神經肽Y/Y1受體激活β-catenin信號通路介導心肌細胞損傷

胡 君，戴 麗，陳 霞，任志欣，錢炳俊

江蘇醫藥職業學院公共衛生與管理學院，江蘇 鹽城 224005

近年來，心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）的發病率顯著增加并呈年輕化趨勢，嚴重威脅著人類的生命健康。SCD本質上表現為心臟電傳導功能紊亂，多發生于有心臟基礎病變的心肌病患者，如心肌肥厚、冠心病、心肌梗死等。這些疾病造成患者的心肌細胞發生不同程度的損傷，是猝死發生的物質基礎［1-2］。了解心肌細胞損傷的誘因并探討其相應的分子機制，對于心肌疾病的精準診療以及預防SCD猝死具有重要意義。

神經肽Y（neuropeptide Y，NPY）是1 種由36 個氨基酸組成的小分子多肽，是心肌組織中含量最豐富的神經肽類物質。心肌梗死、心衰等發生時，血清和心肌組織中NPY表達均顯著增加［3］。然而NPY在心肌細胞中的功能目前沒有統一的認識。研究發現NPY高表達對心血管系統具有損傷作用，可進一步引發高血壓和心肌肥厚［4］；敲除NPY可有效緩解缺血誘導的心肌細胞凋亡和功能障礙［5］。然而也有研究認為，缺乏NPY的急性心肌缺血小鼠表現出更嚴重的進行性心肌炎癥和心肌纖維化［6］，提示NPY高表達可能是機體的一種反饋保護機制。因此深入探討不同狀態下NPY 對心肌細胞的作用及相應機制具有重要意義。

目前已發現的NPY作用受體有8種亞型。激活細胞表面不同亞型的受體可產生不同的生物學效應。Y1 受體是心肌細胞表面主要的表達亞型。高血壓大鼠心肌組織Y1受體表達增加，參與調節心肌細胞的能量生成［7］。NPY 通過Y1 受體可促進內皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖和遷移。然而NPY/Y1受體信號轉導是否參與β腎上腺素受體持續激活誘導心肌損傷目前尚未可知。經典Wnt/β-catenin信號通路在細胞生長、增殖、遷移以及凋亡等過程中扮演重要角色。糖尿病性心肌病中，心肌組織糖原合成酶激酶3β（glycogen synthesis kinase 3β，GSK3β）mRNA 下降，p-GSK3β增加，誘導細胞質中β-catenin入核，啟動下游靶基因表達，導致細胞凋亡［8］。NPY是否影響心肌細胞中經典Wnt信號通路未見相關報道?；诖?，本研究建立異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）誘導的小鼠心肌損傷模型和Y1 受體特異性激活劑［Leu31，Pro34］-NPY 誘導的H9C2 細胞模型，探討NPY/Y1 受體信號轉導是否通過β-catenin信號通路誘導心肌細胞損傷。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

4周齡雄性小鼠隨機分成4組，包括對照組、ISO組、BIBO3304+ISO組、BIBO3304組，每組10只。對照組皮下注射生理鹽水；ISO組皮下注射20 mg/（kg·d）ISO；BIBO3304+ISO 組腹腔注射0.1 mg/（kg·d）BIBO3304，30 min 后皮下注射20 mg/（kg·d）ISO；BIBO3304 組腹腔注射0.1 mg/（kg·d）BIBO3304，所有組連續給藥14 d。

1.2.2 HE和Masson染色

收集各組小鼠心肌組織置于4%多聚甲醛中固定過夜，用梯度乙醇進行脫水處理、石蠟包埋、切片（5 μm），最后置70 ℃烘箱烤片2.5 h，HE染色觀察心肌纖維形態結構；Masson染色觀察心肌纖維化程度。

1.2.3 細胞培養

H9C2細胞接種于6孔培養板上，用含10%胎牛血清的L-DMEM 培養24 h后，無血清L-DMEM 饑餓處理過夜，用不同濃度（0、10、100 nmol/L）［Leu31，Pro34］-NPY處理細胞24 h或48 h后進行相應的實驗。

1.2.4 熒光定量PCR

TRIzol 法提取細胞樣品中的總RNA，采用反轉錄試劑合成cDNA。Real-time RT-PCR 檢測心肌組織中NPY 和細胞中肥大基因心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）mRNA 表達，以GAPDH 作為內參。具體引物序列見表1。

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表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達

心肌組織或細胞樣品中加入PIPA 裂解液（含1 mmol/L 蛋白酶抑制劑和1 mmol/L 磷酸化酶抑制劑）提取心肌或細胞的總蛋白。蛋白定量后與上樣緩沖液混合，金屬浴煮沸5 min變性，之后進行SDSPAGE電泳分離?？焖贊褶D將蛋白轉移到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗（NPY，1∶1 000稀釋；p-GSK3β，1∶1 000 稀釋；t-GSK3β，1∶1 000 稀釋；active β-catenin，1∶1 000稀釋；GAPDH，1∶5 000稀釋），4 ℃搖床孵育過夜。TBST 清洗3 次，每次10 min。之后加入HRP-標記的二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次，每次10 min。ECL 顯影，Image J軟件對蛋白灰度值進行定量分析。

1.2.6 CCK-8法檢測H9C2細胞活力

H9C2 細胞以6×104個/mL 接種至96 孔培養板上，24 h后細胞饑餓過夜，分別加入不同濃度（0、10、100 nmol/L）的［Leu31，Pro34］-NPY 處理細胞48 h。之后向每孔中加入10 μL CCK-8 工作液，37 ℃培養箱內孵育2 h。用酶標儀檢測450 nm處每孔的吸光度值，并計算心肌細胞活力。

1.2.7 免疫熒光染色

H9C2 細胞以1×105個/mL 密度接種至24 孔板中，24 h 后細胞饑餓過夜。Y1 受體特異性拮抗劑BIBO3304（1 μmol/L）或β-catenin特異性抑制劑ICG001（1 μmol/L）預處理細胞30 min 后，用100 nmol/L［Leu31，Pro34］-NPY 處理細胞。4%多聚甲醛固定細胞，PBS清洗3次。0.2%TritonX-100處理30 min，PBS 清洗3 次。3%BSA 封閉細胞60 min，PBS 清洗3 次。細胞骨架染色：加入Actin-Tracker Red-555 4 ℃過夜后滴加DAPI 染細胞核10 min，PBS 清洗3 次，熒光顯微鏡觀察拍照。β-catenin 入核檢測：孵育β-catenin 一抗4°C 過夜，PBS 清洗3 次后加入AF488 標記的抗兔二抗（1∶100 稀釋），室溫下孵育2 h；滴加DAPI染細胞核10 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡觀察拍照。采用Image J 軟件對細胞面積進行定量分析。

1.3 統計學方法

數據結果采用GraphPad Prism 7軟件進行處理。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗；多組間數據比較采用單因素方差分析。兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ISO組小鼠心肌組織NPY水平增加

與對照組相比，ISO組小鼠皮下注射20 mg/（kg·d）ISO 14 d 后，心肌組織中NPY mRNA 和蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05，圖1）。

圖1 小鼠心肌組織中NPY mRNA和蛋白表達Figure 1 Expression of NPY mRNA and protein in myocardial tissue of mice

2.2 BIBO3304緩解ISO誘導的心肌損傷和纖維化

對照組小鼠皮下注射生理鹽水2 周后，心肌纖維沒有出現明顯損傷，心肌細胞排列整齊，纖維結構清晰，無明顯纖維化。與對照組相比，ISO 組小鼠心肌組織HE 染色出現明顯的心肌細胞壞死、心肌細胞溶解；Masson 染色顯示心肌組織膠原沉積明顯增加，并向周圍間質延伸。與ISO 組相比，BIBO3304+ISO組心肌細胞損傷有所緩解，心肌組織膠原沉積明顯減少。與對照組相比，BIBO3304組小鼠心肌纖維結構和心肌膠原沉積程度無明顯改變（圖2A、B）。與對照組相比，ISO組小鼠心肌肥大基因ANP、β-MHC mRNA 表達顯著增加；與ISO 組相比，BIBO3304+ISO 組小鼠ANP、β-MHC mRNA 表達降低（P<0.01）。與對照組相比，BIBO3304 組小鼠ANP、β-MHC mRNA表達無明顯變化（圖2C、D）。

圖2 BIBO3304緩解ISO誘導的心肌損傷和纖維化Figure 2 BIBO3304 alleviated ISO-induced myocardial injury and fibrosis

2.3 ［Leu31，Pro34］-NPY誘導H9C2心肌細胞損傷

為探索NPY/Y1受體對心肌細胞的直接生物學效應，用不同濃度（0、10、100 nmol/L）的Y1受體特異性激活劑［Leu31，Pro34］-NPY 處理H9C2細胞24 h，定量PCR 結果顯示心肌肥大基因ANP、β-MHC mRNA 表達顯著增加（P<0.01，圖3A、B）。CCK-8檢測發現，［Leu31，Pro34］-NPY 處理H9C2 細胞48 h后細胞活力明顯下降（P<0.01），呈現劑量依賴效應（圖3C）。

圖3 ［Leu31，Pro34］-NPY誘導H9C2細胞損傷Figure 3 ［Leu31，Pro34］-NPY induced injury of H9C2 cells

2.4 BIBO3304 緩解ISO 誘導激活的β-catenin 信號通路

與對照組相比，ISO組p-GSK3β、active β-catenin表達增加，p-GSK3β/t-GSK3β比值增加，提示β-catenin信號通路激活。與ISO 組相比，BIBO3304+ISO組active β-catenin 和p-GSK3β/t-GSK3β表達顯著下降（P<0.05）。BIBO3304 組與對照組相比，active βcatenin和p-GSK3β/t-GSK3β表達差異無統計學意義（圖4）。

圖4 BIBO3304抑制ISO誘導的β-catenin信號通路蛋白表達Figure 4 BIBO3304 inhibited ISO-induced protein expressions of β-catenin pathway

2.5 ［Leu31，Pro34］-NPY激活β-catenin信號通路

與對照組相比，Y1 受體激動劑［Leu31，Pro34］-NPY 增加active β-catenin、p-GSK3β表達，active βcatenin/GAPDH、p-GSK3β/t-GSK3β比值增加（P<0.05，圖5A～C），提示β-catenin信號通路激活。與對照組相比，［Leu31，Pro34］-NPY促進細胞核β-catenin增加；與［Leu31，Pro34］-NPY 組相比，BIBO3304 抑制細胞核β-catenin積累（圖5D）。

圖5 ［Leu31，Pro34］-NPY激活H9C2細胞的β-catenin信號通路Figure 5 ［Leu31，Pro34］-NPY activated the β-catenin pathway in H9C2 cells

2.6 抑制β-catenin 信號通路緩解［Leu31，Pro34］-NPY誘導的H9C2細胞損傷

與［Leu31，Pro34］-NPY 組相比，ICG001 顯著抑制［Leu31，Pro34］-NPY 誘導的H9C2 細胞心肌肥大基因ANP、β-MHC mRNA 表達上升（P<0.05）和細胞面積增加（P<0.01），緩解心肌細胞活力下降（P<0.01，圖6）。

圖6 ICG001緩解［Leu31，Pro34］-NPY誘導的H9C2細胞損傷Figure 6 ICG001 alleviated cell injury induced by［Leu31，Pro34］-NPY in H9C2 cells

3 討論

本研究構建ISO 誘導的小鼠心肌損傷模型和［Leu31，Pro34］-NPY 誘導的H9C2 細胞模型，探索NPY/Y1 受體信號轉導在心肌損傷中的作用及機制。結果顯示：ISO 誘導小鼠心肌組織NPY mRNA和蛋白表達增加、心肌細胞損傷和心肌纖維化，特異性拮抗Y1受體可有效緩解ISO誘導的心肌損傷、纖維化以及心肌肥大基因表達；體外實驗證實特異性激活Y1 受體增加心肌肥大基因表達和心肌細胞面積，降低心肌細胞活力。體內外實驗均表明NPY通過Y1 受體轉導可促進心肌細胞GSK3β磷酸化，增加細胞內active β-catenin 表達；拮抗Y1受體信號轉導可有效抑制ISO 誘導的心肌組織p-GSK3β和active β-catenin表達增加。［Leu31，Pro34］-NPY促進H9C2細胞核β-catenin積累；BIBO3304抑制［Leu31，Pro34］-NPY誘導的細胞核β-catenin表達。β-catenin轉錄激活的特異性抑制劑ICG001顯著緩解［Leu31，Pro34］-NPY誘導的心肌細胞肥大和細胞活力下降。

NPY 是心肌組織中含量最豐富的神經肽類激素，參與多種心血管疾病如高血壓、應激性心肌病、糖尿病性心肌病等的發生發展［9-10］。在生理或病理狀態下，機體交感神經興奮增強使得神經末梢NPY分泌和釋放增加，血清NPY 水平顯著升高，進一步可促進血管收縮和心肌重構。此外，心肌內皮細胞、血小板、巨噬細胞等也可以合成和釋放NPY。一般認為，NPY在心肌組織中可發揮短時和長時兩種效應。短時效應是NPY調節鈣離子信號，影響心肌細胞興奮收縮偶聯；長時效應則是NPY作為一種細胞因子，調節心肌細胞肥大和凋亡等。前期研究發現，多種心血管疾病發生時血清和心肌組織中NPY水平均顯著增加。在體外培養的心肌細胞中，H2O2可直接誘導細胞內NPY表達增加，下調心肌細胞中NPY表達，顯著緩解氧化應激導致的心肌細胞凋亡［5］。本研究通過皮下注射ISO構建小鼠心肌損傷模型，14 d 后發現心肌組織NPY mRNA 和蛋白的表達顯著上升，提示在β腎上腺素受體持續激活誘導的心肌損傷過程中，NPY 的表達同樣增加，與之前的研究結果一致。

NPY通過與細胞表面的Y受體特異性結合發揮生物學效應。NPY 及其受體的遺傳多態性與心血管疾病的發病發展具有顯著相關性［11-12］。然而關于NPY 在心肌組織中的功能目前仍存在較大爭議。研究發現，血清NPY 水平與患者心肌肥厚程度呈正相關，是影響心力衰竭患者1 年生存率的獨立因素［13-14］；NPY 敲除后，心肌缺血導致的心肌功能障礙、細胞凋亡等可有效緩解［5］，提示NPY/Y受體介導了心肌肥大、細胞損傷和心肌功能障礙的發生發展。然而也有研究認為NPY 增強巨噬細胞p62/SQSTM1依賴性自噬和核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，NRF2）介導的抗氧化信號通路［15］。此外NPY促進血管生成、減輕小鼠急性心梗后的心肌重塑、抑制心肌炎癥和纖維化［6］，提示NPY 可能對心肌損傷有抑制作用。因此深入探討心肌組織中NPY/Y 受體信號轉導對心血管疾病的預防和精準診療具有重要意義。

目前已發現8 種亞型的NPY 作用受體，除了受體Y3外，其余亞型的受體均為G蛋白偶聯受體。激活不同亞型的受體可以產生不同的生物學效應。Y1 受體是心肌細胞表達的主要亞型。短時效應方面，Y1受體激活后增加心肌細胞的正性收縮。阻斷抑制NPY/Y1受體信號轉導被認為是β受體阻滯劑治療室性心律失常的一種有效輔助方式［16］。長時效應方面，NPY通過Y1受體可促進內皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖和遷移［17］。在高血壓大鼠模型中，心肌組織Y1受體mRNA和蛋白表達增加，參與調節心肌細胞的能量生成。NPY/Y1 受體信號轉導還介導了血管收縮效應和肺高血壓［9，18］。本研究發現Y1受體特異性拮抗劑BIBO3304有效緩解了ISO誘導的小鼠心肌細胞排列紊亂、心肌纖維化及心肌肥大基因表達，提示NPY/Y1受體介導了ISO誘導的小鼠心肌損傷。此外，Y1 受體特異性的激活劑［Leu31，Pro34］-NPY 刺激H9C2 細胞后，小鼠心肌細胞肥大基因ANP、β-MHC mRNA 表達增加，細胞面積增大，細胞活力顯著下降，進一步證實了NPY/Y1 受體信號轉導對心肌細胞具有直接損傷效應。

β-catenin是經典Wnt信號通路的關鍵下游效應因子，參與心肌肥大、纖維化、心衰等多個過程的調節［19-20］。當Wnt 信號通路激活后，GSK3β自身磷酸化水平增加，抑制GSK3β對β-catenin 的磷酸化降解，最終導致細胞質內游離β-catenin 蛋白表達增加，β-catenin 轉入細胞核，作為核轉錄輔因子調節下游靶基因的表達。GSK3β活性降低或GSK3β缺陷型的小鼠心臟細胞分裂紊亂，可導致擴張性心肌病的發生［21］。此外，在心肌肥厚的大鼠心臟和腎臟中均發現了Wnt/β-catenin 信號通路的激活，而阻斷該信號通路可有效改善這兩個組織的損傷［22］。本研究中在ISO組小鼠心肌組織和［Leu31，Pro34］-NPY處理的H9C2 細胞中均發現了p-GSK3 β 和activeβ-catenin 的高表達；BIBO3304 可抑制ISO 誘導的β-catenin 信號通路的激活；BIBO3304 抑制［Leu31，Pro34］-NPY 誘導的β-catenin 入核；ICG001 有效改善［Leu31，Pro34］-NPY 誘導的心肌細胞肥大和細胞活力下降，提示NPY/Y1 受體信號轉導可能通過β-catenin 信號通路介導了心肌細胞損傷和纖維化。前期研究發現，在壓力超負荷引起的小鼠心肌肥厚模型中，心肌組織Wnt配體Wnt1、Wnt3a表達增加，同時β-catenin 水平上調，與心肌損傷和纖維化程度一致［22］。在心肌肥大和損傷過程中，高表達的NPY是否通過調節心肌細胞中Wnt配體的表達亞型和表達水平影響GSK3β的磷酸化狀態，導致Wnt 信號通路激活，尚需進一步研究。

綜上所述，本研究認為在β腎上腺素受體持續激活誘導的心肌損傷過程中，NPY 合成和釋放增加，其通過與Y1 受體結合激活β-catenin 信號通路；增加的β-catenin 轉入細胞核，調節下游靶基因的表達，介導了心肌細胞損傷和纖維化（圖7）。本研究只觀察了NPY/Y1受體信號轉導對心肌細胞中經典Wnt 信號通路核心因子β-catenin 表達的影響，后續研究將基于NPY/Y1信號轉導影響β-catenin 的機制做進一步探討，以期為以NPY為靶點的心血管疾病的精準預防和臨床診療提供理論依據。

圖7 神經肽Y/Y1受體激活β-catenin信號通路介導心肌細胞損傷Figure 7 NPY/Y1 receptor activiation mediates cardiomyocyte injury through β -catenin signaling pathway