica 公司，德國），病理組織漂烘儀（常州中威電子儀器公司），組織攤片機（金華科迪儀器設備有限公司），動物實驗手術器械盒（上海醫療儀器有限公司），酶標檢測儀（BioTeK公司，英國），臺式高速冷凍離心機（北京大龍公司），高速組織研磨儀、渦旋混合器（武漢賽維爾公司）。

動物實驗經南京醫科大學附屬蘇州第二人民醫院動物倫理委員會審批通過（［2022］KY120-01）。

1.2 方法

1.2.1 皮膚支架的制備

將一定量的SAB 溶于10 mL 去離子水，并加入裝有0.4 g 海藻酸鈉粉末及1.0 g 明膠顆粒的燒杯中，置于40 ℃水浴中攪拌30 min；按SAB 占海藻酸鈉與明膠總重的百分比制成0%、0.5%、1.0%、1.5%的生物墨水。

使用RegenHU 3D 打印機，將以上制備的生物墨水加入熱熔擠壓式針筒中，加熱至40 ℃并保持恒溫，氣壓0.25 MPa，針尖距離接收板1 mm，打印速度5 mm/s，針頭25 G，按照1.2 cm×1.2 cm 打印4 層，間距0.8 mm，最終制備出SAB含量為0%、0.5%、1.0%、1.5%的SAB-海藻酸鈉-明膠皮膚支架。掃描電鏡觀察支架形貌。

1.2.2 皮膚支架的藥物釋放

將含有不同含量SAB 的皮膚支架浸泡在37 ℃5 mL 的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，100 r/min 間斷振蕩。在多個時間點（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、24.0、48.0、72.0 h）收集混合溶液，采用高效液相色譜法對SAB 進行定量分析。根據上海麥克林公司的SAB標準參考品（99.0%）計算SAB的累積釋放量。

1.2.3 糖尿病大鼠模型的構建

SPF 級雄性SD 大鼠，8 周齡，體重約150 g。高糖高脂飼料誘導喂養4周，一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素30 mg/kg（0.1 mol/L 檸檬酸緩沖液配制，pH 4.5）。用藥72 h后，自大鼠尾緣靜脈微量采血檢測隨機血糖，若血糖值>16.7 mmol/L，則視為2 型糖尿病大鼠造模成功。

1.2.4 動物分組及干預

36只2 型糖尿病大鼠隨機分為6組（每組6只）：空白對照組、凡士林紗布組以及皮膚支架組（0%SAB、0.5%SAB、1.0%SAB、1.5%SAB組）。大鼠采用1%戊巴比妥鈉麻醉，備皮，使用無菌手術刀在大鼠背部皮膚上切出邊長為0.8 cm 的正方形，深度達肌層?？瞻讓φ战M創面不采取任何處理，僅用無菌紗布包扎，凡士林紗布組采用凡士林紗布覆蓋創面，其余各組以含不同比例SAB的皮膚支架覆蓋創面。于第7、14天觀察創面愈合、滲出等情況，并拍照記錄，判斷創面恢復情況。

1.2.5 組織學檢查及氧化應激水平檢測

第7、14 天時，分別隨機處死3 只大鼠，獲取組織標本，包括創面及創面周圍組織。采用ROS熒光染色，抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT 及氧化應激產物MDA 檢測評估創面氧化應激水平；HE 染色觀察創面修復情況及肉芽組織的生長情況；Masson染色觀察創面膠原蛋白沉積情況。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數據分析及作圖。符合正態分布的數據采用均數±標準差（±s）表示。兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組樣本均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組之間的兩兩比較采用SNK 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 皮膚支架的形貌

肉眼觀：4 個不同含量SAB 組的皮膚支架均呈網格狀，孔徑均勻（圖1A）；掃描電鏡：4個不同含量SAB 組皮膚支架均為多孔網狀立體結構，孔隙均勻（圖1B）。

2.2 皮膚支架的體外藥物釋放

各組SAB 累積釋放量均隨釋放時間延長逐漸增加，其中1.5%SAB 組皮膚支架在各個時間點的SAB釋放量均高于其他3組（圖2）。

圖2 不同規格SAB-海藻酸鈉-明膠皮膚支架的SAB體外釋放曲線Figure 2 In vitro release curves of SAB-sodium alginategelatin skin scaffolds with different specifications

2.3 創面修復

創面修復趨勢及創面面積定量分析（圖3）可見，第7天時，各組創面均無明顯滲出，0.5%SAB組、1.0%SAB 組、1.5%SAB 組可見創面結痂，0.5%SAB組、1.0%SAB組的創面面積小于其他組（P<0.05）；第14 天時，各組創面面積均縮小，0.5%SAB 組、1.0%SAB 組的創面面積小于其他組（P<0.05），其中1.0%SAB組的創面愈合最好。

圖3 在第7、14天時各組創面修復大體觀及創面面積定量分析Figure 3 General view of wound repair and quantitative analysis of wound area in each group on day 7 and 14

2.4 創面組織ROS表達水平

在第7、14 天時，各組創面組織均有ROS 表達（圖4）；對各組ROS 的表達水平進行定量分析（圖5）。第7天時，1.0%SAB組ROS表達水平顯著低于其他組（P<0.001）；第14天時，1.0%SAB組ROS表達水平顯著低于空白對照組、凡士林紗布組、0%SAB組及0.5% SAB 組（P<0.01），1.0%SAB 組和1.5%SAB 組ROS表達水平差異無統計學意義（P=0.136）。

圖4 各組創面組織在第7、14天時ROS的表達水平Figure 4 The levels of ROS in the wound tissue of each group on day 7 and 14

圖5 各組大鼠創面組織ROS表達水平的定量分析Figure 5 Quantitative analysis of ROS levels in rat wound tissue of each group

2.5 創面組織SOD、GSH-PX、CAT 及MDA 的表達水平

第7、14 天時，各組創面組織均有SOD、GSHPX、CAT及MDA的表達（圖6）。第7天時，1.0%SAB組SOD、GSH-PX 及CAT 表達水平均高于其他組（P<0.05，圖6A、C、E），MDA水平低于空白對照組、凡士林紗布組及0%SAB 組（圖6G）；第14 天時，1.0%SAB 組SOD、GSH-PX 及CAT 表達水平均高于空白對照組、凡士林紗布組及0%SAB 組（P<0.05，圖6B、D、F），MDA 表達水平低于空白對照組、凡士林紗布組（P<0.05，圖6H）。

圖6 第7、14天時各組大鼠創面組織SOD、GSH-PX、CAT及MDA的表達水平Figure 6 The expression levels of SOD，GSH-PX，CAT and MDA in rat wound tissues of each group on day 7 and 14

2.6 創面修復的組織學形態

HE 染色結果顯示，第7 天時，各組創面組織修復尚可，未見明顯組織壞死，創緣可見大量炎癥細胞浸潤；第14天時，各組創面進一步修復，創緣可見結痂并出現新生肉芽組織，其中1.0%SAB組新生肉芽組織較多，各組創緣及新生肉芽組織內見大量炎癥細胞浸潤（圖7）。

Masson染色結果顯示，第7天時，各組創面均有膠原纖維沉積，但排列松散稀疏，0.5%SAB組、1.0%SAB 組、1.5%SAB 組膠原纖維沉積多于其他組（P<0.05，圖8）；第14 天時，各組膠原沉積充分，排列整齊致密，膠原纖維束變粗，部分相互交織形成網狀結構，0.5%SAB 組、1.0%SAB 組、1.5%SAB 組膠原纖維沉積高于其他組（P<0.05，圖8）。

圖8 第7、14天時各組創面膠原纖維沉積情況Figure 8 The deposition of collagen fibers on the wound tissues of each group on day 7 and 14

3 討論

近年來，糖尿病潰瘍創面的治療已經成為臨床面臨的巨大挑戰，創面敷料是創面管理的重要組成部分［9-15］。隨著生物3D 打印技術的快速發展，可以通過該技術獲得個性化的人工皮膚支架，不但可以提供利于細胞黏附及組織再生的微環境，而且支架的三維結構有利于細胞獲得足夠的氧氣和營養物質，生物3D打印皮膚支架作為糖尿病潰瘍創面的暫時性敷料具有明顯優勢。生物墨水的制備是生物3D 打印皮膚支架的關鍵，以海藻酸鈉-明膠為生物墨水的人工皮膚支架具有體內外生物相容性［16］。SAB 是丹參的水溶性成分之一，具有抗氧化、抗炎、神經保護、抗纖維化等作用［17-18］。本研究在海藻酸鈉-明膠基礎上成功制備了不同SAB 含量的SAB-海藻酸鈉-明膠皮膚支架，并在動物實驗中探討了其治療糖尿病創面的療效。

高血糖狀態導致ROS在創面組織集聚，并且抑制抗氧化酶［19］，氧化還原穩態失衡導致創面愈合變緩。SAB可以提供氫原子以發揮強大的抗氧化作用，并且具有一定的自由基清除能力［20］。此外，SAB可以上調各種抗氧化酶如SOD、GSH-PX的表達［20］。本研究發現1.0%SAB 組皮膚支架具有較強的抗氧化能力，7 d及14 d的ROS及MDA水平低于其他組，并且SOD、GSH-PX、CAT 水平顯著高于其他組。這說明1.0%SAB支架能抑制氧化應激引起的ROS 增多，可以顯著改善糖尿病創面的氧化應激反應。此外本研究還發現1.5%SAB 支架抗氧化能力低于1.0%SAB，這可能是因為SAB 的藥理學作用與其濃度有關，因此篩選出最佳濃度來發揮SAB促進創面愈合的作用至關重要［21-22］。

膠原蛋白沉積在促進糖尿病潰瘍創面的修復過程中發揮著重要作用。膠原蛋白可以維持新生肉芽組織的彈性及強度，為創面修復創造一個良好的環境，因此，膠原蛋白沉積直接影響糖尿病足潰瘍創面修復的進程［21］。一項分析SAB 濃度對細胞膠原蛋白合成影響的研究發現，SAB 在所有測試濃度下都能刺激膠原蛋白的合成，提示SAB具有較強的促進膠原蛋白合成的能力［22］。也有研究證明SAB能抑制肝臟或心肌的病理性纖維化，從而抑制Ⅲ型膠原的合成，這表明SAB在生理和病理生理過程中對膠原蛋白的合成具有不同的作用［22］。本研究發現第7、14天時，0.5%、1.0%、1.5%SAB組的皮膚支架促進膠原蛋白沉積的效果優于其他各組，提示SAB-海藻酸鈉-明膠皮膚支架能促進膠原沉積，加速創面愈合。

本研究發現1.0%SAB組支架促進創面愈合的效果最佳，可能與SAB存在一定毒性有關。有研究表明SAB 促進創面愈合最有效的濃度為25 μg/mL，而75 μg/mL SAB抑制創面愈合［21］。其原因為75 μg/mL SAB抑制了促細胞遷移的蛋白酶、細胞因子的分泌，影響細胞增殖，從而阻礙了創面中新生組織的生長，創面愈合能力也因此下降［22］。本研究顯示，1.0%SAB 組支架促進創面愈合的能力和抗氧化作用優于高劑量的1.5%SAB組支架。一方面，可能由于1.5%SAB抑制細胞遷移及增殖而愈合效果較差；另一方面，抗氧化劑的作用并不是隨著劑量的增加而增加，例如低劑量的維生素具有抗氧化作用，而高劑量的維生素C 則會產生氧化作用，損害細胞［23］。相關研究也表明，SAB 在低劑量時可通過抑制ROS 產生發揮抗氧化作用，在高劑量時可通過促進ROS產生促進氧化損傷［24-26］。因此1.0%SAB組支架抗氧化性能最佳，ROS 水平最低，進一步促進了創面的愈合。

本研究尚有以下不足之處：①僅進行了體內驗證，未進行體外實驗研究，下一步將進行細胞實驗，從細胞層面證明其作用；②仍需進一步研究各實驗組皮膚支架的體外時間-降解曲線；③本研究并未對相關機制進行探討，后續將對相關信號通路開展研究。

綜上，本研究采用生物3D打印技術成功制備了SAB-海藻酸鈉-明膠皮膚支架，并初步驗證了含有1.0%SAB的SAB-海藻酸鈉-明膠皮膚支架促進創面修復的作用較為理想，其在第7、14天時不但可以抑制ROS 的產生，上調各種抗氧化酶的表達，抑制創面組織內氧化應激反應，還可以促進膠原沉積，最終促進糖尿病大鼠創面的修復，有望成為一種理想的糖尿病潰瘍創面修復的生物皮膚支架。

致謝：

感謝3D 打印與再生醫學研究室趙紅斌教授為本課題的順利實施提供的幫助。